En Hydrogel Construct og Fibrin-baserede Lim tilgang til levere Therapeutics i en murin myokardieinfarkt Model.

Introduction

En myokardieinfarkt (MI) er defineret som afbrydelse af blod til et område af hjertet forårsaget af okklusion af en stor kranspulsåre. Den skader som følge af en MI skyldes ombygning af levedygtige hjertevæv til ikke-funktionel arvæv, som nedsætter hjertets evne eller mere specifikt, den venstre ventrikel, viste ordentligt. Dette resulterer i et fald i mængden af blod, der kan leveres til kroppen med hvert hjerteslag, kendt som slagvolumen, og procentdelen af blod, der pumpes ud af hjertet med hvert hjerteslag, kendt som uddrivningsfraktion ^6. Disse, sammen med andre formindskede funktioner, øger belastningen på resten af ​​hjertet til at opretholde tilstrækkelig funktion. Ofte kan denne forøgede belastning blive så alvorlig, at det forårsager en anden hjerteanfald, et fænomen ses hos ca. 10% af personer ^7.

Mens lægepraksis har udviklet sig til at behandleumiddelbart efter en MI er ingen teknik er udviklet til at standse, langsom, eller vende de negative bivirkninger af væv remodellering. Stamceller er dukket op som en mulig vej for en sådan behandling, men på trods af deres lovende potentiale, stamceller har ikke vist succes i kliniske omgivelser. En teori for deres mangler er den manglende evne til at sikre de gavnlige celler forbliver på stedet for infarkt længe nok til at frembringe gunstige resultater ^5. Det er blevet vist, at ikke mere end 24% af celler, der simpelthen injiceres i stedet for infarkt overlevede og forblev på det beskadigede site 1 dag efter levering ^2. En mulig udsigt til at behandle dette spørgsmål om celle tilbageholdelse er at udvikle biokompatible hydrogel-systemer, der indkapsler enten celler eller lægemidler, som kan leveres til den skadede lokalitet. Hydrogelen ifølge valg i denne protokol er et poly (ethylenglycol) dimethacrylat grund af sin tidligere anvendelse i celleindkapsling procedures imidlertid enhver hydrogel stand til indkapsling kan anvendes ^8. Leveringen af ​​plasteret direkte til læsionsstedet sikrer celle-til-væv kontakt over en længere tidsperiode, forøgelse af længden af ​​tid cellerne kan tilvejebringe fordelagtige faktorer til den underliggende myokardiet.

En flaskehals til plasteret fremgangsmåde er vanskeligheden ved at klæbe lappen til hjertet overflade. Mange grupper har overvundet dette gennem en række forskellige teknikker, den mest fremherskende være en simpel sutur at binde konstruktionen til hjertet overflade ^9,10. Dette har vist sig vellykket i en række tilfælde, hvor konstruktionen er fremstillet af et stivere materiale, men mislykkes, når forsøges på en hydrogel-system, på grund af den høje koncentration vand og delikat karakter af plasteret konstruktionen. For at overvinde dette, har vi udnyttet en fibrinklæber eksternt adhæsivt system, der efterligner kemien af ​​koageldannelse. Fibrinklæber har været anvendt i talrige medicinske operationer, including dura tårer, bronchiale fistler og hornhinde transplantation, fremhæver biokompatibilitet af produktet som et sår fugemasse ^11-13. Derudover har fibrin været anvendt i en række forskellige hjertelidelser formål, herunder kirurgisk behandling af venstre ventrikel bristninger og koronar bypassoperationer imidlertid dens anvendelse som en vedhæftning lim til en hjerte-plaster ikke almindeligt anvendt ^14-17. En simpel formulering af thrombin og fibrinogen resulterer i en biokompatibel lim, der kan placeres direkte på ydersiden af ​​en ydre kardial plaster, indeholdt et acceptabelt vedhæftning for at sikre patch til hjerte interaktion.

Protocol

Procedure er i fuld kompatibilitet med IACUC protokol nummer 13302 og er blevet godkendt af opdelingen af ​​animalske ressourcer.

1. Instrument Forberedelse

1. Autoklaver alle ikke-engangs instrumenter forud for den kirurgiske procedure for at sikre sterilitet.
2. Sterilisere instrumenter, der anvendes flere gange i en session med en glaskugle sterilisator mellem anvendelser.

2. Hydrogel Forberedelse

1. Optø og plade stamceller mindst 24 timer forud for skabelsen af ​​hydrogelen konstruktionen.
2. Forbered patches en dag før det kirurgiske indgreb under anvendelse af en stereolitografisk apparat (eller lignende instrument), som er blevet beskrevet i detaljer i tidligere publikationer ^8,18.
3. At skabe hydrogelen, først generere en computer aided design (CAD) model af den ønskede plaster og eksportere design til stereolitografiske format (STL).
4. Opret en præ-gel løsning ved dissolving poly (ethylenglycol) dimethacrylat (PEGDMA) i steril 1 x PBS til opnåelse af en 20% vægt / volumen opløsning. Samtidig opløse fotoinitiatoren 1- [4- (2-hydroxy ethoxy) phenyl] -2-hydroxy-2-methyl-1-propan-1-on i DMSO. Tilføj fotoinitiatoren til PEGDMA opløsning ved en endelig vægt / volumen på 0,5%. Umiddelbart før tværbinding, tilsættes 100 ml af den ønskede densitet af celler. Bemærk: En celledensitet celler / ml anbefales mellem 2,0 x 10 ⁵ -2.0 x 10 ^6.
5. Pipettere prægelen opløsning i en skål ved midten af ​​SLA-platformen og køre SLA software med den tidligere uploadet STL formateret design.
6. Fjerne pletter fra apparatet og inkuber hydrogelerne O / N i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin at tillade celler at justere til miljøet i plasteret.

3. Animal Forberedelse og Oral intubatipå

1. Vurdere hver mus forud for proceduren for at sikre, at dyret er ved godt helbred, som bestemt ud fra deres grooming vaner og samspil med deres bur hjælpere. Bemærk: Kvinde 8-10 uger gamle C57BL / 6J mus blev anvendt til denne procedure kan imidlertid anvendes enhver muse alder eller type.
2. Placer dyr i et bedøvelsesmiddel kammer og udsættes for 5% isofluoran med en 1 l / min O ₂ support. Overvåge niveauet af anæstesi ved tå knivspids refleks.
3. Når dyret er korrekt bedøvet, vejer og placere dem på intubation standen.
4. Lede en lyskilde mod dyrets brysthulen og bruge pincet til at trække larynx overflade og udsætte stemmebåndene. Før forsigtigt en 20 G angiokateter mellem stemmebåndene, og gnidningsløst indsætte i luftrøret. Detektere korrekt indsætning ved en mekanisk bevægelse af brysthulen, når kateteret er forbundet til små dyr ventilatoren.
5. Justere indstillinger ventilation til the vægt af dyret baseret på producentens retningslinjer.
6. Når intuberet, placere dyret i liggende position på en varmepude til at forhindre hypotermi. Sørg for, at varmepuden ikke overstiger 40 ° C. Hvis det er nødvendigt, anbringes en barriere mellem dyret og varmepude for at minimere risikoen for forbrændinger.
7. Fjerne hår fra operationsstedet ved brug af et hårfjerningsmiddel. Sterilisere stedet med 3 skiftende scrubs af betadin og 75% ethanol for at sikre korrekt sterilisering. Placer en drapere at udsætte bare operationsstedet, og læg dyrlæge salve på øjnene for at forhindre tørhed under proceduren.

4. Kirurgisk Procedure

1. Den torakotomi på venstre side af dyret derfor gør en hud incision ca. 1 cm til venstre for brystbenet, der løber langs brystbenet.
2. Brug pincet til at adskille musklen lag fra det underliggende brystkassen i to trin. Observere en Delineating linje, som repræsenterer pectoralis store muskler på dyret. Løft denne muskel lidt, adskille den fra den underliggende udvendige skrå muskler og trække medialt. Derefter befri eksterne skrå muskel fra den underliggende brystkassen på samme måde, og trækkes tilbage sideværts, hvilket giver en ikke-tildækket visning af den anden, tredje og fjerde ribben.
3. Udfør torakotomi mellem tredje og fjerde ribben. Løft forsigtigt fjerde ribben og bruge en cauterizer til at åbne brysthulen mellem tredje og fjerde ribben. Placer retraktorer til yderligere at åbne hulrummet og eksponere hjertet.
4. Brug pincet til at sprænge den tynde hjertesækken af ​​hjertet.
5. Ligere venstre kranspulsåre med en 8-0 monofilament nylon sutur. Placer suturen ca. 4 mm fra spidsen af ​​hjertet, lige under den nederste spids af det venstre atrium. Bestemme ordentlig sutur anbringelse ved blanchering af det ventrikulære myocardium og en stigning i størrelsen af ​​det venstre atrium efter Sutu'enre er blevet bundet.

5. Patch Placering og lim

1. Holde patches ved 37 ° C og 5% CO ₂ betingelser indtil anvendelse.
2. Løft forsigtigt plasteret med en flad endte spatel og forsigtigt placere den på hjertets overflade, på det sted, infarkt.
   Bemærk: For at undgå at glide væk fra den venstre ventrikel, kan plasteret holdes på plads ved let at opretholde kontakt ved hjælp af enten spatel eller spidsen af ​​en pincet.
3. Forberede limen ved blanding af en 4: 1-forhold af fibrinogen til thrombin. Bland opløsningen ved gentagen pipettering indtil det begynder at blive tykkere, sædvanligvis inden for 1 min efter starten af ​​præparatet.
4. Når opløsningsviskositet når det ønskede niveau, hurtigt overføre ca. 10 ml til plasteret overflade. Bemærk: koagulationstid af fibrinklæber er hurtig, hvilket giver en lille vindue af muligheder for effektiv overførsel af limen.

6. suturering

1. Luk ribben lag med 3-4 individuelle afbrudte suturer.
2. Før fuld lukning af interkostale lag, indsætte en PE-10 kanyle ind i indsnittet for at evakuere brysthulen efter lukningen er færdig, og reetablere ordentlig intrapleural pres.
3. Luk brystfinner muskler med 3-4 individuelle afbrudte suturer.
4. Forsegl hudlag med en kontinuert sutur.
5. Efter fuldstændig lukning, vedhæfte en 1,0 ml sprøjte til slutningen af ​​kanylen og bruge det til at evakuere brysthulen.
6. Påfør et væv klæbemiddel på incisionssted at styrke suturstedet.

7. Post-kirurgisk behandling

1. Giv mus en injektion af buprenorphin (0,05-1,0 mg / kg) og carprofen (2,2 mg / kg) subkutant umiddelbart efter koronar ligering og mindst 20 minutter før genoplivning. Administrere begge lægemidler 6-8 timer efter operationen, Og derefter give to gange dagligt i op til tre dage for at kontrollere smerte og lidelse.
2. Løbende overvåge dyrene indtil bevidst og hver time for de første 4 timer efter operationen. Udfør en anden helbredsundersøgelse natten til operationen (2-4 timer senere) til at administrere en anden dosis af smertestillende.
3. Overvåg dyrene dagligt efter den anden dag efter proceduren og indtil dyr er stabil.

8. Analyse af hjertefunktion og Histologi

1. Udfør ekkokardiografier på mus 4 uger efter den procedure for at fastslå omfanget af skader efter MI.
2. Bedøver mus med 4-5% isofluran i en anæstesi kammer til induktion af indånding anæstesi, og derefter 2% isofluran via ansigtsmaske til vedligeholdelse af anæstesi.
3. Ryd imaging område med en rigtige spørgsmål fløde og bruge et lille dyr ultralyd for at opnå en 2D M-mode ekkokardiografi scanning af det bankende hjerte og registrere den funktionelle parametre assoknyttede med det.
4. Aflive musene i en carbondioxid kammer, samles de hjerter fra dyrene og sted i en 10% formalinopløsning i 24 timer. Efter 24 timer, overføres hjerter til 70% ethanol og holde ved 4 ° C indtil vævsbehandling.
5. Behandle hjerter og integrere dem i paraffinblokke.
6. Skær 5 mm snit gennem den ventrikulære region af hjertet, begyndende ved toppunktet og slutter ved atrium.
7. Stain sektioneret skiver med både Massons trichrom og hæmatoxylin og eosin pletten anvendelse af standardprotokoller.

Representative Results

Under den kirurgiske procedure, kan ligering af venstre koronararterie identificeres ved en markant blanchering nedstrøms for den okkluderede arterie. Som en test, før binde knude, kan sutur strammes kortvarigt at kontrollere, om det er i det rigtige sted. Derudover, da okklusion af arterien resulterer i næsten øjeblikkelig fald i evnen af ​​det venstre atrium til korrekt beat, vil den venstre atrium større som svar på en tilbagestrømning af blod i systemet.

M-mode ekkokardiografi målinger tages så tidligt som 2 dage efter infarkt viser en indstilling af venstre væg bevægelse, indikativ for muskel genopbygning. Kvalitative beregninger foretaget ud fra dataene viser et fald i uddrivningsfraktion og slagvolumen i infarkt hjerter. Ved afslutningen af ​​forsøget, når hjerterne indsamles til histologiske formål, kan en klar dilatation af venstre ventrikel ses, sammen med en udtynding af venstre ventrikelvæg, og aflejring af kollagen, der betegner arvæv aflejring i stedet for fungerende cardiomyocytter (figur 1).

Også set ved histologisk analyse er tilstedeværelsen af hydrogelen konstruere takket være administrationen af fibrin gel (figur 2). Til vores formål, skal klæbemiddelsystemet være tyktflydende nok til at tillade præcise placering kontrollere og minimere efterfølgende afstrømning til omkringliggende organer, men plastisk nok til ikke at forstyrre hjertefunktionen. Indledende tests blev udført for at beregne viskositet, geleringstiden, og stivhed af forskellige fibrinogen / thrombin-forhold, for at bestemme den rette kombination, der passer vores behov. In vivo-analyse blev udført for at teste evnen af fibrinklæber til at opretholde patch- til-vævsadhæsion mens det stadig tillader fuld hjertefunktion (data ikke vist). Det skal bemærkes, at fibrinklæber ikke skade myocardium, som det ses af lack af vævsombygning eller ventrikulær udtynding på stedet (figur 2). Kardiomyocytterne forbliver intakte trods tilsætningen af ​​både en hjerte plaster og det ledsagende lim. Derudover levedygtighed test bekræftede, at administrationen af fibrinklæber til den ydre overflade af en celle-indkapslende hydrogelplaster ikke påvirkede celleoverlevelse i plasteret (figur 3).

Figur 1:. Venstre kranspulsåreombinding Resultater i et fald i hjertefunktionen målt ved ekkokardiografi M-mode ekkokardiografi af sunde (a) og infarkt (b) hjerter. Infarkt hjerter viser en klar mangel på væg bevægelse hvor levedygtigt væv er blevet erstattet med arvæv. Dette korrelerer med en målelig nedgang i venstre ventrikels uddrivningsfraktion (EF), hjerte slagtilfældevolumen (SV), og minutvolumen (CO). Histologisk analyse af sunde (c) og infarkt (d) hjerter viser dilatation af venstre hjertekammer og udtynding af venstre ventrikel væg infarktramte myocardium, begge tegn på vævsombygning og arvæv deposition. Histologiske billeder er tværsnit skiver indfange venstre (større kammer) og højre (mindre kammer) ventrikler.

Figur 2:. Anvendelse af fibrin Flue Sikrer Patch Adhæsion til hjertet Plasteret anbringes på overfladen af hjertet, mens brysthulen er eksponeret gennem proceduren (a). Når den er placeret, tilsættes en fibrin-baseret lim på toppen af ​​hjertet og får lov at tørre. Plasteret kan tydeligt ses på histologiske snit af hjertevæv, der blev indsamlet efter 1 uge post-procedure (b).Dissociation af plasteret fra hjertet overflade i histologiske billeder er en artefakt af indsamlingen og sektionering proces. Resultater er konsistente i op til 8 uger af adhæsion.

Figur 3: Fibrin-baserede Lim skader ikke indkapslede væv Cellelevedygtighed blev målt via MTT-analyse 1 uge efter administration af en fibrin-lim under anvendelse protokollerne beskrevet i detaljer i tidligere publikationer ^8.. Levedygtigheden af ​​celler i plasteret blev ikke påvirket af tilsætningen af ​​lim til overfladen af ​​konstruktionen.

Discussion

Med denne tilgang til den murine MI model, har vi udviklet et system, der minimerer skade på ikke-myokardiet områder, der er forbundet med andre murine MI teknikker. Disse områder omfatter skader forårsaget af en trakeostomi, skæringen af ​​muskulære lag og brud på ribberne at blotlægge brysthulen. Vi mener, at disse ændringer forbedrer de samlede kirurgiske outcome takket være draget omsorg for at bevare så meget af de store strukturer, herunder ribben og muskellag, intakt under den kirurgiske procedure.

Det skal bemærkes, at der er nogle begrænsninger for denne teknik, med de største er dens tidskrævende natur, hvilket resulterer i kun 8-10 fulde kirurgiske procedurer på én dag. For at overvinde dette kan en anden ventilator anvendes, giver mulighed for den procedure, der skal udføres på to dyr samtidigt. Derudover større kar, såsom den interkostale fartøjer oginterior thorax arterie, bør undgås, når udfører torakotomi. Hvis nær en af ​​disse fartøjer bør en cauterizer anvendes til at forebygge blødninger ud på grund af en bristet arterie.

Fibrinklæber er kendt i både laboratorie- og kliniske indstillinger takket være dens evne til hurtigt at støtte i koageldannelse, samt dets potentiale til at levere og vært MSC ^14-17,19. Til vores formål fibrinlim tjente som en biokompatibel tilgang til klæbning af en vandbaseret hydrogel konstruere til overfladen af ​​hjertet. Anvendelsen af ​​en fibrin-lim er lykkedes med at holde hydrogelen konstruktionen på det beskadigede sted i op til 8 uger, med mulighed for vævs- kontakt af en længere tid. Brugen af ​​denne adhæsion systemet tillod kontrol til placering af den fine konstruktion uden behov for yderligere suturer, der skader myokardiet samt konstruktionen selv. Vi har fundet, at limen i sig selv er ikke-toksiske for den indkapslede celler ennd ikke negativ indflydelse det underliggende væv. Hydrogelen og fibrin-baseret lim systemet kan anvendes til en række andre væv engineering formål, der ønsker celle eller terapeutisk kontakt i længere tidsrum. Desuden vil der med anvendelsen af SLA fabrikationsmetode, mønstre og strukturer kan inkorporeres i plasteret for at skabe et mere kompliceret system til celle levering ^18.

Et tilbageslag for anvendelsen af ​​fibrin-lim er det faktum, at mere end én forsker skal være til stede i det kirurgiske værelse under patch placering og lim tilføjelse. Det er en opgave for den første forsker til at sikre, at plasteret forbliver på plads, og ikke fare vild i brysthulen, mens den anden forsker blander løsningen og anvender det på plasteret efter korrekt viskositet er nået. For at optimere timingen af ​​limen levering, foreslås det, at den anden forsker også tester og gange geleringen af ​​limen før patch placering,eftersom korrekt gelering af limen er kritisk for patch vedhæftning.

Der er en række kritiske trin og risiko for fejl områder i protokollen, med den første er induktionen af ​​myocardieinfarkt. Det er bydende nødvendigt at kontrollere for tegn, såsom blegning af den venstre ventrikulære væg og udvidelsen af ​​det venstre atrium, for at sikre okklusion af den venstre koronararterie. Dette kan gøres før tilsætningen af ​​sømmen ved blot at krydse og stramme ende af suturen strenge. Hvis det bestemmes, at den venstre koronararterie ikke er omsluttet af suturen, kan strengen tages ud og re-anvendelse. En anden kritisk foranstaltning er at fortsætte med at overvåge intubation rør hele proceduren, for at sikre, at det forbliver inden for luftrøret og ikke bliver trukket ud midt kirurgi. Endelig, i hele operationen, alle forsøg bør gøres for at undgå kontakt med lungerne, som enhver kontakt har potentiale til at føre til en sammenklappet lunge.Hvis der under operationen, lunge kollaps sker, blot blokere udstrømningen rør i intubator i op til 3 sek i et forsøg på at re-oppuste urolige regioner af lungerne.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Harvard Model 687 Mouse Ventilator	Harvard Apparatus	55-0001
Inintech Biosciences LLC Dry Glass Bead Sterilizer	Fisher Scientific	NC9531961
Leica MZ6 surgical microscope	Leica
Cautery Kit	Gemini	GEM 5917
Delicate Forceps - 0.4 mm Tips Angled	Fine Science Tools	11063-07
Agricola Retractor - 3.5 cm Spread	Fine Science Tools	17005-04
Spring Scissors - 2.5 mm Blades Straight	Fine Science Tools	15000-08
Castroviejo Needle Holder - w/Lock Tungsten Carbide 14 cm	Fine Science Tools	12565-14
Iris Scissors - Delicate Straight 10.5 cm	Fine Science Tools	14060-10
8-0 monofilament suture	Ethicon	8730P
6-0 Silk suture	Ethicon	639G
Thrombin	Sigma	T7009
Fibrinogen	Sigma	F3879
Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469SB