Summary
Her præsenterer vi en protokol til at generere manipuleret væv fartøj podninger, der er funktionelle til podning i mus ved at dobbeltklikke såning delvist induceret pluripotente stamceller (PiPSC) - afledt glatte muskelceller og PiPSC - afledte endotelceller på en decellulariserede fartøj stillads bioreaktor.
Introduction
Opførelsen af vaskulære ledninger er en grundlæggende strategi for kirurgisk reparation af beskadigede og sårede fartøjer som følge af hjerte-kar-sygdomme. Til dato, graft materialer i kirurgi omfatter biokompatible syntetiske polymerer (polytetrafluorethylen [Teflon], ekspanderet polytetrafluorethylen [ePTFE, Gore-Tex] eller polyethylenterephthalat [Dacron]), allografter, autolog væv (hjertesækken eller saphenavene) og xenotransplantater 1. Mens kunstige transplantater (f.eks Gore-Tex og Dacron) er mest almindeligt anvendte, disse materialer sandsynligvis forårsage mange kort- og langsigtede komplikationer, der omfatter stenose, calcium deposition, thrombo-embolisering og infektioner. Selv patienter med biologiske transplantater stede med nedsat tromboemboliske hændelser, de stadig støder på begrænsninger, såsom sekundær graft svigt og forkortet holdbarhed på grund af forkalkning nedbrydning 2. På trods væsentlige forbedringer i kirurgisk techniques årenes løb, forskere og klinikere er stadig tynget af behovet for at identificere den ideelle kanal for vaskulære sygdomme. For nylig er området for vaskulære tissue engineering forskning frembragt et koncept, hvor cellerne er indarbejdet i bionedbrydelige stilladser, med det formål at skabe en biomimetisk miljø, der er indbegrebet af en funktionel fartøj for vellykket podning 1. Grundlæggende succes de vaskulære konstruktioner afhænger af tre væsentlige komponenter; celler, der omfatter stilladset, dvs. en endotelcelle indre lag og en glat muskelcelle lag, et stillads, der indeholder den passende ekstracellulære matrix for at tilvejebringe mekaniske egenskaber kan sammenlignes med det native vaskulatur, og den molekylære / cellulære signalering, der kræves til initiering / regulering reparation.
Langsigtet graft åbenhed og vedvarende udvikling af de neo-væv er meget afhængige af effektiv celle såning af stilladser, thereby gør afgørelsen af celletype af afgørende betydning. Adskillige rapporter demonstrere brugen af modne endothel og glatte muskelceller fra forskellige kilder til at udvikle ledninger med lille diameter 3-6. Selvom lovende, at manglen på tilstrækkelige autologe fartøjer opnå modne endotel og glatte muskelceller fortsat en betydelig byrde. For nylig er stamceller fra forskellige kilder er blevet udnyttet for vaskulære vævsdyrkningsapplikationer. Faktisk, en række stamceller celletyper, herunder embryonale stamceller 7, inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) 8,9, PiPSC 10,11, knoglemarv-afledte mononukleære celler 12, mesenchymstamceller 13, endotel stamceller og voksne fartøj væg afledt stamcelle antigen-1 (Sca-1) + stamceller / progenitorceller 14,15 har alle vist sig at være i stand til differentiering til enten funktionel endotel- eller glatte muskelceller som reaktion på definerede medier ogdyrkningsbetingelser. Endvidere ubegrænset kapacitet af stamcellerne selvfornyelse gøre dem bedre kandidater modsætning modne endotel og glatte muskelceller, som kun kan dele sig et begrænset antal gange før undergår vækststandsning og ældning.
Udvælgelsen af stillads materiale til at generere vellykket manipuleret væv fartøj til podning afhænger af flere faktorer, såsom biokompatibilitet, biomekaniske egenskaber, og bionedbrydningshastigheden. Grundlæggende materialer anvendes til at skabe stilladser for podninger skal være biologisk nedbrydelige og vil ikke montere unødvendig modtager immunreaktioner. Derudover skal det omfatte en passende porøsitet og mikrostruktur for cellebinding og efterfølgende overlevelse. Til dato er de mest almindelige materialer, der anvendes til stilladser i karvæv engineering omfatter polymerer af polyglycolsyre, polymælkesyre og poly ε-caprolacton 16. For nylig decellulariseret biologiske materialer harogså blevet anvendt med en vis succes. Adskillige laboratorier har vist, at såning decellulariserede menneske, hunde eller svin fartøjer med autologe celler gav et biologisk implantat, der modstod koagulation og intimahyperplasi 17-19. Andre strategier i karvæv engineering omfatter ekstracellulære matrixproteiner-baserede karimplantater fx, såning celler i fibringel 13 og genererer celle plader uden stillads support 20, 21.
Den nuværende protokol viser differentiering af humane PiPSC i funktionel endotel og glatte muskelceller, frembringelsen af en bioreaktor, der består af en decellulariseret fartøj stillads til havnen funktionelle PiPSC-afledte vaskulære celler og podning af manipuleret væv fartøjer i svær kombineret immundefekt (SCID ) mus. PiPSC er en optimal celletype til brug for tissue engineering af fartøjets transplantater, fordi disse celler ikke danne tumorer i mus eller raise etisk ogallo-immunresponser. Vi har endvidere vist, at strategien til at generere Pips-endotelceller og Pips-glatte muskelceller er effektiv og reproducerbar 10,11. Derefter designede vi en decellulariserede fartøj til såning af PiPSC-afledte vaskulære celler til nøje efterligner de matrixproteiner, der findes inden for en indfødt beholder og dermed øge podning og overlevelse effekt. Endvidere decellularization af fartøjerne før PiPSC podning forhindrer forekomsten af inflammatoriske responser monteres ved immune celletyper såsom makrofager. Endnu vigtigere er denne protokol ikke blot repræsenterer en metode til at generere lovende vaskulære ledninger til oversættelse til mennesker, men også giver værdifulde midler til at studere og forstå de molekylære mekanismer, der styrer karvæv regenerering gennem musemodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Udfør alle dyreforsøg i henhold til protokoller godkendt af Institutional udvalg for brug og pleje af forsøgsdyr.
1. Fremstilling af Kultur Medier
- Gør kulturmedier til human fibroblast cellelinie CCL-153: F-12K medium, 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 U / ml penicillin og streptomycin.
- Gør Reprogramming Media for PiPSC generation: Knockout Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) indeholdende 20% Knockout Serum erstatning, 0,1 mM β-mercaptoethanol, 0,1 mM Minimum Essential Medium (MEM) Ikke-essentielle aminosyrer, 10 ng / ml basisk fibroblastvækstfaktor 2 (bFGF-2) og 100 U / ml penicillin og streptomycin. Tilføj bFGF-2 frisk hver gang, før du bruger medierne.
- Gør Differentiering Media (DM) for at inducere glatte muskelceller (SMC) differentiering: α-MEM-medium indeholdende 10% FBS, 0,1 mM β-mercaptoethanol, 100 U / ml penicillin og streptomycin og 25 ng / ml blodpladeafledt vækstfaktor(PDGF-ββ).
- Gør Endothelial Differentiering Media (EF-DM) for at inducere endotelcelle (EF) differentiering: endotelvækstfaktor media-2 (EGM-2) medium indeholdende 50 ng / ml vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) og 100 U / ml penicillin og streptomycin.
2. Omprogrammering humane fibroblaster i Delvist-inducerede pluripotente stamceller (PiPSC)
- Kultur human fibroblast cellelinie CCL-153 på 0,04% gelatineopløsning overtrukne kolber i dyrkningsmedium.
- Passage celler hver 3 dage ved et forhold på 1: 6. Brug celler før passage 9 for optimal effektivitet PiPSC generation. Celler er klar til transfektion ved at nå 80-90% sammenflydning.
- Linearisere polycistronisk plasmid pCAG2LMKOSimO indeholdende 4 omprogrammering faktorer octamer-bindende transkriptionsfaktor 4 (OCT4), SOX2, Kruppel-lignende faktor 4 (KLF4) og C-MYC (pCAG-OSKM). Digest 5 ug plasmid med 5 enheder Pvul restriktionsenzym i 3 timer ved 37 ° C. Rensplasmidet med et kommercielt kit ifølge producentens protokol.
- Transficere 2 x 10 6 humane fibroblaster med 4 ug lineariseret pCAG-OSKM plasmid ved elektroporering med human dermal fibroblast (NHDF) nucleofection kit ifølge producentens protokol. Frø forsigtigt transficerede celler på præ- 0,04% gelatine belagt T25 kolbe indeholdende 5 ml forvarmet Omprogrammering Media.
- Efter 24 timer, ændre medium med tilskud af 25 ug / ml neomycin at vælge en ren population af transficerede celler.
- Skift medium hver anden dag indtil dag 4.
Bemærk: Menneske fibroblaster bliver PiPSC efter 4 dages omprogrammering.
3. Differentiering af PiPSC i Endothelial og glatte muskelceller
- Seed PiPSC på collagen IV præcoatede skåle indeholdende DM i 4 dage for at inducere differentiering til SMC'er. Skift medium hver anden dag indtil dag 4.
- Seed PiPSC på collagen IV præcoatede retter containing endotel-DM i 6 dage for at inducere differentiering til endotelceller. Skift medium hver anden dag indtil dag 6.
4. decellulariserede Aorta Graft Forberedelse
Bemærk: Alle løsninger og udstyr skal være sterile.
- Sacrifice musen ved cervikal dislokation og løse musen i rygleje under dissektion mikroskop.
- Skær gennem brystbenet og omkring brystkassen for at åbne brysthulen. Fjern hjerte, lunger og spiserør at blotlægge aorta. Fjern forsigtigt peri-aorta fedt med en pincet.
- Skær aorta fra den forreste ende med en saks, og hold enden med stumpe pincet forsigtigt. Frigør aorta fra rygsøjlen kolonne bag ved stump dissektion. Luk forsigtigt alle de forgrenede arterier fra aorta ved ligering med en bipolar electrocoagulator og skæring fra den fjerne ende af ligering med en saks.
- Brug en 5 ml sprøjte til at skylle aorta lumen med 3 ml saltopløsning indeholdende 100 U heparin for at forhindre dannelse af blodpropper.
- Skær den bageste ende af aorta, før den forgrener til renal. Holde integriteten af aorta er meget vigtig under hele proceduren.
- Skyl aorta lumen med 5 ml 0,075% natriumdodecylsulfat (SDS) opløsning fortyndet i phosphatbufret saltvand (PBS).
- Soak bryst aorta i 0,075% SDS-opløsning i en 10 cm petriskål. Anbring petriskålen på en orbitalryster i 2 timer ved 150 rpm ved stuetemperatur.
- Skyl aorta lumen med 5 ml PBS.
- Soak aorta i PBS i en 10 cm petriskål. Anbring petriskålen på den orbitale omryster i 2 timer ved 150 rpm ved stuetemperatur. Opdater PBS hver 20 min.
- Skyl aorta lumen med 5 ml PBS.
- Hold decellulariseret aorta graft i PBS ved 4 ° C i op til en uge.
5. Dual Såning af PiPSC og bioreaktor Conditioning
Bemærk: Alle løsnings og udstyr skal være sterile. Udfør alle operationer i en vævskultur hætte.
- Saml bioreaktoren flow kredsløb som illustreret i figur 1. Tilslut rugekammeret, media reservoir, peristaltisk pumpe og overholdelse kammer med slangen. Minimal volumen af medium nødvendig for cirkulation er 40 ml.
- Pre-tilstand den decellulariserede fartøj med dyrkningsmedium ved opblødning aorta i medium DM i en 10 cm petriskål. Anbring petriskålen på orbitalryster i 1 time ved 50 rpm ved stuetemperatur.
- Sæt 1 cm længde Nylon rør (OD 0,9 mm, ID 0,75 mm) i begge ender af decellulariserede beholder under mikroskop. Bind skibet og rørene med 8-0 silkesuturer.
- Saml decellulariserede aorta graft i rugekammeret ved at forbinde nylon rør med indgangs- og udgangsportene (1/32 "slanger) fra kammervæggen. Vedligehold inkubation kammer med 5 ml af medium hver gang.
- Trypsinisér PiPSC ved at tilføje forvarmettrypsin til dækning dyrkningsskålen og forsigtigt rock skålen 10 gange. Kassér trypsin og lad fadet i kuvøse til 2 - 3 min. Tilføj forvarmet dyrkningsmedium i skålen og bland mediet med cellerne.
- Tæl celle nummer ved hjælp af et hæmocytometer. Centrifuge to portioner af cellesuspensioner indeholdende 5 x 10 5 celler hver i 5 minutter ved 300 x g. Aspirer supernatanten fuldstændig.
- Efter opsugning af supernatanten fuldstændigt, opblande 1 pellet af Pips cellepelleter i 50 pi DM. Denne celle suspension injiceres ind i de decellulariserede fartøj lumen.
- Derefter resuspender anden Pips cellepelleten i 100 pi Matrigel. Pipettere forsigtigt blandingen på decellulariserede aorta graft.
- Vent 10 - 15 min, indtil blandingen bliver til en gel-lignende tilstand og jævnt omslutter fartøjet ydre overflade. Fyld rugekammeret med DM.
- Anbring hele bioreaktoren indstilling i en 5% CO 2-inkubator ved 37 ° C. Manuelt rotere decellulariserede graft 90 ° omkring længdeaksen hver halve time i de første 2 timer.
- Hold statisk kultur i 12 timer for at aktivere celleadhæsion.
- Levere DM gennem lumenet af den peristaltiske pumpe til at inducere glatmuskel celledifferentiering. Start indledende strømningshastighed på 5 ml / min, og trinvis stigning til 20 ml / min i løbet af 24 timer.
- Hold cirkulerende medium strømningshastighed på 20 ml / min i 24 timer.
- Stop mediestrøm og flytte bioreaktoren indstilling af inkubatoren.
- Re-frø lumen af transplantatet med PiPSC. Trypsinisér, tælle og centrifuger 1 x 10 6 PiPSC som i trin 5,5-5,6. Resuspender cellerne i 50 pi EGM-2 medium indeholdende 50 ng / ml VEGF. Injicer celleblandingen ind i lumen af transplantatet.
- Skift medium i rugekammeret og hele omløb til EGM-2 medium indeholdende 50 ng / ml VEGF til at inducere endotel differentiering.
- Flyt bioreaktoren indstillingen tilbage til the inkubator. Manuelt dreje implantatet 90 ° hver 30 min i de første 2 timer og derefter holde en statisk kultur i 12 timer.
- Start cirkulerende strøm fra 5 ml / min, og trinvis stigning til 35 ml / min. Hold strømningshastighed på 35 ml / min i 5 dage. Skift cirkulerende og kammer medium hver anden dag.
- Harvest manipuleret graft for yderligere podning til mus.
6. podning af Double-seedede PiPSC Graft i mus
- Brug NOD.CB17-Prkdc SCID / NcrCrl hanmus som fartøj graft modtagere. Sørg altid for, at musene er omkring 10 uger gammel, vejer ca. 25-35 g, og er i gode sundhedsmæssige forhold.
- Bedøver modtager mus ved indgivelse af en kombination af Hypnorm (25 mg / kg) og Hypnovel (25 mg / kg) intraperitonealt. Anvend vaseline oftalmologiske salve på øjne for at forhindre tørhed, mens under anæstesi. Bekræft effektiv bedøvelse ved at sikre, at mus har afslappede muskler og trækker vejret støt.
- Fastgør mus i rygleje med halsen barberet og udvidet. Indgives atropinsulfat (1,7 mg / kg) i kombination med anæstetika at sikre, at musen luftvejene forbliver klar.
- Forbered en midtlinieincision fra underkæben til brystbenet med musen. Under et dissektionsmikroskop med 5- til 10-fold amplifikation løfte de rigtige spytkirtler sideværts og fjerne højre cleidomastoid muskel at eksponere den højre, fælles carotidarterie.
- Fjern forsigtigt knyttet væv at mobilisere den højre carotis arterie fra den distale ende mod den proksimale ende. Ligere den midterste del af den fælles halspulsåre to gange med en 8-0 silkesutur og dissekere mellem de to bånd.
- Passere gennem en manchet lavet af autoklaverbart nylon rør i hver beholder ende og fastgør hver ende med microhemostat klemmer.
- Fjern sutur slips den ene ende og en dråbe af heparin (100 U / ml). Umiddelbart efter, vendes den distale ende af the arterie for at dække hele manchet kroppen og løse den omvendte fartøj med en 8-0 silkesutur til manchetten.
- Gentag den samme procedure til den anden del af arterien. Flush arterie med saltopløsning for at fjerne blodpropper.
- Implantere en decellulariseret fartøj graft mellem to ender af halspulsåren ved at skubbe decellulariserede fartøjets ender af de over arterie manchetter og fastsættelse det med 8-0 silkesuturer. Fjern vaskulære klemmer fra enten slutter før evaluere pulsering af transplantatet.
- Placer højre spytkirtel tilbage til sin oprindelige position. Luk huden på det kirurgiske sted med en afbrudt sutur under anvendelse af en 6-0 polyglactin sutur.
- Konsekvent observere vitale tegn på mus efter indgrebet er afsluttet, indtil den genoptager bevidsthed. Sacrifice recipientmus ved cervikal dislokation og høst fartøj transplantater enten 24 timers eller 3 uger senere til yderligere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den vellykkede generation af PiPSC blev bekræftet 4 dage efter nucleofecting humane fibroblaster med et lineariseret pCAG2LMKOSimO plasmid, der bærer 4 transkriptionsfaktorer, Oct4, Sox2, KLF4 og c-myc (OSKM). PiPSC viste en markant forskellig fænotype sammenlignet med fibroblaster (figur 2A) og udtrykt 4 omprogrammeringsbeslutninger faktorer på mRNA (figur 2B) og protein (figur 2C) niveauer 10. Effektiviteten af et PiPSC baseret kartransplantat er stærkt afhængig af evnen af PiPSC til at differentiere til både endotelceller og glatte muskelceller afstamninger. Det er derfor afgørende at bekræfte disse egenskaber PiPSC in vitro ved at differentiere cellerne i definerede medier før udnytte dem til at generere fartøjets transplantater. Figur 3 viser kapacitet PiPSC at differentiere i funktionelle endotelceller både genet (figur 3A) og protein ( Figur 3B-D) levEls baseret på endotel-specifikke markører 10. Tilsvarende PiPSC er også i stand til at differentiere til den glatte muskulatur afstamning som reaktion på specifikke medier (figur 3E-H) 11.
Hele aorta decellularization blev opnået ved behandling med SDS, et anionisk detergent, der lyserer cellerne og solubiliserer cytoplasmiske komponenter. Efter 2 timer af behandlingen, den decellulariserede aorta optrådte som en gennemskinnelig acellulær stillads sammenlignet med en frisk høstet aorta (figur 4A-B) 22. Histologisk evaluering i figur 4C-F illustrerer fravær af kerner eller cytoplasmatisk farvning i decellulariseret skibe, men ikke i normale mus aorta. Efter dobbelt podning af PiPSC afledt endotel og glatte muskelceller inden decellulariseret aorta, de manipulerede vaskulære transplantater vise endotel- og glatte muskelceller egenskaber hhv. Hematoxylin og eosin (HE) farvning af dobbelt-seeded transplantater viste en arkitektur, der svarer til native fartøjer (figur 4G) med flere lag af glatte muskelceller og et monolag af endothelceller, som bekræftet ved positiv farvning for glat muskulatur-22α (SM22), glat muskel-α actin (SMA) , CD31 og CD144 markører (figur 4H-M) 11.
For at bekræfte åbenheden af manipuleret væv fartøjer in vivo, blev de dobbelte podede PiPSC-afledte fartøjer podet i mus - både normal mus og decellulariseret arterier blev anvendt som kontroller. Efterfølgende analyse viste, at mens mus podet med decellulariserede fartøjer præsenteret med markant højere dødelighed så tidligt som dag 1, PiPSC fartøj transplantater tillægges en overlevelsesrate på 60% 3 uger efter transplantation (figur 5A) 11. Derudover blev 3 uger gamle PiPSC-afledte transplantater fuldt karakteriseret for tilstedeværelsen af human PiPSC afledt endotel og glatte muskelceller og vært makrofaginfiltration (figur 5B og tabel 1) 11. Tilsammen resultater viser, at PiPSC har kapacitet til at differentiere til både vaskulære slægter og er potente til at generere funktionelle væv manipuleret fartøjer, der kan erstatte native fartøjer in vivo.
Figur 1. Skematisk repræsentation af decellulariserede graft bioreaktor strømningskredsløbet. Den decellulariserede fartøj graft samles i rugekammeret. En peristaltisk pumpe er i opstrøms rugekammeret at tilvejebringe stabil medium perfusion flow. Medierne reservoir er i nedstrøms rugekammeret. Overensstemmelsen kammer er at forbedre flow regime. Strømmen retning er angivet med pile.large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2. Generering af PiPSC fra humane fibroblaster. Humane fibroblaster blev nucleofected med enten fire omprogrammering gener (OCT4, SOX2, KLF4 og C-MYC) eller en tom vektor (kontrol). (A) fasekontrast billeder viser morfologi Pips efter 4 dage. PiPSC udtrykte alle fire transkriptionsfaktorer både på mRNA (B) og protein (C) niveauer. Scale bar for billeder vist er 50 um og data er gennemsnit ± SEM (n = 3); * P <0,05, *** p <0,001. Dette tal er blevet ændret fra Margariti, A. et al. 10 Klik her for at se en større udgave af dette tal. </ A>
Figur 3. PiPSC kan differentiere til både endotelceller og glatte muskelceller. PiPSC eller kontrolceller blev differentieret i endotelceller. (A) i sammenligning med kontrolceller, PiPSC-afledte endotelceller udtrykt endotelceller-specifikke markører, såsom CD31, CD144, kinase insert-domæne receptor (KDR), endotel nitrogenoxidsyntase (eNOS) og von Willebrand faktor (vWF) på mRNA niveau. (B) Dette blev bekræftet på proteinniveauet hjælp western blot analyse. (C) Immunfluorescensfarvning angivet positiv farvning af CD144 (VE-cadherin) i PiPSC-endotel, men ikke kontrol-celler. (D) Flowcytometrisk analyse bekræftede PiPSC-endotelcelle ekspression af CD31 og CD144. Collagen IV-seedede PiPSC (eller kontrol celler) blev også differentieret iglatte muskelceller. (E, F) I modsætning til kontrolceller, PiPSC-afledte glatte muskelceller udtrykt glat muskel-specifikke markører på genniveau, herunder SMA, calponin, SM22, glat muskel myosin tung kæde II (SMMHC), serum responsfaktor (SRF) , myocardin, smoothelin, elastin og kollagen 1A1. (G) ekspressionsniveauer af SMA, calponin og SM22 i PiPSC-afledte celler blev bekræftet ved hjælp af Western blot analyse. (H) Immunfluorescensfarvning anvendelse konfokal mikroskopi viste en typisk glatte muskulatur markør farvning for calponin og SM22. Data repræsenterer middelværdier ± SEM (n = 3); * P <0,05, ** P <0,01, *** p <0,001. Scale bar for viste billeder er 25 pm eller 50 pm. Disse tal er blevet ændret fra Margariti, A. et al. 10 og Karamariti, E. et al. 11 Venligstklik her for en større version af dette tal.
Figur 4. generation af dobbelt-seedede PiPSC-afledte manipuleret væv kartransplantater. (A, B) Decellularization af mus thorakalaorta bevaret sin struktur og stadig lignede en normal beholder, oprindelig forstørrelse 2X. (CF) HE-farvning af decellulariserede aorta bekræftet vellykket decellularization og fuldstændig fjernelse af celler, når sammenlignet med kontroller, oprindelig forstørrelse: 50X eller 200X. (G) HE-farvning af PiPSC afledt endotel og glatte muskelceller dobbelt-podede fartøjer afslørede en arkitektur, der svarede til en nativ fartøj. (J, M) Dobbelt-seedede PiPSC manipuleret væv fartøjer farvet positive for endotel (CD31 og CD144) og glatte muskelceller (SM22 og SMA) markører modsætning decellularized fartøj podninger. (H, K) Samtidig ekspression af vaskulære markører samt den karakteristiske morfologi og lokalisering af PiPSC afledt endotel og glatte muskelceller inden mediale og intimale områder var sammenlignelig med native fartøjer. Scale bar for viste billeder er 50 um. Disse tal er blevet ændret fra Tsai, T. et al. 22 og Karamariti, E. et al. 11 Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. Dobbeltklik seedede PiPSC-afledte manipuleret væv vaskulære transplantater er patent på at erstatte indfødte fartøjer in vivo. PiPSC-afledte fartøjer blev podet ind i halspulsåren af svær kombineret immundefekt (SCID) mus, normal mouSE og decellulariseret arterier blev anvendt som kontroller. (A) Analyse af mus podet med PiPSC-afledte skibe viste 60% overlevelsesrate 3 uger efter operationen, mens mus podet med decellulariserede fartøjer præsenteret med markant højere dødelighed og lavere overlevelse (20%). Data repræsenterer middelværdier (n = 10). (B) De væv-manipuleret fartøjer blev også høstet 3 uger efter podning og udsat for HE (venstre paneler) eller immunofluorescensfarvning (højre paneler) for tilstedeværelsen af humant CD144 og calponin eller mus CD11b / CD18 (Mac-1); kvantificering af farvning er sammenfattet i tabel 1. Original forstørrelse til viste billeder er 400X medmindre andet er angivet. Dette tal er blevet ændret fra Karamariti, E. et al. 11 Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| Positive celler Field (40X) | Udviklet-skib før podning | Udviklet-fartøj graft (3 uger) |
| calponin | 72 ± 9 | 22 ± 11 * |
| CD144 | 20 ± 8 | 5 ± 6 * |
| Mac-1 | 0 | 71 ± 11 * |
Tabel 1. Karakterisering af væv-manipuleret fartøjer 3 uger efter podning. Antallet af PiPSC-afledte endotelceller og glatte muskelceller og værten makrofager blev kvantificeret efter immunfluorescensfarvning med human calponin, humant CD144 og mus Mac-1 hhv. Dataene repræsenterer gennemsnit ± SEM (n = 6); * P <0,05, signifikant forskel fra væv-manipuleret skibe før podning. Denne tabel er blevet ændret fra Karamariti, E. et al. 11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuværende protokol viser en lyd, hurtig, enkel, effektiv og reproducerbar strategi, hvor funktionelle manipuleret væv fartøjer kan genereres ved hjælp PiPSC fra humane fibroblaster. Denne teknik er et værdifuldt redskab til regenerativ medicin, tissue engineering og potentielt patient-specifikke celleterapi i den nærmeste fremtid. Kritiske skridt til at sikre effektiviteten af den protokol omfatter forberedelse af PiPSC, fremstilling af sterile og fuldt decellulariserede aorta transplantater, vellykket podning og differentiering af PiPSC i stilladser og opretholde sterilitet aorta transplantater i det vaskulære bioreaktor.
For at starte en vellykket generation af væv-manipuleret transplantater, er det af største vigtighed at sikre, at forberedelsen af PiPSC udføres effektivt. Protokollen har med succes "omprogrammeret" en human fibroblast cellelinje i PiPSC via nucleofection med en pCAG2LMKOSimO OSKM plasmid. Den survival af fibroblaster efter nucleofection fremført en række centrale punkter såsom brugen af høj kvalitet OSKM plasmider, plasmider af koncentrationer på mellem 500 - 1.000 ng / pl, undgå forsinkelser i podning af fibroblaster umiddelbart efter nucleofection som celler er særligt følsomme efter indførelsen af relativt store plasmider og endelig tilsætning af FGF-2, som er af afgørende betydning og bør føjes til frisklavet medier umiddelbart før brug. Derudover fandt vi, at det var afgørende at bruge celler på op til passage 9 for at undgå replikativ aldring, at sikre en effektiv 'omprogrammering' i PiPSC og efterfølgende differentiering i endotelceller og glatte muskelceller. Renheden af PiPSC kan forbedres ved valg af nucleofected celler med neomycin. Den pCAG2LMKOSimO plasmid har et neomycin-resistent gen og dermed tilsætningen af neomycin i en række af 25 ug / ml én dag efter nucleofection i 3 dage vil resultere i valget af en ren population afPiPSC. Engineer en effektiv PiPSC fartøj til podning i mus, fandt vi integritet og sterile decellulariserede aortaer at være af højeste prioritet. For at opretholde integriteten af aorta før og efter decellularization, var det nødvendigt konstant at anvende håndelag samtidig håndtering af fartøjer, som de var relativt skrøbelige og betydeligt diminutiv i størrelse. Den effektive fjernelse af perivaskulær væv og forsegling af forgrenende arterier ved hjælp af en bipolær elektro-koagulator var kritisk for at sikre efterfølgende kompetente cellepodning og for at undgå lækage af medier. På ethvert tidspunkt, sikrede vi, at alle materialer og apparater, der anvendes til at generere bioreaktoren (dvs. pincet, rør, flasker, kamre, sakse, adaptere og stik) var autoklaverbar, hvilket reducerer risikoen for bakteriel forurening og svigt af vaskulære transplantater forud for operationen .
Mens den nuværende protokol holder lovende kliniske anvendelser i kardiovaskulær diseasernes, der er et par begrænsninger, som bør forbedres i den nærmeste fremtid for yderligere at forbedre metoden. Hidtil blev OSKM transkriptionsfaktorer indført i humane fibroblaster via nucleofection. Mens denne teknik er relativt enkel og ligetil, det resulterede også i variabel transfektionseffektiviteten på forskellige eksperimentelle tidspunkter. Især kan denne uoverensstemmelse overvindes ved at indføre et yderligere trin af den førnævnte neomycin valg. Tilsvarende kunne man overveje at indføre de fire faktorer i humane fibroblaster ved hjælp af lentivirus integration, som potentielt kan øge effektiviteten af 'omprogrammering "og øge overlevelsen af celler efter infektion. Med hensyn til bioreaktoren, fandt vi, at fuldstændig decellularization af aorta kan opnås ved anvendelse af 0,075% SDS. Selv om denne teknik blev anset for at være optimal for celle fjernelse sammenlignet med andre detergenter (fx Triton X-100), kan det imidlertid forårsage potential ændringer inden for de ultra-strukturer af ekstracellulære matrixproteiner 23. Dette fænomen derfor fortjener mere effektive decellularization strategier til at minimere forstyrrelser af de associerede ekstracellulære matrixproteiner. Derudover har vi også fundet, at tykkelsen diameter og væg af decellulariserede aortaer varierer fra mus, afhængigt af deres alder, stamme og baggrund, og dermed forårsage potentielle forskelle i hastigheden af flow og shear stress i bioreaktorer og fordelingen af PiPSC efter PiPSC såning . Alt dette er endnu ikke afklaret.
Denne protokol heri beskrev generation af funktionelle manipuleret væv transplantater ved hjælp PiPSC at holde en lovende potentiale for fremtidige kliniske applikationer i stamcelleterapi for kardiovaskulær sygdom. Denne proces, som udnytter direkte omprogrammering fra en somatisk linjen (fibroblaster) til en anden (enten endotel- eller glatte muskelceller) spring pluriponer på kan være en måde at få sikre og egnede celler af interesse. Faktisk har flere protokoller blevet offentliggjort til at beskrive dannelsen af stamcellelinjer fra humane embryoner IPS-celler og voksne stamceller 24-26, som alle dog stadig rejser vedrørende spørgsmål med hensyn til deres anvendelse i klinikken. Det er nu kendt, at PiPSC ikke udvikler teratomer i SCID-mus, og dermed fjerne den bekymring for tumordannelse. Endvidere cellerne tager betydeligt kortere tid at generere, kultur og differentiere 10,11, og har vist sig at generere vellykkede og funktionelle manipuleret væv fartøjer transplantater, der er sammenlignelige med native aorta. Derfor PiPSC stede som en lovende cellekilde til behandling af patienter, der anvender personlig celleterapi, fordi fibroblaster (f.eks fra huden) kan afledes fra en bestemt person. Det decellularised fartøj på dette protokol giver et mere biomimetisk model, der giver seedede celler med en extracellular matrix protein, der er mere repræsentativ for den for en indfødt aorta 11. Disse vigtige punkter er afgørende for at sikre overlevelse, differentiering og funktionalitet seedede celler manipuleret væv fartøjer derefter. Nylig undersøgelse fra Sumitran-Holgersson og kolleger viste en vellykket repopulation af en tidligere decellulariserede illiac venegraft fra en afdød person forud for transplantation 27, således at postulere en translationel værdi af den nuværende protokol i mennesker i den nærmeste fremtid. Endvidere kan de decellulariserede fartøj transplantater udgør en god model, hvor kan vurderes rolle og adfærd andre vaskulære celletyper, der også bidrager til væv-manipuleret podninger. Dette modelsystem i mus kunne give et kraftfuldt værktøj til fremtidig lægemiddel screening og også belyse de cellulære og molekylære mekanismer, der er involveret i vaskulær stamcellebiologi. Tilsammen den nuværende protokol holder lovende værdi for dens anvendelse i Vascular tissue engineering og et gennembrud i skræddersyet medicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen modstridende økonomiske interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Fibroblasts CCL-153 | ATCC | CCL-153 | Prenatal human embryonic fibroblasts |
| ATCC F-12K Medium (Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium) | ATCC | 30-2004 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells | Life technologies (Gibco) | 12660-012 | |
| Knockout Serum Replacement | Life technologies (Invitrogen) | 10828-028 | |
| Human Basic FGF-2 | Miltenyi Biotech | 130-093-837 | |
| alpha-MEM medium | Life technologies (Invitrogen) | 32571093 | |
| Human PDGF | R&D System | 120-HD-001 | |
| Gelatin Solution 2% | Sigma | G1393 | |
| Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC) | Addgene | 20866 | |
| PvuI Restriction Enzyme | New England Biolabs | RO150S | |
| SureClean Plus | Bioline | BIO-37047 | |
| Nucelofection Kit (NHDF Kit) | LONZA | VPD-1001 | |
| Neomycin | SIGMA | G418 | |
| KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy | SCHOTT | KL 1500 LCD | Cold light illumination for stereo microscopy |
| Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800 | Nikon | SMZ800 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| 10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent | Severn Biotech | CAS 151-21-3 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Matrigel (10mg/ml) | BD | A6661 | |
| Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7 | Jepson Bolton's, Janke&Kunkel | S32-102 | |
| Masterflex L/S Digital Pump Drive | Cole-Parmer | WZ-07523-80 | |
| Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head | Cole-Parmer | EW-07519-15 | |
| Masterflex L/S large cartridges for pump head | Cole-Parmer | EW-07519-75 | |
| Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft | Cole-Parmer | WZ-96410-14 | Tubing goes through the peristaltic pump |
| 0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing | SILEX | N/A | Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber |
| Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline | Ibidi | 10829 | Adapter connect above two types of tubings |
| 1/32" Tubing, ID 0.01" (250µm) Material: PEEK | LabSmith | T-132-010P | Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing |
| One-Piece Fittings | LabSmith | T-132-100 | Fix the above tubings through the incubation chamber wall |
| Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm) | Smiths Medical | N/A | Tubings insert into two ends of the aorta graft |
| NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mouse | Charles River | ||
| Surgical sutures, 8-0 silk | ETHICON | W819 | |
| Hypnorm | Vetapharm | Vm21757/4000 | Neuroleptanalgesic for use in mice |
| Hypnovel (Midazolam) | Roche | 59467-70-8 | Induction of anaesthesia |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Nylon Tubing | Portex LTD | 800/200/100/200 | 0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff |
| Electrocoagulator | Martin | SN 54.131 | Ligation of artery branches on aorta |
| Bipolar micro hemostat forceps | Martin | 80-91-12-04 | Fixation of vessel ends |
| Vessel Dilator | S&T | JFX-7 | |
| Vessel Dilator | S&T | JFL-3dZ | |
| Vessel Dilator | S&T | D-5aZ | |
| Mini applier | AESCULAP | FE572K | |
| Micro hemostats clips | AESCULAP | FE720K | |
| Surgical sutures, 6-0 VICRYL | ETHICON | V489 |
References
- Kurobe, H., Maxfield, M. W., Breuer, C. K., Shinoka, T. Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future. Stem Cells Transl Med. 1 (7), 566-571 (2012).
- Jonas, R. A., Freed, M. D., Mayer, J. E. Jr Long-term follow-up of patients with synthetic right heart conduits. Circulation. 72, II77-II83 (1985).
- Heureux, N., et al. Technology insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts-from research to clinical practice. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, 389-395 (2007).
- Zhang, W. J., Liu, W., Cui, L., Cao, Y. Tissue engineering of blood vessel. J Cell Mol Med. 11, 945-957 (2007).
- Cearbhaill, E. D., et al. Response of mesenchymal stem cells to the biomechanical environment of the endothelium on a flexible tubular silicone substrate. Biomaterials. 29, 1610-1619 (2008).
- Gong, Z., Niklason, L. E. Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs). FASEB J. 22, 1635-1648 (2008).
- Wong, M. M., et al. Over-expression of HSP47 augments mouse embryonic stem cell smooth muscle differentiation and chemotaxis. PLoS One. 9 (1), e86118 (2014).
- Park, S. W., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells into functional CD34+ progenitor cells by combined modulation of the MEK/ERK and BMP4 signaling pathways. Blood. 116, 5762-5772 (2010).
- Samuel, R., et al. Generation of functionally competent and durable engineered blood vessels from human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 12774-12779 (2013).
- Margariti, A., et al. Reprogramming of fibroblasts into endothelial cells capacble of angiogenesis and reendothelialization in tissue-engineered vessels. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 13793-13798 (2012).
- Karamariti, E., et al. Smooth muscle cells differentiated from reprogrammed embryonic lung fibroblasts through DKK3 signaling are potent for tissue engineering of vascular grafts. Circ Res. 112, 1433-1443 (2013).
- Udelsman, B., et al. Development of an operator-independent method for seeding tissue-engineered vascular grafts. Tissue Eng Part C Methods. 17 (7), 731-736 (2011).
- Cearbhaill, E. D., Murphy, M., Barry, F., McHugh, P. E., Barron, V. Behavior of human mesenchymal stem cells in fibrin-based vascular tissue engineering constructs. Ann Biomed Eng. 38 (3), 649-657 (2010).
- Wong, M. M., et al. Macrophages control vascular stem/progenitor cell plasticity through tumor necrosis factor-α-mediated nuclear factor-κB activation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (3), 635-643 (2014).
- Wong, M. M., et al. Sirolimus stimulates vascular stem/progenitor cell migration and differentiation into smooth muscle cells via epidermal growth factor receptor/extracellular signal-regulated kinase/β-catenin signaling pathway. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (10), 2397-2406 (2013).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: State of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14, 61-86 (2008).
- Hung, H. S., Hsu, S. H. Current Advances of stem cell-based approaches to tissue-engineering vascular grafts. OA Tissue Engineering. 1 (1), 2 (2013).
- Quint, C., et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (22), 9214-9219 (2011).
- Zhang, X., Xu, Y., Thomas, V., Bellis, S. L., Vohra, Y. K. Engineering an antiplatelet adhesion layer on an electrospun scaffold using porcine endothelial progenitor cells. J Biomed Mater Res A. 97 (2), 145-151 (2011).
- Hibino, N., et al. Evaluation of the use of an induced puripotent stem cell sheet for the construction of tissue-engineered vascular grafts. J Thorac Cardiovasc Surg. 143 (3), 696-703 (2012).
- Zhao, J., et al. A novel strategy to engineer small-diameter vascular grafts from marrow-derived mesenchymal stem cells. Artif Organs. 36 (1), 93-101 (2012).
- Tsai, T., et al. Contribution of stem cells to neointimal formation of decellularized vessel grafts in a novel mouse model. Am J Pathol. 181 (1), 362-373 (2012).
- Kasimir, M. T., et al. Comparison of different decellularization procedures of porcine heart valves. Int J Artif Organs. 26 (5), 421-427 (2003).
- Stephenson, E., et al. Derivation and propagation of human embryonic stem cell lines from frozen embryos in an animal product-free environment. Nature Protocols. 7, 1366-1381 (2012).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).
- McCall, F. C., et al. Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine. Nature Protocols. 7, 1479-1496 (2012).
- Olausson, M., et al. Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study. Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).
