En Hydrogel Konstruer og fibrin basert lim tilnærming til å levere Therapeutics i en Murint hjerteinfarkt Model.

Introduction

En hjerteinfarkt (MI) er definert som den avbrudd av blod til en region av hjertet forårsaket av okklusjon av en større koronararterie. Den skade som følge av en MI skyldes ombygging av levedyktig hjertevevet inn i ikke-funksjonell arr vev, noe som reduserer muligheten av hjerte eller, mer spesifikt, venstre ventrikkel, for å slå på riktig måte. Dette resulterer i en reduksjon i volumet av blod som kan leveres til kroppen med hvert hjerteslag, kjent som slagvolumet, og prosentandelen av blod som pumpes ut av hjertet med hvert hjerteslag, kjent som ejeksjonsfraksjon ^6. Disse, sammen med andre funksjoner redusert, øker belastningen på resten av hjertet for å opprettholde tilfredsstillende funksjon. Ofte kan denne økte belastningen bli så alvorlig at det fører til en andre hjerteinfarkt, et fenomen som sees hos omtrent 10% av individer ^7.

Mens medisinsk praksis har utviklet seg til å behandlekjølvannet av en MI har ingen teknikk er utviklet for å stanse, langsom eller reversere de negative bivirkninger av vev remodeling. Stamcelleterapi har dukket opp som en mulig vei for en slik behandling, men til tross for deres lovende potensial, stamceller har ikke vist seg vellykket i klinisk setting. En teori for sine mangler er manglende evne til å sikre de gode cellene forblir på stedet av infarkt lenge nok til å generere gode resultater ^5. Det har vist seg at ikke mer enn 24% av celler som er rett og slett injisert inn i området av infarkt overlevde og holdt seg på det skadede området 1 dag etter levering ^2. En mulig utsiktene for å ta opp dette spørsmålet om cellen oppbevaring er å utvikle biokompatible hydrogel systemer som innkapsler enten celler eller terapi, som kan leveres til det skadede området. Den hydrogel av valget i denne protokollen er en poly (etylenglykol) dimetakrylat på grunn av sin tidligere anvendelse i celle pr innkapslingocedures imidlertid noe hydrogel er i stand til innkapsling kan benyttes, ^8. Leveringen av plasteret direkte til skadestedet sikrer celle-til-vev kontakt over en lengre periode, noe som øker lengden av tiden cellene kan gi fordelaktige faktorer som til det underliggende hjertemuskelen.

En flaskehals til lappen metode er vanskeligheten med å feste plasteret til hjertet overflaten. Mange grupper har overvunnet dette ved en rekke teknikker, de mest utbredte være en enkel sutur for å binde konstruksjonen til hjertet overflaten ^9,10. Dette har vist seg vellykket i en rekke tilfeller, hvor konstruksjonen er laget av et stivere materiale, men mislykkes når forsøkes på en hydrogel system, på grunn av det høye vannkonsentrasjonen og skjøre natur plasteret konstruksjonen. For å overvinne dette har vi benyttet et fibrinlim ytre klebemiddelsystem som gjen kjemien av levringsdannelse. Fibrinlim har vært brukt i en rekke medisinske operasjoner, IncLuding dura tårer, bronkial fistler, og hornhinnetransplantasjon, fremhever biokompatibilitet av produktet som et sår tetningsmasse ^11-13. I tillegg har fibrin vært brukt i en rekke hjerte formål, blant annet kirurgisk behandling av venstre ventrikkel brudd og hjerte bypass operasjoner, derimot, er dens bruk som en vedheft lim for en hjerte patch ikke brukte ^14-17. En enkel formulering av trombin og fibrinogen resulterer i et biokompatibelt lim som kan plasseres direkte på utsiden av en ekstern hjerte lapp, som gir et levedyktig system for å sikre adhesjon til plaster hjerte interaksjon.

Protocol

Prosedyren er i full kompatibilitet med IACUC protokollnummer 13302 og har blitt godkjent av delingen av dyre ressurser.

1. Instrument Forberedelse

1. Autoklav alle flergangs instrumenter som brukes før den kirurgiske prosedyren for å sikre sterilitet.
2. Sterilisere instrumenter som brukes flere ganger i en sesjon med et glass perle sterilisator mellom bruker.

2. Hydrogel Forberedelse

1. Tine og plate stamceller minst 24 timer før etableringen av hydrogel konstruksjonen.
2. Forbered lapper en dag før den kirurgiske prosedyren med en stereolithography apparat (eller lignende instrument) som har blitt beskrevet i detalj i tidligere publikasjoner ^8,18.
3. For å opprette hydrogel, først generere en dataassistert konstruksjon (DAK) modell av den ønskede oppdateringen og eksportere design til stereolithographic format (STL).
4. Lag en pre-gel løsning ved dissolving poly (etylenglykol) dimetakrylat (PEGDMA) i steril 1 x PBS for å oppnå en 20% vekt / volum løsning. Samtidig oppløse fotoinitiator 1- [4- (2-hydroksy- etoksy) -fenyl] -2-hydroksy-2-metyl-1-propan-1-on i DMSO. Tilsett fotoinitiator til PEGDMA oppløsningen til en slutt vekt / volum av 0,5%. Rett før tverrbinding, tilsett 100 ml av den ønskede tetthet av celler. Merk: en celletetthet på mellom 2,0 x 10 ⁵ -2,0 x 10 ⁶ celler / ml.
5. Pipetter pre-gel-løsning over i en form ved midten av plattformen SLA og kjøre SLA programvare med den tidligere opplastet STL formatert design.
6. Fjern de flekker fra apparatet og inkuber hydrogeler O / N i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 5% føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin å tillate celler å justere til miljøet i oppdateringen.

3. Animal Forberedelse og Oral intubatipå

1. Evaluere hver mus før prosedyren for å sikre at dyret er i god helse, som bestemmes fra sine grooming vaner og samhandling med sine bur kamerater. Merk: Kvinne 8-10 uker gamle C57BL / 6J mus ble benyttet for denne fremgangsmåten, men en hvilken som helst muse alder eller type kan anvendes.
2. Plassere dyr i en bedøvelse kammer og utsettes for 5% isofluorane med en 1 L / min O _2-støtte. Overvåke nivået av anestesi ved tå klype refleks.
3. Når dyret er skikkelig bedøvet, veier og plasser dem på intubasjon stand.
4. Dirigere en lyskilde mot dyrets brysthulen og bruke tang for å trekke strupe overflaten og avsløre stemmebåndene. Veilede nøye en 20 G angiocath mellom stemmebåndene, og jevnt sette inn i luftrøret. Detektere riktig innsetting av en mekanisk bevegelse av brysthulen en gang kateteret er forbundet med små dyr ventilator.
5. Juster ventilasjonsinnstillinger til the vekten av dyret basert på produsentens retningslinjer.
6. Når intubert, plasserer dyret i liggende stilling på en varmepute for å hindre nedkjøling. Sørg for at varmeputen ikke overstiger 40 ° C. Hvis det er nødvendig, plassere en barriere mellom dyr og varmeputen for å minimere sjansen for brannskader.
7. Fjerne hår fra operasjonsstedet ved bruk av det riktige fløte. Steriliser nettstedet ved tre vekslende skrubb av Betadine og 75% etanol for å sikre riktig sterilisering. Plasser en drape å avsløre akkurat den kirurgiske området, og plassere veterinæren salve på øynene for å hindre tørrhet under prosedyren.

4. Kirurgisk prosedyre

1. Den thoraktomi ble utført på venstre side av dyret, og derfor gjøre et snitt i huden omkring 1 cm til venstre for sternum, som kjører lengden av sternum.
2. Bruk pinsett for å skille muskelen laget fra den underliggende brystkasse i to trinn. Observere en Delinegen linje som representerer pectoralis major musklene i dyret. Løft denne muskelen litt, skiller den fra den underliggende ytre skrå muskler og trekke medialt. Deretter, fri ytre skrå muskler fra den underliggende brystkasse på samme måte, og trekke tilbake sideveis, noe som gir en unobscured riss av den andre, tredje, og fjerde ribber.
3. Utfør Thoracotomi mellom tredje og fjerde ribben. Løft forsiktig fjerde ribben og bruke en cauterizer å åpne brysthulen mellom tredje og fjerde ribben. Plasser haker å ytterligere åpne hulrom og avsløre hjertet.
4. Bruk pinsett til å rive opp den tynne perikard av hjertet.
5. Ligate venstre koronararterie med 8-0 monofilament nylon sutur. Plasser suturen omtrent 4 mm fra spissen av hjerte, rett under den nedre spiss av venstre atrium. Bestemme riktig sutur plassering av en blanche av den ventrikulære myokardium og en økning i størrelsen av venstre forkammer etter Suture har blitt bundet.

5. Patch Plassering og lim

1. Hold patcher ved 37 ° C og 5% CO ₂ forhold til bruk.
2. Løft forsiktig lapp med en flat ended slikkepott og forsiktig plassere den på overflaten av hjertet, på stedet av infarkt.
   Merk: For å hindre at du sklir av venstre hjertekammer, kan lappen holdes på plass av lett å opprettholde kontakt med enten spatel eller tuppen av en pinsett.
3. Forberede limet ved å blande et 4: 1 forhold av fibrinogen til trombin. Bland løsningen ved gjentatt pipettering til den begynner å bli tykkere, vanligvis i løpet av ett minutt etter begynnelsen av blandingen.
4. Når løsningen viskositeten har nådd ønsket nivå, raskt overføre omtrent 10 ml til plasteret overflaten. Merk: koagulasjonstid av fibrinlim er hurtig, noe som gir et lite vindu av muligheter for effektiv overføring av lim.

6. suturing

1. Lukk rib lag med tre-fire individuelle avbrutte suturer.
2. Før full nedleggelse av interkostale lag, sette inn en PE-10 kanyle i snittet for å evakuere brysthulen etter nedleggelsen er fullført og gjenopprette riktig intrapleural trykk.
3. Lukk brystmuskulaturen med tre-fire individuelle avbrutte suturer.
4. Forsegle hudens lag med en kontinuerlig sutur.
5. Etter full nedleggelse, feste en 1,0 ml sprøyte til enden av kanylen og bruke den til å evakuere brysthulen.
6. Påfør en vevlimet innsnitt området å forsterke sutur nettstedet.

7. Post-kirurgisk behandling

1. Gi mus en injeksjon av buprenorfin (0,05 til 1,0 mg / kg) og carprofen (2,2 mg / kg) subkutant umiddelbart etter koronar ligering og minst 20 min før tilbakevending. Administrere begge legemidlene 6-8 timer etter operasjonen, Og deretter gi to ganger daglig i opp til tre dager for å kontrollere smerte og nød.
2. Kontinuerlig overvåke dyrene inntil bevisst og hver time for første 4 timer etter operasjonen. Utfør en andre checkup natten av kirurgi (2-4 timer senere) å administrere en ny dose smertestillende.
3. Overvåk dyrene daglig etter den andre dagen etter prosedyren, inntil dyrene synes å være stabilt.

8. Analyse av hjertefunksjon og histologi

1. Utfør echocardiographs på mus fire uker etter inngrepet for å fastslå omfanget av skaden etter MI.
2. Anesthetize mus med 4-5% isofluran i en anestesi kammer for induksjon av inhalering anestesi, og deretter 2% isofluran via ansiktsmaske for vedlikehold anestesi.
3. Fjerne bildeområdet med en Hårfjerningskrem og bruke et lite dyr ultralyd for å få en 2D M-mode ekkokardiografi skanning av bankende hjerte og registrere den funksjonelle parametere assotet til det.
4. Avlive musene i en karbondioksyd kammer, og deretter samle hjerter fra dyrene og plasser i en 10% formalinløsning i 24 timer. Etter 24 timer overføres hjertene til 70% etanol og holde ved 4 ° C inntil vev prosessering.
5. Behandle hjertene og legge dem i parafinblokker.
6. Skjær 5 mm seksjoner gjennom den ventrikulære region av hjertet, som starter på toppen og slutter på atrium.
7. Stain seksjonert skiver med både Masson er Trichrome og hematoxylin og eosin flekken ved hjelp av standard protokoller.

Representative Results

I løpet av den kirurgiske prosedyren, kan ligering av den venstre koronararterien identifiseres ved en markert bleking nedstrøms for det okkluderte arterie. Som en test før knytte knuten, kan sutur strammes kort for å sjekke om det er på riktig sted. I tillegg, siden okklusjon av arterien resulterer i nesten øyeblikkelig reduksjon i evnen til venstre atrium til riktig slå, vil den venstre atrium stort format som reaksjon på en tilbakestrøm av blod i systemet.

M-mode ekkokardiografi målinger tatt så tidlig som to dager etter infarkt viser et opphør av venstre vegg bevegelse, en indikasjon på muskeloppbyggingen. Kvalitative beregninger foretatt ut fra dataene viser en nedgang i ejeksjonsfraksjon og slagvolumet i infarkt hjerter. Ved avslutning av forsøket, da hjertene blir samlet for histologisk formål, kan en tydelig utvidelse av venstre ventrikkel sees, sammen med en fortynning av det venstre ventrikulærevegg, og avsetning av kollagen som betegner arrvev deponering i stedet for å virke kardiomyocytter (figur 1).

Også sett ved histologisk analyse er tilstedeværelsen av hydrogelen konstruere takket være administrering av fibrin gel (figur 2). For vårt formål, må limsystemet være viskøs nok til å tillate nøyaktig plassering kontroll og minimalisere påfølgende avrenning inn i omkringliggende organer, men formbare nok til ikke å påvirke hjertefunksjonen. Innledende tester ble utført for å beregne viskositeten, geldannelsestiden og stivhet av ulike fibrinogen / trombin-forhold, for å finne den riktige kombinasjon som passer våre behov. In vivo-analyse ble utført for å teste evnen til å opprettholde fibrin-lim flekk- to-vevsadhesjon samtidig gir full hjertefunksjon (data ikke vist). Det bør bemerkes at fibrinlim ikke skade hjertemuskelen, som vist ved lack av vev ombygging eller ventrikkel tynning på stedet (figur 2). De cardiomyocytes forbli intakt til tross for tillegg av både en hjerte lapp og dens medfølgende lim. I tillegg bekreftet levedyktighet testing som at administreringen av fibrin lim til den ytre overflaten av en celle-innkapsling av hydrogel patch ikke påvirker celleoverlevelse i plasteret (figur 3).

Figur 1:. Venstre Coronary Artery Ligerings resulterer i en reduksjon i Cardiac funksjon målt ved Ekkokardiografi M-mode ekkokardiografi av sunne (a) og infarcted (b) hjerter. Infarcted hjerter viser en tydelig mangel på veggen bevegelse hvor levedyktig vev har blitt erstattet med arrvev. Dette samsvarer med en målbar reduksjon i venstre ventrikkel ejeksjonsfraksjon (EF), hjerte hjerneslagvolum (SV), og minuttvolum (CO). Histologisk analyse av sunn (c) og (d) infarkt hjerter viser utvidelse av venstre ventrikkel og tynning av det venstre ventrikulære veggen av infarkt myokard, begge tegn på vev-omforming og arrvev deponering. Histologiske bilder er snitt skiver fange venstre (større kammer) og høyre (mindre kammer) ventriklene.

Fig. 2: Anvendelse av fibrin Flue Sikrer Patch Adhesjon til hjertet Plasteret plasseres på overflaten av hjertet, mens brysthulen blir eksponert i løpet av prosedyren (a). Når plassert, er et fibrin-basert lim legges på toppen av hjertet og fikk tørke. Plasteret kan tydelig sees på histologiske snitt av hjertevevet som ble samlet inn på en uke etter prosedyren (b).Dissosiasjon av lappen fra hjertet overflaten i histologiske bilder er en gjenstand av samlingen og snitteprosessen. Resultatene er konsistente for opptil 8 uker med vedheft.

Figur 3: fibrin basert lim ikke skader Encapsulated Vev Celleviabilitet ble målt via MTT analyse 1 uke etter administrering av en fibrin basert lim bruker protokoller som er beskrevet i detalj i tidligere publikasjoner ^8.. Levedyktigheten av cellene i plasteret ble ikke påvirket ved tilsetning av lim på overflaten av konstruksjonen.

Discussion

Med denne tilnærming til murine MI modellen har vi utviklet et system som minimaliserer skade på ikke-myokard områder som er forbundet med andre murine MI teknikker. Disse områdene omfatter skade forårsaket av et trakeostomi, kutting av muskellaget, og brudd av ribbene for å eksponere brysthulen. Vi mener at disse endringene forbedre den generelle kirurgiske utfallet takk til omtanke for å beholde så mye av de store strukturene, inkludert ribbeina og muskellagene, intakt under den kirurgiske prosedyren.

Det bør bemerkes at det ikke er noen begrensninger i denne teknikk, med den største er det tidkrevende natur, noe som resulterer i bare 8-10 komp kirurgiske prosedyrer på en dag. For å overvinne dette, kan en annen ventilator brukes, noe som åpner for prosedyren som skal utføres på to dyr samtidig. I tillegg store fartøy, for eksempel interkostalrom fartøy ogInteriøret thorax arterie, bør unngås når du utfører Thoracotomi. Hvis i nærheten av disse fartøy bør en cauterizer brukes til å hindre blødning ut på grunn av et sprukket arterie.

Fibrinlim er kjent både i laboratorie- og kliniske innstillinger takket være sin evne til raskt å hjelpe til klumpdannelse, så vel som dens potensial for å levere og verts MSC ^14-17,19. For vårt formål tjente fibrinlim som et biokompatibelt tilnærming for å overholde en vannbasert hydrogel konstruere til overflaten av hjertet. Har vist seg bruken av en fibrin-basert lim lykkes med å holde hydrogelen konstruksjonen på det skadede stedet for opptil 8 uker, med mulighet for kontakt med vevet i en lengre tidsperiode. Bruken av denne klebe systemet tillates styring for plassering av den delikate konstruksjon uten behov for ytterligere suturer som skader på myokard, så vel som konstruksjonen i seg selv. Vi har funnet at limet i seg selv er ikke-giftig for det innkapslede celler ennd ikke negativt påvirke den underliggende vev. Den hydrogel og fibrin-basert gel-systemet kan anvendes på en rekke andre vev tekniske formål som ønsker celle eller terapeutisk kontakt for en lengre periode. Videre, med bruk av SLA fremstillingsmetode, utførelser og konstruksjoner kan innlemmes innenfor lappen for å skape et mer komplekst system for celle levering ^18.

En tilbakeslag til bruken av fibrin-basert gel er det faktum at mer enn én Forskeren må være til stede i rommet under kirurgisk plaster plassering og lim tilsetning. Det er jobben til den første forskeren til å sørge for at lappen er fortsatt på plass, og ikke gå seg vill i brysthulen, mens den andre forskeren blander løsningen og bruker den til lappen etter riktig viskositet er nådd. For å optimalisere tidsberegningen av limet levering, er det foreslått at den andre forskeren også tester og tider gelering av limet før patch plassering,siden riktig gelering av limet er kritisk for patch adhesjon.

Det finnes en rekke kritiske trinn og feilutsatte områder i protokollen, den første var induksjonen av hjerteinfarkt. Det er viktig å se etter tegn, slik som blanchering av venstre ventrikulære veggen og utvidelse av venstre atrium, for å sikre okklusjon av den venstre koronararterie. Dette kan gjøres før tilsetningen av sømmen ved ganske enkelt å krysse og stramme enden av suturen strenger. Dersom det fastslås at den venstre koronararterie ikke er omsluttet av suturen, kan strengen tas ut og settes på igjen. Et annet viktig mål er å fortsette å overvåke intubasjon røret under hele prosedyren, for å sikre at den forblir inne i luftrøret, og ikke blir trukket ut mid-kirurgi. Til slutt, i løpet av kirurgi, alle forsøk må gjøres for å unngå kontakt med lungene, som enhver kontakt har potensial til å føre til en kollapset lunge.Dersom, under operasjonen, lunge sammenfoldingsanordningene oppstår, bare blokkere utstrømningen røret til intubasjon i opp til 3 sekunder i et forsøk på å fylle på nytt problemfylte områder av lungene.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Harvard Model 687 Mouse Ventilator	Harvard Apparatus	55-0001
Inintech Biosciences LLC Dry Glass Bead Sterilizer	Fisher Scientific	NC9531961
Leica MZ6 surgical microscope	Leica
Cautery Kit	Gemini	GEM 5917
Delicate Forceps - 0.4 mm Tips Angled	Fine Science Tools	11063-07
Agricola Retractor - 3.5 cm Spread	Fine Science Tools	17005-04
Spring Scissors - 2.5 mm Blades Straight	Fine Science Tools	15000-08
Castroviejo Needle Holder - w/Lock Tungsten Carbide 14 cm	Fine Science Tools	12565-14
Iris Scissors - Delicate Straight 10.5 cm	Fine Science Tools	14060-10
8-0 monofilament suture	Ethicon	8730P
6-0 Silk suture	Ethicon	639G
Thrombin	Sigma	T7009
Fibrinogen	Sigma	F3879
Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469SB