Abstract
Menselijke huid een belangrijke barrière functie en bevat diverse immuuncellen die bijdragen aan weefsel homeostase en bescherming tegen pathogenen. Aangezien de huid is relatief gemakkelijk te bereiken, biedt een ideaal platform perifere immuun regulerende mechanismen te bestuderen. Immune resident cellen in gezonde huid gedrag immunosurveillance, maar spelen ook een belangrijke rol in de ontwikkeling van inflammatoire huidaandoeningen, zoals psoriasis. Ondanks nieuwe inzichten, is ons begrip van de biologie onderliggende verschillende inflammatoire huidaandoeningen nog beperkt. Er is behoefte aan goede kwaliteit (interne) celpopulaties geïsoleerd uit biopsie huidmonsters. Tot dusver isolatieprocedures zijn ernstig gehinderd door het ontbreken van het verkrijgen van een voldoende aantal levensvatbare cellen. Isolatie en daaropvolgende analyse zijn ook beïnvloed door het verlies van immune cellijn markers, vanwege de mechanische en chemische stress veroorzaakt door de huidige dissociatie procedures ter verkrijgingenkele celsuspensie. Hier beschrijven we een gemodificeerde methode om T-cellen van zowel gezonde en betrokken psoriatische menselijke huid isoleren combineren mechanische dissociatie huid behulp van een geautomatiseerde weefsel dissociator en collagenase behandeling. Deze methode behoudt expressie van de meeste immune lineage markers zoals CD4, CD8, CD 11 c Foxp3 en op de bereiding van enkelvoudige celsuspensies. Voorbeelden van succesvolle CD4 + T cel isolatie en vervolgens fenotypische en functionele analyse getoond.
Introduction
De huid, als de primaire interface tussen het lichaam en het milieu, biedt de eerste verdedigingslinie tegen externe fysische, chemische en biologische beledigingen zoals verwonding, ultraviolette straling en micro-organismen. Huid bestaat uit twee grote compartimenten, de epidermis en de dermis, en bevat een verscheidenheid van immuuncellen zoals Langerhans cellen, macrofagen, dendritische cellen (DC's), en ongeveer 20 miljard memory T-cellen bijna tweemaal zoveel in de totale bloedvolume 1 , 2. Een groeiende hoeveelheid gegevens ondersteunen het idee dat de huid essentiële immunologische functies, zowel tijdens weefsel homeostase en in verschillende pathologische aandoeningen. Immuuncellen in normale huid verblijfplaats wordt gedacht dat immunosurveillance 3 voeren en hebben aangetoond dat het een rol in de ontwikkeling van ontstekingsaandoeningen zoals psoriasis 4 spelen. In psoriatische letselhuid, zowel CD4 + als CD8 + T cellen geïnfiltreerd observed en werd aangetoond dat de verhouding van de CD4 en CD8 varieert afhankelijk van de ziektestatus 5. Echter, deze celpopulaties zijn moeilijk te bestuderen omdat de bestaande technieken maken het isoleren van slechts enkele cellen.
De momenteel op grote schaal gebruikt technieken voor het T-cel isolatie van de menselijke huid te combineren mechanische huid dissociatie met enzymatische behandeling. De menselijke huid biopten worden uitgebreid gehakt en geïncubeerd met enzymen zoals trypsine, collagenase en / of EDTA 6-8. Aangezien de huid een barrière weefsel dat zeer resistent is tegen trekkrachten en mechanische disaggregatie de gevestigde werkwijzen van T cel isolatie geproduceerd zeer weinig cellen, en zelfs lagere aantallen van levensvatbare cellen, die ex vivo celkweek maakt van deze celpopulaties moeilijk en uitdagend.
Hier melden wij een aangepaste methode om lymfocyten van zowel gezonde en betrokken psoriatische menselijke huid te isoleren door het combineren van mechansche dissociatie van de huid met behulp van een geautomatiseerde weefsel dissociator plaats van de gevestigde werkwijze van extensief hakken, met behulp van enzymatische digestie collagenase. Verschillende levensvatbare immuuncelsubklassen zoals DC en T-cellen werden na de bereiding van een enkele-celsuspensie. Vooral de expressie van de oppervlaktemarkers CD3, CD4 en CD8 was goed geconserveerd. Aldus bereide cellen, klaar voor gebruik in ex vivo celkweken of flowcytometrische analyse. Dit protocol is met succes toegepast voor de analyse van afzonderlijke huidbiopsies (4 mm) afkomstig van letselhuid van psoriasis. De resultaten toonden aan dat de huid inwoner patiënt T-cellen geproduceerd meer inflammatoire cytokines, zoals IL-17 en IFNy in vergelijking met gezonde vrijwilligers 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Huid biopten van gezonde individuen werden verkregen uit buikhuid overgebleven van individuen die een electieve plastische chirurgie na mondelinge of schriftelijke informed consent voor wetenschappelijk gebruik. Het gebruik van menselijke huid werd goedgekeurd en in overeenstemming met de door de Medisch Ethische commissies ingesteld voor menselijke onderzoek van het medisch centrum Radboud Universiteit, Nijmegen, Nederland en Universiteit van Essen, Duitsland regelgeving.
1. Bereiding van suspensies van afzonderlijke cellen van menselijke huid (Werk Steriel in een flow-kast als Latere Cell Cultuur is vereist)
- Bereid celkweekmedium: RPMI 1640 + penicilline / streptomycine (eindconcentraties 100 eenheden / ml en 100 ug / ml) + pyruvaat (0,02 mM) en glutamax (0,02 mM), zonder serum toegevoegd.
- Bereid compleet kweekmedium: kweekmedium bereid in stap 1,1 + 10% humaan serum gepoolde (HPS); bewaren bij 4 ° C. Breng medium tot 20 ° C ± 2 voor onsing.
- Het verkrijgen van de huid biopsie met behulp van een 4mm round biopsie punch instrument en bewaar het in RPMI1640 compleet kweekmedium bij 20 ° C ± 2 tot 4 uur of bij 4 ° C ON. Verwerk de biopsie zo snel mogelijk na aankomst in het laboratorium.
LET OP: Langere opslag van huid zal invloed hebben op de cel opbrengst en levensvatbaarheid van de cellen. - Label een blauw-capped dissociatie buis en voeg 5 ml compleet kweekmedium in de gemerkte buis.
- Voeg 2 ml compleet kweekmedium in elk putje (in totaal 3 wells) van een steriele 6-well cultuur plaat. Gebruik steriele instrumenten om de biopsie te plaatsen in een enkele, goed afspoelen, verplaatsen naar een tweede put en herhaal deze stap nog een keer, dus een totaal van drie spoelingen bereiken.
- Breng de goed gespoeld huidbiopsie een steriele petrischaal, voeg 100 ul compleet cultuurmedium bovenop biopsie en voorzichtig afschrapen het onderhuidse vetweefsel via een roestvrij stalen wegwerp steriel scalpel.
LET OP: This is een cruciale stap. - Snijd elke huidbiopsie in 4 kleinere stukken op een steriele petrischaal. Doorvoermonsters (maximaal vier van 4 mm biopsies per buis) aan de bereide dissociatie buis met 5 ml compleet cultuurmedium.
- Nauw sluit de buizen met de dop en bevestig ondersteboven aan de mouw van de geautomatiseerde weefsel dissociator. Zorg ervoor dat alle monstermateriaal is gelegen in het gebied van de rotor.
- Start het dissociatieproces door uitvoering van de "programma m_spleen _01" (een vooraf bepaald programma door het interne geheugen van het instrument of de begeleiding programmeerkaart) aan de biopsie dissociëren op het geschikte rotatiesnelheid voor 56 sec.
- Na de verwerking, maak de dissociatie buis uit het dissociator en zorg ervoor dat al het gedissocieerde materiaal wordt verzameld op de bodem van de buis.
- Voeg 150 ul collagenase IA (80 mg / ml) in de dissociatie buis en incubeer het monster in een schuddend waterbad bij 37° C gedurende 60 minuten. Voeg 100 ul van DNase I (5 ME / ml) in thedissociation buis, meng goed.
LET OP: hogere concentratie van collagenase of langere incubatietijd zal levensvatbaarheid van de cellen te veranderen. - Bevestig de dissociatie buis aan de mouw van de geautomatiseerde weefsel dissociator en start het programma "m_ milt _01" om de biopsie distantiëren nog een keer.
- Plaats een 70 uM nylon cel zeef bovenop een 50 ml Falcon buis. Solliciteer gedissocieerde monster materialen om deze cel zeef naar cel klonten / weefsel vuil te verwijderen.
- Was cel zeef eenmaal met 5 ml compleet cultuurmedium. Centrifugeer bij 20 ° C ± 2, 450 xg gedurende 10 min en zuig supernatant.
- Herhaal de wasstap nog een keer. Resuspendeer celpellets in 300 ul compleet cultuurmedium. Single-celsuspensies zijn klaar voor verdere analyse; verder met protocollen voor ex vivo celkweek of flowcytometrie analyse.
- Bij verdere intracellular cytokine kleuring, stimuleren cellen met PMA (12,5 ng / ml), Ionomycine (500 ng / ml) en Brefeldine A (5 ug / ml) gedurende 4 uur bij 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende 4 uur voordat stroming cytometrie analyse.
2. Polyklonale Activering van Skin-Resident T-cellen (Ex Vivo Cultuur van de Cel)
- Aliquot 100 pi eencellige suspensies (bereid in stap 1,15) in een rond-bodem 96-well plaat.
Opmerking: Voor elk van 4 mm huidbiopsie, kan de verkregen enkelvoudige celsuspensies worden gesplitst in ten minste twee putjes van een 96-wells plaat. - Add anti-CD3 / anti-CD28 mAb-beklede microkorrels (parels 25.000 per putje), recombinant humaan cytokine rIL-2 (eindconcentratie 25 U / ml) en rIL-1β (eindconcentratie 50 ng / ml).
- Bedek de cultuur plaat met een goed gelabelde plaat deksel, incubeer in 5% CO 2, 100% vochtigheid, 37 ° C incubator. Verander medium wanneer het medium kleur verandert in geel.
3. Flowcytometrie Analyse van de Primary / gekweekte huid-resident T-cellen
- Bereid FACS buffer: PBS + 0,2% BSA.
- Transfer cellen van belang in een v-bodem 96-well plaat. Centrifugeer bij 20 ° C ± 2, 450 g gedurende 2 min, en zuig supernatant.
- Resuspendeer de pellet in 100 pl PBS. Centrifugeer bij 20 ° C ± 2, 450 g gedurende 2 min, en zuig supernatant.
- Vlek cellen met 100 pi bereid eFluorescence780 geconjugeerd fixeerbaar levensvatbaarheid kleurstof (1: 1000 verdunning gebruikt PBS) bij 4 ° C gedurende 30 minuten. Voeg 100 gl FACS buffer, centrifugeer bij 20 ° C ± 2, 450 g gedurende 2 min, en zuig supernatant.
- Gewenste celoppervlaktemarker mAbs, bijvoorbeeld: CD45-BV421 (HI30, 01:20), CD3-ECD (UCHT1, 01:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 01:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 01:50), CD56-PE (MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7 (BC96, 01:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10), en cd1c-APC (AD5-8E7, 1:10), de voorbereiding van de mAbs-mengsel met behulp van FACS-buffer op basis van elke mAb verdunningsfactor getest. gate instellingen met behulp van isotype controle antilichaam samen met niet-vlek sample te definiëren.
- Voeg 25 ul van bereide mAbs-mengsel in elk putje. Incubeer 20 min bij 20 ° C ± 2, bescherming tegen licht.
- Voeg 100 gl FACS buffer, centrifugeer bij 20 ° C ± 2, 450 g gedurende 2 min, en zuig supernatant.
- Voor monsters die alleen celoppervlak kleuring vereisen, verder met stap 3.16.
- In het geval van intra-cellulaire Foxp3 kleuring:
- Bereid fixatie en permeabilisatie buffer door het mengen van één deel concentraat met 3 delen van oplosmiddelen.
- Bereid 1x permeabilisatie buffer: 1 deel 10x permeabilisatie buffer + 9 delen gesteriliseerd H 2 O.
- Resuspendeer pellets in 100 ul van fixatie en permeabilinisatie buffer, meng goed, en incuberen bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
- Voeg 100 ul permeabilisatie buffer aan elk putje centrifugeer bij 450 xg bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten, en zuig supernatant.
- Was de cellen met permeabilisatie buffer nog een keer.
- Selecteer gewenste intracellulaire mAbs bijvoorbeeld Foxp3-eFluo450 (PCH101, 01:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 1:50) en IFNy-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Bereid de mAbs mengsel met behulp van permeabilisatie buffer die 2% normale rat serum op basis van elke mAb verdunningsfactor getest. gate instellingen met behulp van isotype controle antilichaam samen met niet-vlek sample te definiëren.
- Voeg 20 ul van mAb-bereide mengsel in elk putje. Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 min, bescherming tegen licht.
- Na 30 minuten incubatie, voeg 100 ul van permeabilisatie buffer in elk putje. Centrifugeer bij 20 ° C ± 2, 450 g gedurende 2 min, en zuig supernatant.
- Was de cellen met permeabilisatie buffer nog een keer. Resuspendeer pellet in 110 ui FACS buffer, en de overdracht celsuspensies in microFACS buis.
LET OP: De steekproef is klaar voor de meting met behulp van 10-kleuren flowcytometrie. - Bij exacte aantal cellen nodig, voeg 10 ul goed gemengd uniforme suspensie van FluoroSpheres in elk monster onmiddellijk voordat metingen met behulp van flowcytometrie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol hier gepresenteerde zal opleveren tussen 2200 ± 615 (gemiddelde ± SEM, huid van gezonde vrijwilligers) tot 178.000 ± 760 (gemiddelde ± SEM, letselhuid van psoriasis patiënten) levensvatbare lymfocyten van menselijke huid bij het gebruik van een enkele 4 mm huid biopsie.
Verschillende typen CD45 + cellen werden in enkel-celsuspensies afgeleid van huid van gezonde personen, waaronder CD4 + T-cellen (~ 45%), CD8 + T-cellen (~ 30%) en CD11c + DCs (~ 5% ), terwijl het aantal B-cellen (CD19 +), NK-cellen (CD56 + CD3 -), of monocyten / macrofagen (CD14 + of cd1c +) werden waargenomen (Figuur 1A). De methodologie maakt ook de analyse van CD4 + CD25 + Foxp3 + cellen in humane huid biopten. Via intracellulaire kleuring na fixeren en permeabilisatie, is het mogelijk om expressie van de transcriptie fac tonentor Foxp3 in CD25 + T-cellen (Figuur 1A).
Enkelvoudige celsuspensies afgeleid van menselijke huid biopten toonde een hoge autofluorescentie achtergrond in FL1 (FITC), FL2 (PE), FL3 (ECD), FL9 (Pacific Blue) en FL10 (chrome orange) kanalen met een cytometer (data niet getoond) . Voor een goede analyse van de lymfocyt bevolking, we raden daarom het gebruik van een anti-humaan CD45 mAb geconjugeerd met een Brilliant Violet 421 fluorochroom voor gating van de lymfocyt bevolking en uitsluiting van de autofluorescente cel populatie (Figuur 1B). De meeste resident cellen in humane huid werden CD3 + T-cellen (Figuur 1C). Voor de levensvatbaarheid van de cellen analyse is het raadzaam om een opgelapt levensvatbaarheid kleurstof gebruiken levensvatbaar te onderscheiden van dode / stervende cellen (figuur 1C). Normaal gesproken is dit protocol resulteert in 65,3% ± 7.7 (gemiddelde ± SD) levensvatbare cellen. Voor verdere analyse van flowcytometrie data is AdvisEd hek aan de levensvatbare celpopulatie omdat dode of stervende cellen verliezen hun celmembraanintegriteit en kan niet-specifiek binden geconjugeerd antilichaam, waardoor achtergrondkleuring verhogen.
T-cellen geïsoleerd door dit protocol zijn zeer geschikt voor verdere functionele analyse. Via een 4 mm biopsie van letselhuid van psoriasispatiënten werd aangetoond dat de biopsie afgeleide T-cellen die IL-17A en IFNy na 4 uur stimulering met PMA / ionomycine in aanwezigheid van Brefeldine A (figuur 2).
Vers bereide eencellige suspensies van huid betrokken psoriatische huidletsels kan ook worden gebruikt voor verdere ex vivo celkweek en daaropvolgende functionele analyse. Na expansie na polyklonale stimulatie met anti-CD3 / anti-CD28 mAb-beklede microkorrels in aanwezigheid van de pro-inflammatoire cytokines IL-1β of IL-23 gedurende 8 dagen kunnen de cellen bijvoorbeeld worden geanalyseerd op hun cytokine productie capaciteit (figuur 3). Hierdoor een duidelijk verschil tussen de cytokine producerende vermogen van cellen afkomstig van huid van gezonde individuen en psoriasis waargenomen. T-cellen van psoriatische personen toonden een veel hogere capaciteit om de psoriasis geassocieerde cytokinen IL17A en IFNy produceren. Dit houdt in dat zelfs na ex vivo kweken een prototype psoriasis cytokine fenotype behouden, afwezig bij gezonde controles.
Figuur 1:. Verschillende soorten leukocyten geïdentificeerd in eencellige suspensies verkregen uit huid van gezonde individuen Skin resident lymfocyten geïsoleerd volgens de in de tekst beschreven protocol werden gekleurd met het fluorochroom-geconjugeerde mAbs plaats plus fixable levensvatbaarheid kleurstof en onmiddellijk geanalyseerd door flowcytometrie. (A) Flow cytometric detectie van de monocyten (CD14), DCs (CD 11 c), B-cellen (CD19), NK-cellen (CD56 + CD3 -), CD4 +, CD8 + en CD25 + Foxp3 + subsets in de huid aanwezige lymfocyten. Anti-menselijke CD45 / BV421 mAb onderscheidt lymfocyten uit autofluorescente cellen. De gating strategieën voor CD45 + cellen wordt getoond in (B). (C) Percentage levensvatbare CD45 + CD3 + T-cellen na isolatie. Nummer toont het percentage positieve cellen. Een representatief experiment uit drie verschillende experimenten / donoren wordt getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: T cellen afkomstig van letselhuid van psoriasis patiënten produce IL-17A en IFNy. Een enkele 4 mm huid biopsie werd genomen uit het letselhuid van psoriasis patiënt op mondeling of schriftelijk toestemming voor wetenschappelijk gebruik. De huid resident T-cellen werden geïsoleerd volgens de in de tekst beschreven protocol. Productie van IL-17A en IFNy door skin resident T-cellen. Intracellulaire accumulatie van cytokinen als reactie op 4 uur stimulering met PMA / ionomycine in aanwezigheid van Brefeldine A werd gemeten door stroming cytometrie. Percentage cytokine-positieve cellen getoond. Gegevens van drie verschillende patiënten worden getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Skin-resident T-cellen zijn in staat om IL-17A en IFNy volgende ex vivo te produceren
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we een protocol om de huid aanwezige T-cellen uit menselijke huid biopten efficiënt isoleren. Het voordeel van dit protocol is de isolatie van relatief grote aantallen levensvatbare lymfocyten en expressie relevant oppervlaktemerkers. De cel subsets geïdentificeerd waren: CD 11 c + DCs, CD4 + en CD8 + T-cellen en CD25 + Foxp3 + cellen. Belangrijk is dat ex vivo cultuur van geïsoleerde huid resident T-cellen was zeer goed haalbaar en liet voor verdere functionele analyse.
Menselijke huid kan in enkele-celsuspensies worden gedissocieerd door het combineren van mechanische dissociatie met enzymatische afbraak van de extracellulaire adhesie eiwitten die functioneren om de structurele integriteit van weefsels behouden. Hoewel dispase gebaseerde laag scheiding van de epidermis en dermis is een veel gebruikte methode om infiltratie in deze respectieve huidlagen te bepalen, merkten we dat dispase behandeling leidde to een aanzienlijke vermindering van celoppervlakexpressie van CD25 en CD27 (niet getoond). Aangezien deze markers zijn belangrijk voor lymfocyten subsets te karakteriseren, zijn wij van mening dat dispase behandeling beïnvloedt latere immunofenotypering. Het is niet waarschijnlijk dat de verwijdering van de dermis is verantwoordelijk voor de waargenomen vermindering van CD25 of CD27 tot expressie brengen, aangezien huid van gezonde individuen de meeste T-cellen is gelokaliseerd in de dermis terwijl minuut T-cel aantallen in de epidermis 10 zijn -12. Het nadelige effect van dispase op het vermeerderingsvermogen van geïsoleerde keratinocyten is eerder 13 vermeld. Daarom is verstandig gebruik van dispase geboden wanneer celfunctie is het doel van de studie. In ons protocol hebben we gebruik gemaakt van het type Collagenase ik enkele celsuspensie van de huid biopten te verkrijgen. Hoewel Collagenase I heeft hoge tryptische activiteit vergeleken met Collagenase IV en is dus harder, hebben we dit Collagenase gekozen omdat het is tested om zijn geschiktheid voor celkweek. Het gebruik van een Collagenase IV die geschikt is voor celcultuur zou in de toekomst stap onze huidige protocol verder te optimaliseren.
Vanwege de aard, de huid is zeer goed bestand tegen trekkrachten en mechanische disaggregatie. Tot nu toe heeft een uitgebreide analyse van de immuuncellen in de menselijke huid belemmerd door technische uitdagingen in voldoende aantal cellen te verkrijgen bij het gebruik van een relatief agressieve spijsvertering protocollen. Bijgevolg meeste studies toe gepubliceerde afhankelijk immunohistochemische analysen. De directe isolatie van CD4 + T-cellen van huidbiopsies wordt algemeen als omslachtig. Een alternatief zou zijn het gebruik van de huid explantatie kruipen culturen 10. Echter, deze 2-3 weken van de cultuur, en de huid explantatie kweekmedium bevat een set geselecteerde van cytokines en chemokines, wat kan leiden tot preferentiële kruipen uit specifieke T-cel subsets. Naast de kweekperiode kunnen affect het fenotype van de cellen. Het huidige protocol gebruikt geen toegevoegde cytokines of chemokines, en expressie van CD4 (en ook andere celmerkers) is goed bewaard gebleven na de isolatie, waardoor zowel fenotypische en functionele studie van T cel populaties direct na isolatie maken.
Een commercieel beschikbare geautomatiseerde weefsel dissociator wordt gebruikt voor de dissociatie van huidfragmenten vóór de incubatie met collagenase, nodig voor de afbraak van de extracellulaire matrix. Voor de daaropvolgende afgifte van de cellen uit de extracellulaire matrix, wordt de automatische dissociator opnieuw gebruikt. Hoewel uitgebreide handleiding snijden van de huid vergelijkbaar aantal cellen kan opleveren (gegevens niet getoond), de resultaten zijn minder consistent en zijn meer afhankelijk van de ervaring van de uitvoerder. Dissociatie van de huid met behulp van vooraf gedefinieerde procedure die door het instrument meer reproduceerbare resultaten. In overeenstemming met eerdere studies waaruit blijkt dat de huid bevat verschillende leukocytes subsets 2,14, CD 11 c + DCs, CD8 + en CD4 + T-cellen en Foxp3 + cellen waargenomen in enkele-celpopulaties bereid volgens de hier gepresenteerde protocol. Belangrijker is het protocol levert een relatief hoge opbrengst van levensvatbare lymfocyten. Gevolg van de efficiëntie van het protocol, bijzonder nuttig bij het bestuderen patiënt materiaal, waarbij vaak slechts een 4 mm huidbiopsie worden verkregen. Volgens de werkwijze, konden wij aantonen dat T-cellen geïsoleerd uit de letselhuid van psoriasis patiënten een groter vermogen om IL-17A en IFNy produceren dan gezonde huid 9.
Afhankelijk van de vraagstelling, kan het nodig zijn om bepaalde cel subsets verder zuiveren na de bereiding van enkelvoudige celsuspensies. In dit geval kunnen grotere stukken huid worden gebruikt om de opbrengst voldoende cellen te waarborgen voor subgroep analyses. Wanneer u dit doet, zorg ervoor dat de huid in kleinere pi moet worden gesnedenECES van ongeveer 2 mm x 2 mm alvorens de isolatieprotocol.
Kortom, de huidige protocol biedt een betere manier om de huid inwoner cellen te isoleren, het vergemakkelijken van zinvolle fenotypische en functionele analyse op een enkele cel niveau, waardoor ons inzicht in de huid immuunrespons te verbeteren.
Kritische stappen in het huidige protocol zijn de juiste verwijdering van het onderhuidse vetweefsel en het snijden van de huid in kleinere stukken, in het bijzonder bij de verwerking van meer dan één biopsie een dissociatie buis. Vetweefsel en / of grote stukken weefsel zal de dissociator op ongepaste wijze te werken, vraagt om re-runs. Dit ernstig zal schaden levensvatbaarheid van de cellen. De beperking van de techniek is dat aantal cellen afkomstig van één 4 mm huidbiopsie onvoldoende voor daaropvolgende isolatie van subsets van cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Huid biopten van psoriasis patiënten werden vriendelijk verschaft door Dr. Andreas Koerber (afdeling Dermatologie aan de Universiteit van Essen, Duitsland) na mondeling dan wel schriftelijk toestemming voor wetenschappelijk gebruik.
XH wordt ook ondersteund door NSFC 61263039 en NSFC 11.101.321.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposable Biopsy Punch | Kai Europe | BP-40F | 4 mm |
| Disposable sterile scalpels | Dalhausen | 1100000510 | |
| gentleMACS C tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | Blue-capped, used as the dissociation tube. |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy. |
| Cell strainer | BD | 352350 | 70 µm nylon |
| 96-well U-bottom plate | Greiner Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 22409-015 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Human Pooled Serum (HPS) | in house prepared | ||
| Collagenase I | Sigma-Aldrich | C2674 | Type 1-A, suitable for cell culture |
| DNase I | Calbiochem | 260913 | |
| PBS | B Braun | 3623140 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503-500G | |
| Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 | eBioscience | 65-0865-18 | Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1,000 |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Permeabilization Buffer (10x) | eBioscience | 00-8333-56 | |
| BV421 Mouse anti-human CD45 | BD | 563879 | Clone: HI30; dilution factor 1:50 |
| FITC Mouse anti-human CD14 | Dako | T0844 | Clone: TUK4; dilution factor 1:50 |
| PE Mouse anti-human CD56 | Dako | R7127 | Clone: MOC-1; dilution factor 1:50 |
| ECD Mouse anti-human CD3 | Beckman - Coulter | A07748 | Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining. |
| PC5.5 Mouse anti-human CD4 | Beckman - Coulter | B16491 | Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD11c | Beckman - Coulter | A80249 | Clone: BU15; dilution factor 1:50 |
| APC Mouse anti-human CD1c | Miltenyi Biotech | 130-090-903 | Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10 |
| APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 | Beckman - Coulter | A66332 | Clone: B9.11; dilution factor 1:400 |
| APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 | Beckman - Coulter | A94681 | Clone: J3-119; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD25 | eBioscience | AD5-8E7 | Clone: BC96; dilution factor 1:50 |
| PE Rat anti-human CLA | Miltenyi Biotech | 130-091-635 | clone: HECA-452; dilution factor 1: |
| eFluo450 Rat anti-human Foxp3 | eBIoscience | 48-4776-42 | Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A | eBioscience | 53-7179-42 | Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human IFNg | eBioscience | 25-7319-41 | Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400 |
| Flow-Count Fluorospheres | Beckman - Coulter | 7547053 | Counting beads, for flow cytometry |
References
- Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
- Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages. J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).
- Gebhardt, T., et al. Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus. Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).
- Boyman, O., et al. Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med. 199, 731-736 (2004).
- Christophers, E., Mrowietz, U. The inflammatory infiltrate in psoriasis. Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).
- Jiang, X., et al. Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity. Nature. 483, 227-231 (2012).
- Havran, W. L., et al. Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).
- Campbell, J. J., et al. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans. J Immunol. 166, 877-884 (2001).
- He, X., et al. Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production. J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).
- Clark, R. A., et al. A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin. J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).
- Clark, R. A., Kupper, T. S. IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin. Blood. 109, 194-202 (2007).
- Keijsers, R. R., et al. In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17. J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).
- Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).
- Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).
