Introduction
Инфаркта миокарда (ИМ) определяется как прерывание крови к области сердца, вызванные окклюзии крупной коронарной артерии. Ущерб от MI связано с ремоделирования жизнеспособного сердечной ткани в нефункциональной рубцовой ткани, что снижает способность сердца или, более конкретно, левый желудочек, чтобы правильно бить. Это приводит к уменьшению объема крови, который может быть доставлен к телу с каждым ударом сердца, известный как ударный объем, и процент крови, что перекачивается из сердца с каждым ударом сердца, известный как фракции выброса 6. Они, наряду с другими функциями уменьшилась, увеличивает нагрузку на остальной части сердца для поддержания адекватной функции. Часто это увеличение деформации может стать настолько сильным, что вызывает второй сердечный приступ, явление наблюдается примерно 10% лиц, 7.
В то время как медицинская практика превратилась для леченияСразу после ИМ, не метод не был разработан, чтобы остановить, медленно или обратить вспять негативные побочные эффекты ремоделирования ткани. Терапии стволовыми клетками появились в качестве возможного проспекте для такого лечения, однако, несмотря на их многообещающим потенциалом, стволовые клетки не доказали свою эффективность в клинических условиях. Одна теория для их недостатков является неспособность обеспечить благоприятные клетки остаются на месте инфаркта достаточно долго, чтобы произвести положительные результаты 5. Было показано, что не более чем 24% клеток, которые просто вводят в месте миокарда не выжила и осталась на поврежденный участок 1 день после доставки 2. Возможная перспектива для решения этого вопроса удержания клеток является разработка биосовместимых системы гидрогеля, которые инкапсулируют либо клетки или терапии, которые могут быть доставлены в поврежденном участке. Гидрогель выбора в данном протоколе является поли (этиленгликоль) диметакрилат из-за его использования в предыдущем клеток инкапсуляции прocedures, однако, любой гидрогель способен инкапсуляции могут быть использованы 8. Доставка пластыря непосредственно в месте повреждения обеспечивает клетки к ткани контакт в течение продолжительного периода времени, увеличивая длину времени клетки могут обеспечить полезные факторы к базовому миокарда.
Узким местом подхода является патч трудность соблюдения патч к поверхности сердца. Многие группы преодолеть это с помощью различных методов, наиболее распространенным является простой шов, чтобы связать конструкцию к сердечной поверхности 9,10. Это оказалось успешным в ряде случаев, в которых конструкция выполнена из жесткого материала, но терпит неудачу, когда пытались в системе гидрогеля, из-за высокой концентрации воды и тонкой природы коммутационной конструкции. Чтобы преодолеть это, мы использовали фибрин клей систему внешнего клей, который имитирует химию образования сгустка. Фибриновый клей был использован в многочисленных медицинских операций, IncЛУДИНГ Dura слезы, бронхиальных свищей и трансплантации роговицы, подчеркивая биосовместимость продукта в виде раны герметика 11-13. Кроме того, фибрин был использован для различных сердечных целей, в том числе хирургического лечения разрывов левого желудочка и аортокоронарное операций, однако, его применение в качестве адгезионного клея для сердечной патч обычно не используется 14-17. Простой формулировка тромбина и фибриногена приводит к биосовместимым клеем, который может быть помещен непосредственно на внешней стороне внешнего сердечной пластыря, обеспечивая жизнеспособную систему, чтобы обеспечить адгезию патч к сердечной взаимодействия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедура в полной совместимости с протоколом IACUC числа 13302 и был одобрен разделения ресурсов животных.
1. Подготовка прибора
- Автоклав все не-одноразовые инструменты, используемые до хирургического вмешательства, чтобы обеспечить стерильность.
- Стерилизовать инструменты, используемые многократно в сессии с бисер стерилизатор между видами.
2. Подготовка Гидрогель
- Оттепель и пластины стволовые клетки, по крайней мере 24 ч до создания гидрогеля конструкции.
- Подготовка патчи один день до хирургической процедуры с использованием стереолитографии аппарата (или аналогичного инструмента), который был описан во всех подробностях в предыдущих публикациях 8,18.
- Чтобы создать гидрогель, сначала создать системы автоматизированного проектирования (САПР) модель требуемого патча и экспортировать дизайн в формате стереолитографического (STL).
- Создать предварительного гель решение, dissolvinг поли (этиленгликоль) диметакрилат (PEGDMA) в стерильном PBS 1x, чтобы получить 20% вес / об раствора. Одновременно растворить фотоинициатор 1- [4- (2-гидрокси-этокси) фенил] -2-гидрокси-2-метил-1-пропан-1-она в ДМСО. Добавить фотоинициатор к решению PEGDMA на окончательный вес / объем 0,5%. Непосредственно перед сшиванием, добавить 100 мл желаемой плотности клеток. Примечание: плотность клеток между 2,0 х 10 5 х 10 -2.0 6 клеток / мл рекомендуется.
- Пипетировать предварительно раствора геля в чашку в центре платформы SLA и запустить программное обеспечение SLA с ранее загруженного STL отформатирован конструкции.
- Удаление исправления из аппарата и инкубировать гидрогели O / N в модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM) с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 Ед / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина, чтобы обеспечить клетки для регулировки для окружающей среды в патче.
3. Подготовка животных и устные intubatiна
- Оценка каждой мыши до процедуры, чтобы обеспечить животное находится в добром здравии, а определяется из их уходом привычек и взаимодействия с их клетки товарищей. Примечание: Мужской 8-10 недельных мышей C57BL / 6J были использованы для этой процедуры, однако, любого возраста или типа мышь можно использовать.
- Поместите животных в анестезии камеры и выставить до 5% изофлуораном с поддержкой 1 л / мин O 2. Контроль за уровнем анестезии пальца щепоткой рефлекса.
- После того, как животное правильно наркозом, взвесить и разместить их на стенде интубации.
- Направьте источник света в сторону животного грудной полости и использовать пинцет, чтобы убрать поверхность гортани и выставить голосовые связки. Тщательно направлять 20 G angiocath между голосовыми связками, и плавно вставьте в трахею. Обнаружение правильное подключение с помощью механического движения грудной полости после того, как катетер подключен к небольшой животных вентилятора.
- Настройка параметров вентиляции в гое вес животного на основе принципов изготовителя.
- После того, как интубация, поместите животное в положении лежа на спине на грелку, чтобы предотвратить переохлаждение. Убедитесь, что грелку не превышает 40 ° C. При необходимости, поместите барьер между животным и грелку, чтобы свести к минимуму вероятность ожогов.
- Удалить волосы от места операции путем использования депиляционного крема. Стерилизовать сайт на 3 чередующихся скрабы из бетадином и 75% этанола, чтобы обеспечить надлежащее стерилизации. Поставьте драп, чтобы выставить только хирургическое сайт, и разместить ветеринар мазь на глаз, чтобы предотвратить сухость во время процедуры.
4. Хирургические процедуры
- Торакотомии выполняется на левой стороне животного, таким образом, чтобы разрез кожи приблизительно 1 см слева от грудины, который работает длину грудины.
- Используйте пинцет, чтобы отделить мышечного слоя от основной грудной клетки в двух шагах. Соблюдайте DELINEтем создания линии, которая представляет большой грудной мышцы животного. Поднимите эту мышцу немного, отделить его от основной наружной косой мышцы и убрать медиально. Затем освободить наружной косой мышцы от основной грудной клетки таким же образом, и убрать с боков, обеспечивая просторный вид на второй, третьей, четвертой и ребер.
- Выполнение торакотомии между третьим и четвертым ребрами. Аккуратно поднимите четвертый ребро и использовать cauterizer, чтобы открыть грудную полость между третьим и четвертым ребрами. Поместите втягивающие дальнейшего открытия полости и подвергать сердце.
- Используйте пинцет, чтобы разорвать тонкую перикарда сердца.
- Лигирования левой коронарной артерии с нейлоновой мононити 8-0 шва. Поместите шва примерно 4 мм от верхушки сердца, непосредственно под нижней оконечности левого предсердия. Определить правильное размещение шва на побледнение миокарда желудочков и увеличению размера левого предсердия после ŞuţuRe была привязана.
Патч Размещение 5. Клей и
- Хранить патчей при 37 ° С и 5% СО 2 условия до использования.
- Аккуратно поднимите патч, используя плоскую лопаточку концами и аккуратно поместите его на поверхности сердца, на месте миокарда.
Примечание: Для предотвращения соскальзывания левый желудочек, патч может быть проведен в месте, слегка поддерживая контакт либо с помощью шпателя или кончиком пинцета. - Приготовьте клей путем смешивания 4: соотношение фибриногена с тромбином 1. Смешайте раствор повторным пипетированием, пока она не начнет сгущаться, как правило, в течение 1 мин после начала подготовки.
- После того, как вязкость раствора достигнет желаемого уровня, быстро передавать примерно 10 мл на поверхность пластыря. Примечание: Время свертывания из фибринового клея является быстрым, обеспечивая небольшое окно возможностей для эффективной передачи клея.
6. Наложение швов
- Закрыть грудную слой от трех до четырех отдельных швами.
- До полного закрытия межреберной слоя, вставить ПЭ-10 канюли в разрез эвакуировать грудной полости после закрытия завершена и восстановить правильное внутриплевральной давление.
- Закрыть грудные мышцы 3:57 отдельных швами.
- Уплотнение поверхностного слоя с непрерывным швом.
- После полного закрытия, приложите 1.0 мл шприц к концу канюли и использовать его, чтобы эвакуировать грудной полости.
- Нанесите клей ткани в месте разреза, чтобы укрепить шов сайт.
7. После хирургического лечения
- Дайте мышам инъекции бупренорфина (0,05-1,0 мг / кг) и карпрофена (2,2 мг / кг) подкожно сразу после коронарного лигирования и наименее 20 мин до возрождения. Администрирование оба препарата 6-8 ч после операции, А затем дать два раза в день на срок до трех дней, чтобы контролировать боль и страдания.
- Постоянно следить за животным, пока сознательного и каждый час в течение первых 4 ч после операции. Выполните вторую обследование в ночь на операции (2-4 ч позже), чтобы управлять вторую дозу анальгетика.
- Daily Monitor животных после второго дня после процедуры, пока животные не появляются стабильной.
8. Анализ сердца функции и гистологии
- Выполните echocardiographs на мышах 4 недель после процедуры, чтобы определить степень повреждения следующей МИ.
- Обезболить мышей с 4-5% изофлуран в анестезии камеры для индукции ингаляционной анестезии, а затем 2% изофлуран через маску для обслуживания анестезии.
- Очистите область изображения с депиляции кремом и использовать небольшое УЗИ животных, чтобы получить 2D М-режим эхокардиографии сканирование бьющимся сердцем и записывать функциональные параметры Ассолем, связанных с ним.
- Эвтаназии мышей в камере с диоксидом углерода, затем собирать сердца у животных и поместить в 10% растворе формалина в течение 24 ч. Через 24 часа передавать сердца с 70% -ным этанолом и держать при температуре 4 ° С до обработки тканей.
- Процесс сердца и вставлять их в парафиновые блоки.
- Вырезать 5 мм срезы через желудочка области сердца, начиная с вершины и заканчивается в предсердие.
- Пятно срезы срезы с обеих трихромом и гематоксилином Массона и эозином пятно, используя стандартные протоколы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Во время хирургической процедуры, лигирование левой коронарной артерии может быть идентифицирован заметное побледнение ниже по потоку от закупоренной артерии. В качестве теста перед связывать себя узами брака, шов может быть кратко затянуты, чтобы проверить, если он находится в соответствующем месте. Кроме того, поскольку окклюзии артерии результатов в почти мгновенной снижение способности левого предсердия, чтобы правильно бить, левое предсердие будет увеличить в ответ на обратного потока крови в системе.
Измерения эхокардиография М-режим приняты уже в 2 дня после инфаркта показать прекращение левого движения стенки, указывающего на реконструкцию мышц. Качественные расчеты по данным показывают уменьшение фракции выброса и ударного объема в инфарктом сердца. В завершении эксперимента, когда сердца собираются для гистологических целей, очевидно, дилатацию левого желудочка можно увидеть, наряду с истончением левого желудочкастена, и отложение коллагена, что означает отложение рубцовой ткани в месте функционирования кардиомиоцитов (рисунок 1).
Также видел на гистологический анализ является наличие гидрогеля построить благодаря администрации фибрина гель (рисунок 2). Для наших целей, клеевая система должна быть достаточно, чтобы позволить точный контроль размещения и свести к минимуму последующую сток в окружающие органы вязкой, но достаточно податливый, чтобы не мешать работе сердца. Предварительные испытания были проведены для расчета вязкости, время гелеобразования и жесткость различных соотношениях фибриногена / тромбина, с тем чтобы определить надлежащую комбинацию, которая подходит наши потребности. В естественных анализ проводили, чтобы проверить способность фибринового клея для поддержания patch- к ткани адгезии в то же время позволяя получить функции сердца (данные не показаны). Следует отметить, что фибриновый клей не повредить миокарда, о чем свидетельствует лACK из ремоделировании ткани или желудочковой истончение на месте (рисунок 2). В кардиомиоциты остаются нетронутыми, несмотря на добавление как сердечной пластыря и сопровождающей его клеем. Кроме того, жизнеспособность испытания подтвердили, что, что введение фибринового клея к внешней поверхности клетки-инкапсуляции пластырей на основе гидрогелей, не влияет на выживаемость клеток внутри пластыря (фиг.3).
Рисунок 1:. Левой коронарной артерии Результаты лигирования к уменьшению функции сердца, измеренная с помощью эхокардиографии М-режим эхокардиографии здоровых () и инфарктом (б) сердца. Инфаркта сердца показывают четкую отсутствие движения стенки жизнеспособной ткани, где была заменена рубцовой ткани. Это коррелирует с уменьшением измеряемой фракции выброса левого желудочка (EF), сердечная инсультаобъем (SV) и минутного объема сердца (СО). Гистологический анализ здорового (с) и инфарктом (г) показывает сердца дилатацию левого желудочка и истончение стенки левого желудочка из инфаркта миокарда, признаки обоих ремоделировании ткани и осаждением рубцовой ткани. Гистологические изображения поперечного сечения ломтики захватив левый (больше палата) и вправо (меньше камерные) желудочки.
Рисунок 2:. Применение фибрина дымовых обеспечивает Patch адгезию к сердцу пластырь помещают на поверхности сердца, а грудной полости подвергается во время процедуры (а). После размещения фибрина-клей на основе добавляется в верхней части сердца и дают высохнуть. Пластырь можно ясно увидеть на гистологических срезах ткани сердца, которые были собраны через 1 неделю после процедуры (б).Диссоциация патча от поверхности сердца в гистологических изображений артефакт процесса сбора и секционирования. Результаты согласуются до 8 недель адгезии.
Рисунок 3: Фибрин-клей на основе не вредит инкапсулированных Tissues Жизнеспособность клеток измеряли с помощью анализа МТТ 1 неделю после введения фибринового клея на основе с использованием протоколов, описанных подробно в предыдущих публикаций 8.. Жизнеспособность клеток в патч не зависит от того клея на поверхности конструкции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При таком подходе к мышиной модели MI, мы разработали систему, которая сводит к минимуму повреждения, не миокарда областях, которые связаны с другими методами мышиных ИМ. Эти области включают в себя ущерб, причиненный трахеостомии, резку мышечного слоя, и поломку ребер, чтобы разоблачить грудной полости. Мы считаем, что эти изменения улучшают общие хирургические итоговые благодаря тщательности, чтобы как можно больше крупных структур, в том числе ребер и мышечные слои, неповрежденной во время хирургической процедуры.
Следует отметить, что имеются некоторые ограничения этой методике, с наибольшим является его трудоемкой природы, в результате чего только 8-10 полных хирургических процедур в один день. Чтобы преодолеть это, второй вентилятор может быть использован, что обеспечивает процедура должна быть выполнена на двух животных одновременно. Кроме того, крупные сосуды, такие как межреберных сосудов ивнутренняя грудная артерия, следует избегать при выполнении торакотомии. Если рядом с одним из этих сосудов, cauterizer должны быть использованы для предотвращения кровотечения из-за разрыва артерии.
Фибрина клей известно в обоих лабораторных и клинических условиях благодаря своей способности быстро помочь в сгустка, а также его потенциал, чтобы доставить и принимающих МСК 14-17,19. Для наших целей, фибриновый клей служил в качестве биосовместимого подхода к придерживаясь гидрогель на водной основе построить к поверхности сердца. Применение фибринового клея на основе оказался успешным в соответствии гидрогеля конструкции на поврежденном участке до 8 недель, с возможностью контакта ткани более длительного периода времени. Применение этой системы позволило адгезии управления для размещения деликатной конструкции без необходимости дополнительных швов, которые наносят вред миокарда, а также саму конструкцию. Мы обнаружили, что сам клей нетоксичен к инкапсулированным клеткамй негативно не влияет на основной ткани. Гидрогель и фибрина-система клей может быть применен к различным других целей тканевой инженерии, которые желают ячейку или терапевтический контакт в течение длительного периода времени. Кроме того, с использованием метода изготовления ОАС, конструкции и структуры могут быть включены в патч, чтобы создать более сложную систему для доставки клеток 18.
Один удар с использованием фибринового клея на основе является тот факт, что более чем один исследователь должен присутствовать в хирургической комнате при размещении участков и клея того. Это работа первого исследователя, чтобы убедиться, патч остается на месте и не заблудиться в грудной полости, в то время как второй исследователь смешивает раствор и подает его на патч после надлежащего вязкость достигнута. Для оптимизации сроков доставки клея, он предположил, что второй Исследователь также тестирует и раз гелеобразование клея до размещения патч,с правильной гелеобразования клея имеет решающее значение для патча адгезии.
Есть целый ряд критических этапов и подверженных ошибкам областей в протоколе, с первым из которых индукция инфаркта миокарда. Крайне важно, чтобы проверить на наличие признаков, таких как бланширование стенки левого желудочка и расширения левого предсердия, чтобы обеспечить окклюзию левой коронарной артерии. Это может быть сделано до того стежка, просто пересекая и ужесточение конец струны шва. Если определено, что левой коронарной артерии не заключены шва, строка может быть вынут и затем снова подается. Второй критический мера продолжать следить за интубации трубку в течение всей процедуры, чтобы убедиться, что он остается в пределах трахеи и не получить вытащил середине операции. Наконец, в течение операции, все попытки должны быть сделаны, чтобы избежать контакта с легких, как и любой контакт имеет потенциал, чтобы привести к коллапс легкого.Если во время операции, легких Сворачивание происходит, просто блокировать отток трубки в интубатор до 3 сек в попытке повторно раздуть проблемных регионов легких.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась американской армии Грант (W81XWH-08-1-0701) и стипендий от Фонда больницы Карл.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Harvard Model 687 Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 55-0001 | |
| Inintech Biosciences LLC Dry Glass Bead Sterilizer | Fisher Scientific | NC9531961 | |
| Leica MZ6 surgical microscope | Leica | ||
| Cautery Kit | Gemini | GEM 5917 | |
| Delicate Forceps - 0.4 mm Tips Angled | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Agricola Retractor - 3.5 cm Spread | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Spring Scissors - 2.5 mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Castroviejo Needle Holder - w/Lock Tungsten Carbide 14 cm | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Iris Scissors - Delicate Straight 10.5 cm | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| 8-0 monofilament suture | Ethicon | 8730P | |
| 6-0 Silk suture | Ethicon | 639G | |
| Thrombin | Sigma | T7009 | |
| Fibrinogen | Sigma | F3879 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
References
- Kolk, M. V., et al. LAD-ligation: a murine model of myocardial infarction. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2009).
- Li, Y., Yao, Y., Sheng, Z., Yang, Y., Ma, G. Dual-modal tracking of transplanted mesenchymal stem cells after myocardial infarction. International journal of nanomedicine. 6, 815-823 (2011).
- Nagaya, N., et al. Intravenous administration of mesenchymal stem cells improves cardiac function in rats with acute myocardial infarction through angiogenesis and myogenesis. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 287, H2670-H2676 (2004).
- Wang, J. S., Shum-Tim, D., Chedrawy, E., Chiu, R. C. The coronary delivery of marrow stromal cells for myocardial regeneration: pathophysiologic and therapeutic implications. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 122, 699-705 (2001).
- Cashman, T. J., Gouon-Evans, V., Costa, K. D. Mesenchymal stem cells for cardiac therapy: practical challenges and potential mechanisms. Stem cell reviews. 9, 254-265 (2013).
- Sutton, M. G., Sharpe, N. Left ventricular remodeling after myocardial infarction: pathophysiology and therapy. Circulation. 101, 2981-2988 (2000).
- Smolina, K., Wright, F. L., Rayner, M., Goldacre, M. J. Long-term survival and recurrence after acute myocardial infarction in England, 2004 to 2010. Circulation. Cardiovascular quality and outcomes. 5, 532-540 (2012).
- Chan, V., Zorlutuna, P., Jeong, J. H., Kong, H., Bashir, R. Three-dimensional photopatterning of hydrogels using stereolithography for long-term cell encapsulation. Lab on a chip. 10, 2062-2070 (2010).
- Kai, D., et al. Stem cell-loaded nanofibrous patch promotes the regeneration of infarcted myocardium with functional improvement in rat model. Acta biomaterialia. 10, 2727-2738 (2014).
- Serpooshan, V., et al. The effect of bioengineered acellular collagen patch on cardiac remodeling and ventricular function post myocardial infarction. Biomaterials. 34, 9048-9055 (2013).
- Cavallo, L. M., Solari, D., Somma, T., Savic, D., Cappabianca, P. The Awake Endoscope-Guided Sealant Technique with Fibrin Glue in the Treatment of Postoperative Cerebrospinal Fluid Leak After Extended Transsphenoidal Surgery: Technical Note. World neurosurgery. , (2013).
- Chung, H. W., Mehta, J. S. Fibrin glue for Gundersen flap surgery. Clinical Ophthalmology. 7, 479-484 (2013).
- Dunn, C. J., Goa, K. L. Fibrin sealant: a review of its use in surgery and endoscopy. Drugs. 58, 863-886 (1999).
- Chi, N. H., et al. Cardiac repair achieved by bone marrow mesenchymal stem cells/silk fibroin/hyaluronic acid patches in a rat of myocardial infarction model. Biomaterials. 33, 5541-5551 (2012).
- Erb, M. A., Claus, T., Hartrumpf, M., Bachmann, S., Albes, J. M. The use of Tachosil surgical patch or fibrin glue in coronary artery surgery does not affect quality of anastomosis or provoke postoperative adhesions in pigs. European journal of cardio-thoracic surgery : official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 36, 703-707 (2009).
- Okada, K., et al. Surgical treatment for rupture of left ventricular free wall after acute myocardial infarction. Interactive cardiovascular and thoracic surgery. 4, 203-206 (2005).
- Simpson, D., Liu, H., Fan, T. H., Nerem, R., Dudley, S. C. A tissue engineering approach to progenitor cell delivery results in significant cell engraftment and improved myocardial remodeling. Stem Cells. 25, 2350-2357 (2007).
- Jeong, J. H., et al. Living' microvascular stamp for patterning of functional neovessels; orchestrated control of matrix property and geometry. Advanced Materials. 24, 58-63 (2012).
- Wu, X., Ren, J., Li, J. Fibrin glue as the cell-delivery vehicle for mesenchymal stromal cells in regenerative medicine. Cytotherapy. 14, 555-562 (2012).
