En hydrogel Konstruera och Fibrin baserat lim metoden att leverera Therapeutics i en murin hjärtinfarkt modell.

Introduction

En hjärtinfarkt (Ml) definieras som avbrott av blod till en region hos hjärtat som orsakas av ocklusion av en större kransartär. Den skada som härrör från ett Ml beror på ombyggnad av viabelt hjärtvävnad in i icke-funktionella ärrvävnad, vilket minskar möjligheten för hjärtat, eller närmare bestämt, den vänstra ventrikeln, för att slå på rätt sätt. Detta resulterar i en minskning av volymen av blod som kan levereras till kroppen med varje hjärtslag, känd som slagvolym, och andelen av blod som pumpas ut från hjärtat med varje hjärtslag, kallas ejektionsfraktion ^6. Dessa, tillsammans med andra minskat funktioner, ökar belastningen på resten av hjärtat att upprätthålla tillräcklig funktion. Ofta kan denna ökade stammen blivit så allvarlig att den orsakar en andra hjärtattack, ett fenomen ses i ca 10% av personer ^7.

Även om medicinsk praxis har utvecklats för att behandlaomedelbart efter en hjärtinfarkt, har ingen teknik utvecklats för att stoppa, långsam, eller vända den negativa biverkningar av vävnadsombildning. Stamcellsterapi har dykt upp som en möjlig väg för en sådan behandling, men trots sin lovande potential stamceller har inte visat sig framgångsrika i klinisk miljö. En teori för sina tillkortakommanden är oförmågan att se de positiva cellerna kvar på platsen för infarkt tillräckligt länge för att generera goda resultat ^5. Det har visat sig att inte mer än 24% av celler som bara injiceras i stället för infarkt levde och låg kvar på den skadade platsen 1 dag efter leverans ^2. En möjlig utsikter för att ta itu med frågan om cellkvarhållande är att utveckla biokompatibla hydrogel system som kapslar antingen celler eller läkemedel, som kan levereras till den skadade platsen. Hydrogelen val i detta protokoll är en poly (etylenglykol) dimetakrylat på grund av dess tidigare användning i cellinkapslings procedures emellertid varje hydrogel med förmåga att inkapsling kan användas ^8. Leveransen av plåstret direkt till platsen för skadan säkerställer cell-till-vävnadskontakt under en utsträckt tidsperiod, vilket ökar den tid cellerna kan ge fördelaktiga faktorer till den underliggande hjärtmuskeln.

En flaskhals för plåstret tillvägagångssättet är att det är svårt att fästa lappen till hjärtat ytan. Många grupper har övervunnit detta genom en mängd olika tekniker, den vanligaste är en enkel sutur att knyta konstruktionen till hjärtat ytan ^9,10. Detta har visat sig vara framgångsrik i ett antal fall i vilka konstruktionen är tillverkad av ett styvare material, men misslyckas när försök på en hydrogel-system, på grund av den höga vattenkoncentrationen och känsliga natur plåstret konstruktet. För att övervinna detta, har vi använt ett fibrinlim externt limsystem som efterliknar kemin för koagelbildning. Fibrinlim har använts i många medicinska operationer, including dura tårar, luftrörs fistlar och hornhinnetransplantation, med fokus på biokompatibilitet av produkten som ett sår tätningsmedel ^11-13. Dessutom har fibrin använts för en mängd olika hjärt ändamål, bland annat kirurgisk behandling av vänsterkammar spricker och koronar bypass-operationer, men dess användning som en vidhäftnings lim för en hjärt plåstret inte vanligt förekommande ^14-17. En enkel formulering av trombin och fibrinogen resulterar i en biokompatibel lim som kan placeras direkt på utsidan av en yttre hjärt plåster, vilket ger en livskraftig vidhäftning för att säkerställa plåstret till hjärt interaktion.

Protocol

Förfarandet är i full kompatibilitet med lACUC protokoll nummer 13302 och har godkänts av avdelningen av djurresurser.

1. Instrument Framställning

1. Autoklav alla icke-engångsinstrument som används före det kirurgiska ingreppet för att säkerställa sterilitet.
2. Sterilisera instrument som används flera gånger i en session med en glaspärla autoklav mellan användningarna.

2. Hydrogel Framställning

1. Tina och platta stamceller minst 24 timmar före skapandet av hydrogel konstruktionen.
2. Förbered lappar en dag före det kirurgiska ingreppet med hjälp av en stereolitografi apparat (eller liknande instrument) som har beskrivits i detalj i tidigare publikationer ^8,18.
3. För att skapa hydrogel, första generera en datorstödd konstruktion (CAD) modell av den önskade plåstret och exportera design till stereolitografisk format (STL).
4. Skapa en pre-gellösning genom dissolving poly (etylenglykol) -dimetakrylat (PEGDMA) i steril 1 x PBS för att erhålla en 20% vikt / volym lösning. Samtidigt upplöses fotoinitiatorn 1- [4- (2-hydroxi-etoxi) -fenyl] -2-hydroxi-2-metyl-1-propan-1-on i DMSO. Lägg fotoinitiatorn till PEGDMA lösning vid en slutlig vikt / volym av 0,5%. Direkt före tvärbindning, tillsätt 100 ml av den önskade densiteten av celler. Obs: En celltäthet mellan 2,0 x 10 ⁵ -2,0 x 10 ⁶ celler / ml rekommenderas.
5. Pipet pre-gellösningen i en skål i mitten av SLA-plattformen och kör SLA programvara med den tidigare uppladdade STL formaterad design.
6. Ta bort plåstren från anordningen och inkubera hydrogelerna O / N i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 5% fetalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin och 100 mg / ml streptomycin för att möjliggöra för celler att justera miljön i plåstret.

3. Djur Förberedelse och muntliga intubatipå

1. Utvärdera varje mus före ingreppet för att säkerställa att djuret är vid god hälsa, som bestäms utifrån deras grooming vanor och samspel med sina bur kompisar. Obs: Kvinna 8-10 veckor gamla C57BL / 6J möss användes för detta förfarande kan emellertid använt någon mus ålder eller typ.
2. Placera djur i en anestesikammare och utsättas för 5% isofluoran med en 1 l / min _O2 stöd. Övervaka nivån på anestesi genom tå nypa reflex.
3. När djuret är ordentligt sövd, väga och placera dem på intubering monter.
4. Rikta en ljuskälla mot djurets brösthålan och använda pincett för att dra tillbaka den laryngeala ytan och exponera stämbanden. Försiktigt in en 20 G angiokat mellan stämbanden och smidigt sätt in i luftstrupen. Detektera korrekt insättning genom en mekanisk rörelse av brösthålan när katetem är ansluten till små djur ventilatorn.
5. Justera ventilationsinställningar till the vikten av djuret baserat på tillverkarens anvisningar.
6. När intuberade, placera djuret i ryggläge på en värmedyna för att förhindra hypotermi. Se till att värmedynan inte överstiger 40 ° C. Om det behövs, placera en barriär mellan djuret och värmedyna för att minimera risken för brännskador.
7. Ta bort hår från operationsområdet genom användning av en hårborttagningskräm. Sterilisera platsen med 3 alternerande skurar av Betadine och 75% etanol för att säkerställa korrekt sterilisering. Placera en duk för att exponera bara operationsområdet, och placera veterinär salva på ögonen för att förhindra torrhet under förfarandet.

4. Kirurgisk procedur

1. Den torakotomi utförs på den vänstra sidan av djuret, därför, göra ett hudsnitt ca 1 cm till vänster om bröstbenet, som löper längden av bröstbenet.
2. Använd pincett för att separera muskelskiktet från den underliggande bröstkorgen i två steg. Observera en Delinerande linje som representerar pectoralis major muskler hos djuret. Lyft denna muskel något skilja den från den underliggande externa sneda muskler och dra medialt. Sedan, att befria yttre sneda muskeln från den underliggande bröstkorgen på samma sätt, och dras tillbaka i sidled, vilket ger en unobscured vy av det andra, tredje, och fjärde ribbor.
3. Utför torakotomi mellan tredje och fjärde revbenet. Lyft försiktigt fjärde revbenet och använda en cauterizer att öppna brösthålan mellan de tredje och fjärde revbenet. Placera upprullningsdon att ytterligare öppna håligheten och exponera hjärtat.
4. Använd pincett för att spräcka den tunna perikardium av hjärtat.
5. Ligate vänster kranskärl med en 8-0 monofilament nylonsutur. Placera suturen approximativt 4 mm från spetsen av hjärtat, direkt under den undre spetsen av det vänstra förmaket. Bestämma korrekt sutur placering genom en blanche av det ventrikulära myokardium och en ökning i storleken av det vänstra förmaket efter Suture har varit bundna.

5. Patch placering och lim

1. Håll patchar vid 37 ° C och 5% CO ₂ betingelser fram till användning.
2. Lyft försiktigt plåstret med en platt ände spatel och försiktigt placera den på ytan av hjärtat, på platsen för infarkt.
   Obs! För att förhindra glider av vänster kammare, kan plåstret hållas på plats genom att lätt hålla kontakt med antingen spatel eller spetsen på en pincett.
3. Förbered lim genom blandning av en 4: 1-förhållande av fibrinogen till trombin. Blanda lösningen genom upprepad pipettering tills den börjar tjockna, vanligen inom 1 min efter början av preparatet.
4. När lösningen viskositeten når den önskade nivån, snabbt överföra ungefär 10 ml till plåstret ytan. Obs: Koagulationstiden för fibrinlim är snabb, vilket ger en liten möjlighet för effektiv överföring av limmet.

6. Suturering

1. Stäng revben skiktet med 3:57 enskilda avbrutna suturer.
2. Före full stängning av interkostal skiktet, infoga en PE-10 kanyl i snittet för att evakuera brösthålan efter förslutning är klar och återupprätta korrekt intrapleurala tryck.
3. Stäng bröstmusklerna med 3:57 enskilda avbrutna suturer.
4. Täta hudskiktet med en kontinuerlig sutur.
5. Efter fullständig stängning, bifoga en 1,0 ml spruta till slutet av kanylen och använda den för att evakuera brösthålan.
6. Applicera ett vävnadsadhesiv till snittstället för att förstärka suturstället.

7. Post-kirurgisk behandling

1. Ge möss en injektion av buprenorfin (0,05 till 1,0 mg / kg) och karprofen (2,2 mg / kg) subkutant omedelbart efter koronarligation och minst 20 min före återupplivande. Administrera båda läkemedlen 6-8 timmar efter operation, Och sedan ge två gånger dagligen under upp till tre dagar för att kontrollera smärta och ångest.
2. Kontinuerligt övervaka djuren tills medveten och varje timme under de första 4 timmar efter operation. Utför en andra GRANSKNING natten av kirurgi (2-4 timmar senare) för att administrera en andra dos av smärtstillande.
3. Övervaka djuren dagligen efter den andra dagen efter proceduren tills djuren verkar stabil.

8. Analys av hjärtfunktionen och histologi

1. Utför ekokardiograferna på möss 4 veckor efter det förfarande för att fastställa omfattningen av skador efter MI.
2. Söva möss med 4-5% isofluran i en narkos kammare för induktion av inhalationsanestesi, och sedan 2% isofluran via ansiktsmask för underhållsanestesi.
3. Rensa avbildningsområdet med en hårborttagningskräm och använda ett litet djur ultraljud för att erhålla en 2D M-mode ekokardiografi genomsökning av bultande hjärta och registrera den funktionella parametrar assoförbundna med den.
4. Euthanize mössen i en koldioxidkammare, sedan samla hjärtan från djuren och plats i en 10% formalinlösning under 24 timmar. Efter 24 timmar, överföra hjärtan till 70% etanol och hålla vid 4 ° C tills vävnadsbehandling.
5. Behandla hjärtan och bädda in dem i paraffinblock.
6. Skär 5 mm snitt genom den ventrikulära regionen hos hjärtat, med början vid spetsen och slutar vid atrium.
7. Stain sektione skivor med både Masson trikrom och hematoxylin och eosin fläcken med hjälp av standardprotokoll.

Representative Results

Under den kirurgiska proceduren, kan ligering av den vänstra kransartären identifieras genom en märkt blanche nedströms den tilltäppta artären. Som ett test innan band av fnurran, kan suturen dras åt snabbt för att kontrollera om det är på en lämplig plats. Dessutom, eftersom ocklusion av artären resulterar i nästan ögonblicklig minskning i förmågan hos det vänstra förmaket för att korrekt slå, kommer det vänstra förmaket förstoring i beroende av ett backflöde av blod i systemet.

M-mode ekokardiografi mätningar tas så tidigt som två dagar efter infarkt visar ett upphörande av vänstra väggen rörelse, indikativ för muskeluppbyggnaden. Kvalitativa beräkningar från data visar en minskning av ejektionsfraktion och slagvolym i infarkt hjärtan. Vid slutet av experimentet, när hjärtan uppsamlas för histologiska syften, kan en klar dilatation av den vänstra ventrikeln ses, tillsammans med en förtunning av det vänstra ventrikuläravägg, och avsättning av kollagen som betecknar ärrvävnad avsättning istället för fungerande kardiomyocyter (figur 1).

Också sett vid histologisk analys är förekomsten av hydrogelen konstruera tack vare administrationen av fibringelen (Figur 2). För våra syften, måste limsystem vara viskös nog att låta exakt placering kontroll och minimera efterföljande avrinning till omgivande organ, men formbart nog att inte störa hjärtfunktionen. Preliminära tester utfördes för att beräkna viskositeten, gelningstiden, och styvheten hos olika fibrinogen / trombin-förhållanden, i syfte att bestämma den rätta kombinationen som passar våra behov. In vivo-analys utfördes för att testa förmågan hos den fibrinlimmet att upprätthålla lapptäcke till-vävnadsadhesion samtidigt tillåta för fullständig hjärtfunktion (data ej visade). Det bör noteras att fibrinlim inte skadade myokardiet, vilket framgår av lack av vävnadsombildning eller kammar gallring på platsen (Figur 2). De cardiomyocytes förbli intakt trots tillsatsen av både hjärt plåster och dess medföljande lim. Dessutom livskraft tester bekräftat att förvaltningen av fibrin lim på utsidan av en cell-inkapslande hydrogelfläcken inte påverkar cellöverlevnad i plåstret (Figur 3).

Figur 1:. Vänster kransartärligering leder till en minskning i hjärtfunktionen mätt med ekokardiografi M-mode ekokardiografi hos friska (a) och infarkt (b) hjärtan. Infarkt hjärtan visar en tydlig brist på väggen rörelse där livskraftig vävnad har ersatts med ärrvävnad. Detta korrelerar med en mätbar minskning av vänsterkammarens ejektionsfraktion (EF), hjärt strokevolym (SV), och hjärtminutvolym (CO). Histologisk analys av friska (C) och infarkt (d) hjärtan visar dilatation av den vänstra ventrikeln och förtunning av vänstra ventrikulära väggen i infarkt myokardium, båda tecken på vävnadsombildning och ärrvävnad avsättning. Histologiska bilder är tvärsnitts skivor fånga vänster (större kammare) och höger (mindre kammare) kamrarna.

Figur 2:. Tillämpning av fibrin Flue Garanterar Patch vidhäftning till hjärtat Plåstret placeras på ytan av hjärtat medan brösthålan exponeras under förfarandet (a). När placerad, är ett fibrin-baserat lim tillsatt ovanpå hjärtat och fick torka. Plåstret kan tydligt ses på histologiska snitt av hjärtvävnad som samlades in på en vecka efter ingreppet (b).Dissociation av plåstret från hjärtat ytan i histologiska bilder är en artefakt av insamling och snittprocessen. Resultat överensstämmer i upp till 8 veckor efter vidhäftning.

Figur 3: Fibrin-baserade lim skadar inte inkapslade Vävnader Cellviabilitet mättes genom MTT-analys en vecka efter administreringen av ett fibrin-baserat lim med användning av protokoll som beskrivs i detalj i tidigare publikationer ^8.. Viabiliteten hos cellerna inom plåstret påverkades inte av tillsatsen av lim på ytan av konstruktionen.

Discussion

Med detta synsätt på mus MI modellen, har vi utvecklat ett system som minimerar skadan på icke-hjärtmuskulaturen områden som är förknippade med andra murina MI tekniker. Dessa områden omfattar skador som orsakats av en trakeostomi, styckning av muskelskiktet och brott revben för att exponera brösthålan. Vi tror att dessa förändringar förbättrar de övergripande kirurgiska utfall tack vare omsorg för att behålla så mycket av de stora strukturerna, inklusive revbenen och muskelskikt, intakt under det kirurgiska ingreppet.

Det bör noteras att det finns vissa begränsningar för denna teknik, med den största är det tidskrävande karaktär, vilket resulterar i endast 8-10 hela kirurgiska ingrepp på en dag. För att lösa detta, kan en andra fläkt användas, vilket möjliggör det förfarande som skall utföras på två djur samtidigt. Dessutom, större fartyg, såsom interkostala fartyg ochinteriör bröstartären, bör undvikas när du utför torakotomi. Om nära en av dessa fartyg, bör en cauterizer användas för att förhindra blödning på grund av att en brusten artär.

Fibrinlim är känd både i laboratorie- och kliniska miljöer tack vare sin förmåga att snabbt hjälpa till blodproppsbildning, liksom dess potential att leverera och värd MSC ^14-17,19. För våra syften, fibrinlim tjänade som en biokompatibel tillvägagångssätt för att vidhäfta en vattenbaserad hydrogel konstruera till ytan hos hjärtat. Användningen av en fibrin-baserade limmet har visat sig framgångsrika i att hålla hydrogelen konstruktet vid den skadade platsen i upp till 8 veckor, med möjlighet för vävnadskontakt av en längre tid. Användningen av detta adhesionssystemet tillät styrning för placering av den känsliga konstruktionen utan behov av ytterligare suturer som skadar myokardium liksom konstruktet själv. Vi har funnit att limmet i sig är icke-toxisk för de inkapslade cellerna ennd påverkar inte den underliggande vävnaden negativt. Hydrogelen och fibrin-baserade limsystem kan appliceras på en variation av andra vävnadstekniska ändamål som önskar cell eller terapeutisk kontakt under en längre tidsperiod. Dessutom, med hjälp av SLA tillverkningsmetod, mönster och strukturer kan införlivas i plåstret för att skapa ett mer komplext system för cell leverans ^18.

Ett bakslag för användningen av fibrin baserat lim är det faktum att mer än en forskare måste vara närvarande i den kirurgiska rum under patch placering och lim tillägg. Det är en uppgift för den första forskare att se till att plåstret fortfarande på plats och inte gå vilse i brösthålan, medan den andra forskare blandar lösningen och applicerar den på plåstret efter lämplig viskositet uppnås. För att optimera tidpunkten för lim leverans, föreslås det att den andra forskaren testar och tider också gelningen av limmet innan plåstret placering,eftersom korrekt gelning av limmet är avgörande för patch vidhäftning.

Det finns ett antal kritiska steg och fel benägna områden inom protokoll, med den första är induktion av hjärtinfarkt. Det är absolut nödvändigt att kontrollera om tecken, såsom blanche av den vänstra ventrikulära väggen och utvidgningen av det vänstra förmaket, för att säkerställa ocklusion av den vänstra kransartären. Detta kan göras före tillsatsen av sömmen genom att helt enkelt korsa och åtdragning av änden av suturen strängar. Om det bestäms att den vänstra kransartären inte är omsluten av suturen, kan strängen tas ut och återappliceras. En andra kritisk åtgärd är att fortsätta att övervaka intubation röret under hela förfarandet, för att säkerställa att det förblir inom luftstrupen och inte får dras ut i mitten av operationen. Slutligen, under operationen, alla försök bör göras för att undvika kontakt med lungorna, eftersom varje kontakt har potential att leda till en kollapsad lunga.Om det under operationen, lunga kollaps inträffar helt enkelt blockera utflödesröret hos intubator i upp till 3 sekunder i ett försök att åter blåsa oroliga områden av lungorna.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Harvard Model 687 Mouse Ventilator	Harvard Apparatus	55-0001
Inintech Biosciences LLC Dry Glass Bead Sterilizer	Fisher Scientific	NC9531961
Leica MZ6 surgical microscope	Leica
Cautery Kit	Gemini	GEM 5917
Delicate Forceps - 0.4 mm Tips Angled	Fine Science Tools	11063-07
Agricola Retractor - 3.5 cm Spread	Fine Science Tools	17005-04
Spring Scissors - 2.5 mm Blades Straight	Fine Science Tools	15000-08
Castroviejo Needle Holder - w/Lock Tungsten Carbide 14 cm	Fine Science Tools	12565-14
Iris Scissors - Delicate Straight 10.5 cm	Fine Science Tools	14060-10
8-0 monofilament suture	Ethicon	8730P
6-0 Silk suture	Ethicon	639G
Thrombin	Sigma	T7009
Fibrinogen	Sigma	F3879
Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469SB