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Bioengineering

Génération et greffage des navires par ingénierie tissulaire dans un modèle de souris

doi: 10.3791/52565 Published: March 18, 2015
* These authors contributed equally

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour générer de l'ingénierie tissulaire greffes de vaisseaux qui sont fonctionnels pour le greffage dans des souris en double ensemencement partiellement induite sur les cellules souches pluripotentes (IPFPC) - dérivé des cellules musculaires lisses et l'IPFPC - cellules endothéliales dérivées sur une décellularisée navire échafaudage bioréacteur.

Introduction

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La construction de conduits vasculaires est une stratégie fondamentale pour la réparation chirurgicale des vaisseaux endommagés et les blessés résultant de maladies cardiovasculaires. À ce jour, les matériaux utilisés dans la chirurgie de greffe comprennent les polymères synthétiques biocompatible (polytétrafluoroéthylène [Teflon], polytétrafluoroéthylène expansé [ePTFE; Gore-Tex] ou polyéthylène téréphtalate [Dacron]), allogreffes, tissus autologues (péricarde ou la veine saphène) et une xénogreffes. Alors que les greffes artificiels (par exemple, Gore-Tex et Dacron) sont les plus couramment utilisés, ces matériaux est susceptible de causer de nombreuses complications à court et à long terme qui incluent la sténose, le dépôt de calcium, thrombo-embolisation et les infections. Bien que les patients avec des greffes biologiques présents à une diminution des événements thrombo-emboliques, ils rencontrent encore des limitations comme échec de la greffe secondaire et la durabilité raccourcie en raison de la dégradation de la calcification 2. Par conséquent, malgré des améliorations significatives chirurgicale techniques au cours des années, les chercheurs et les cliniciens sont encore accablés par la nécessité d'identifier le conduit idéal pour les maladies vasculaires. Plus récemment, le domaine de l'ingénierie tissulaire vasculaire de recherche a généré un concept dans lequel les cellules sont incorporées dans des échafaudages biodégradables, avec le but de créer un environnement biomimétique qui incarne un navire fonctionnel pour une greffe réussie. Fondamentalement, le succès des constructions vasculaires dépendent de trois composantes essentielles; cellules qui comprennent l'échafaudage, ce est à dire, une couche interne de cellules endothéliales et une couche de cellules de muscle lisse, un échafaudage contenant la matrice extracellulaire approprié pour fournir des propriétés mécaniques comparables au système vasculaire d'origine, et la signalisation moléculaire / cellulaire qui est nécessaire pour initier / régulation réparation.

Longue perméabilité du greffon à long terme et le développement durable des néo-tissus sont fortement tributaires de l'ensemencement des cellules efficace des échafaudages, eereby rendu la décision du type d'une importance critique de la cellule. Plusieurs rapports démontrent l'utilisation de endothéliales matures et les cellules musculaires lisses de diverses sources pour développer conduits de petit diamètre 3-6. Bien que prometteuse, le manque de navires autologues suffisantes pour obtenir endothéliales matures et les cellules musculaires lisses restent un fardeau considérable. Plus récemment, les cellules souches provenant de diverses sources ont été exploitées pour des applications de génie tissulaire vasculaires. Cellules mononucléaires effet, les cellules souches pluripotentes une variété de types de cellules souches, y compris les cellules souches embryonnaires 7, induite (iPSCs) 8,9, Institut 10,11, dérivées de moelle osseuse 12, les cellules souches mésenchymateuses 13, les cellules progénitrices endothéliales et les parois des vaisseaux adultes -derived cellules souches antigène-1 (Sca-1) + cellules souches / progénitrices 14,15 ont tous été démontré être capable de différenciation en cellules endothéliales soit fonctionnel ou musculaires lisses en réponse à des milieux définis etconditions de culture. En outre, la capacité d'auto-renouvellement illimité des cellules souches rendre de meilleurs candidats contrairement endothéliales matures et les cellules musculaires lisses qui ne peut diviser un nombre fini de fois avant de subir arrestation et la sénescence croissance.

Le choix du matériel d'échafaudage puissent générer des tissus succès navire conçu pour la greffe dépend de plusieurs facteurs tels que la biocompatibilité, propriétés biomécaniques, et le taux de biodégradation. Fondamentalement, les matériaux utilisés pour créer des échafaudages pour les greffes devrait être biodégradable et ne seront pas monter réponses immunitaires bénéficiaires inutile. En outre, elle doit englober une porosité appropriée pour la fixation et de la microstructure et la survie cellulaire ultérieure. À ce jour, les matériaux les plus couramment utilisés pour les échafaudages en ingénierie tissulaire vasculaire comprennent les polymères d'acide glycolique, acide polylactique, et poly ε-caprolactone 16. Plus récemment, des matériaux biologiques ont décellulariséeségalement été appliquée avec un certain succès. Plusieurs laboratoires ont montré que l'ensemencement des navires porcine humaine décellularisée, canin ou avec des cellules autologues fourni une greffe biologique qui a résisté à la coagulation et l'hyperplasie intimale 17-19. Autres stratégies en génie tissulaire vasculaire comprennent extracellulaires greffes vasculaires base-protéines de la matrice par exemple des cellules d'ensemencement en gel de fibrine et 13 feuilles de cellules générant sans le soutien d'échafaudage 20, 21.

Le protocole actuel démontre la différenciation de l'Institut humaine dans l'endothélium fonctionnel et les cellules musculaires lisses, la génération d'un bioréacteur constitué d'un échafaudage de vaisseau décellularisé pour héberger des cellules vasculaires Institut dérivés fonctionnels, et le greffage des vaisseaux de l'ingénierie tissulaire en déficit immunitaire combiné sévère (SCID ) souris. IPFPC sont un type de cellule optimale à utiliser pour l'ingénierie tissulaire des greffes de vaisseaux parce que ces cellules ne forment pas de tumeurs chez la souris ou soulèvent éthique etréponses allo-immunes. En outre, nous avons montré que la stratégie pour générer des cellules musculaires pips-cellules endothéliales et les pépins-lisses est efficace et reproductible 10,11. Par la suite, nous avons conçu un vaisseau décellularisé pour l'ensemencement de cellules vasculaires dérivés de l'Institut pour imiter étroitement les protéines de la matrice qui existent au sein d'un vaisseau natif, améliorant ainsi l'efficacité de greffage et de survie. En outre, la décellularisation des vaisseaux avant IPFPC ensemencement empêche l'apparition de réactions inflammatoires montés par des types de cellules immunitaires telles que les macrophages. Plus important encore, ce protocole ne représente pas seulement une méthodologie pour générer promettant conduits vasculaires pour la traduction dans les humains, mais fournit également des moyens précieux d'étudier et de comprendre les mécanismes moléculaires qui régissent la régénération des tissus vasculaires grâce à des modèles de souris.

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Protocol

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Effectuer toutes les expériences sur les animaux selon des protocoles approuvés par le Comité institutionnel pour entretien et utilisation des animaux de laboratoire.

1. Préparation de la Culture, des Médias

  1. Faire milieux de culture pour la lignée cellulaire de fibroblaste humain CCL-153 F-12K moyen, 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 100 U / ml de pénicilline et de la streptomycine.
  2. Assurez Reprogrammation médias pour la production de l'IPFPC: le milieu de l'aigle modifiée de Knockout Dulbecco (DMEM) contenant 20% de remplacement Knockout de sérum, 0,1 mM β-mercaptoéthanol, 0,1 mM milieu essentiel minimum (MEM) acides aminés non essentiels, 10 ng / ml de facteur de croissance des fibroblastes de base 2 (bFGF-2) et 100 U / ml de pénicilline et de la streptomycine. Ajouter bFGF-2 fraîchement à chaque fois avant d'utiliser les médias.
  3. Faire différenciation Media (DM) pour induire des cellules musculaires lisses (SMC) différenciation: α-MEM contenant 10% de FBS, 0,1 mM de facteur de croissance β-mercaptoéthanol, 100 U / pénicilline et de streptomycine et 25 ml ng / ml dérivé des plaquettes(PDGF-ββ).
  4. Assurez-endothéliale différenciation Media (EC-DM) pour induire des cellules endothéliales (CE) la différenciation: la croissance endothéliale médias 2 (EGM-2) des milieux contenant 50 ng / ml Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) et 100 U / ml de pénicilline et de la streptomycine.

2. reprogrammation des fibroblastes humains en cellules souches pluripotentes induites partiellement (IPFPC)

  1. Culture lignée cellulaire de fibroblaste humain CCL-153 à 0,04% de solution de gélatine dans des flacons revêtus de milieu de culture.
  2. Passage de cellules tous les 3 jours à un rapport de 1: 6. Utilisez cellules avant passage 9 pour une efficacité optimale de la production de l'IPFPC. Cellules sont prêtes pour la transfection en atteignant 80 à 90% de confluence.
  3. Linéariser pCAG2LMKOSimO plasmidique polycistronique contenant quatre facteurs de reprogrammation octamère-facteur de transcription liant 4 (OCT4), SOX2, facteur Kruppel-like 4 (KLF4) et C-MYC (pCAG-OSKM). Digest 5 ug de plasmide avec 5 unités de l'enzyme de restriction Pvul pendant 3 heures à 37 ° C. Purifierle plasmide avec un kit commercial selon le protocole du fabricant.
  4. Transfecter 2 x 10 6 fibroblastes humains avec 4 pg de linéarisé pCAG-OSKM plasmide par électroporation avec le kit de fibroblastes dermiques humains (NHDF) de nucléofection selon le protocole du fabricant. Ensemencer en douceur les cellules transfectées sur pré 0,04% de gélatine revêtu flacon T25 contenant 5 ml de pré-chauffé Reprogrammation médias.
  5. Après 24 h, avec des suppléments changer moyen de 25 ug / ml de néomycine pour sélectionner une population pure de cellules transfectées.
  6. Changer le milieu tous les deux jours jusqu'à ce jour 4.
    Remarque: Des fibroblastes humains deviennent IPFPC après 4 jours de reprogrammation.

3. Différenciation de l'IPFPC en endothéliales et les cellules musculaires lisses

  1. Seed IPFPC sur les plats collagène IV pré-enduits contenant DM pour quatre jours pour induire la différenciation en SMC. Changer le milieu tous les deux jours jusqu'à ce jour 4.
  2. Seed IPFPC sur le collagène IV pré-enduits plats contenant endothéliale-DM pour 6 jours pour induire la différenciation en cellules endothéliales. Changer le milieu tous les jours jusqu'au jour 6.

4. décellularisée Aorte Graft Préparation

Remarque: Toutes les solutions et les équipements doivent être stériles.

  1. Sacrifiez la souris par dislocation cervicale et fixer la souris dans une position couchée dans la dissection microscope.
  2. Couper à travers le sternum et autour de la cage thoracique pour ouvrir la cavité thoracique. Retirer le cœur, les poumons et de l'œsophage pour exposer l'aorte. Retirez délicatement la graisse péri-aorte avec une pince.
  3. Couper l'aorte de l'extrémité antérieure avec des ciseaux et tenir doucement la fin avec une pince contondants. Détachez l'aorte de la colonne de la colonne vertébrale derrière par dissection. Fermer soigneusement toutes les artères de branchement de l'aorte par ligature avec un électrocoagulateur bipolaire et la coupe de l'extrémité de la ligature avec des ciseaux.
  4. Utilisez une seringue de 5 ml pour rincer la lumière de l'aorte avec 3 ml de solution saline contenant 100 U d'héparine pour empêcher la formation de caillots sanguins.
  5. Coupez l'extrémité postérieure de l'aorte saisi branches dans le rénale. Maintenir l'intégrité de l'aorte est très important au cours de toute la procédure.
  6. Rincer la lumière de l'aorte avec 5 ml de 0,075% de dodécylsulfate de sodium (SDS) dilué dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
  7. Faire tremper l'aorte thoracique en solution SDS 0,075% dans une boîte de 10 cm de Pétri. Placer la boîte de Pétri sur un agitateur orbital pendant 2 heures à 150 tours par minute à température ambiante.
  8. Rincer la lumière de l'aorte avec 5 ml de PBS.
  9. Faire tremper l'aorte dans du PBS dans un plat 10 cm Petri. Placer la boîte de Pétri sur l'agitateur orbital pendant 2 heures à 150 tours par minute à température ambiante. Actualiser PBS toutes les 20 min.
  10. Rincer la lumière de l'aorte avec 5 ml de PBS.
  11. Gardez décellularisée greffe de l'aorte dans du PBS à 4 ° C pendant jusqu'à une semaine.

5. Double semis de l'IPFPC et bioréacteur climatisé

Remarque: Tous solutions et l'équipement doivent être stériles. Effectuer toutes les opérations dans une hotte de culture de tissu.

  1. Assembler le circuit d'écoulement du bioréacteur, comme illustré sur la figure 1. Connecter chambre d'incubation, réservoir à fluide, la pompe péristaltique et la chambre de conformité avec les tubes. Volume minimal de milieu nécessaire pour la circulation est de 40 ml.
  2. La condition préalable de la cuve décellularisé avec du milieu de culture par trempage de l'aorte dans un milieu de DM dans une boîte de Petri de 10 cm. Placer la boîte de Pétri sur l'agitateur orbital pendant 1 heure à 50 tours par minute à température ambiante.
  3. Insérer les tubes 1 cm longueur de nylon (OD 0,9 mm, 0,75 mm ID) dans les deux extrémités de l'enceinte sous microscope décellularisé. Attachez le navire et les tubes avec 8-0 sutures de soie.
  4. Assembler le greffon aortique décellularisé dans la chambre d'incubation en reliant les tubes en nylon avec les orifices d'entrée et de sortie (1/32 ") de tubes de la paroi de la chambre. Maintenir chambre d'incubation avec 5 ml de milieu à chaque fois.
  5. Trypsiniser IPFPC en ajoutant préchauffétrypsine pour couvrir la boîte de culture et de bercer doucement le plat 10 fois. Jeter la trypsine et de laisser le plat dans l'incubateur pour les 2-3 min. Ajouter milieu de culture préchauffé dans le plat et mélangez le milieu avec les cellules.
  6. Compter le nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre. Centrifugeuse deux aliquotes de suspensions cellulaires contenant 5 x 10 5 cellules chacun pendant 5 minutes à 300 x g. Aspirer le surnageant complètement.
  7. Après aspiration du surnageant complètement, remettre en suspension une pastille de The Pips culots cellulaires dans 50 pi de DM. Injecter cette suspension de cellules dans la lumière du vaisseau décellularisé.
  8. Ensuite, remettre en suspension le culot PiPS autre des cellules dans 100 ul de Matrigel. Pipetter prudemment le mélange sur la greffe de l'aorte décellularisée.
  9. Attendre 10 à 15 min jusqu'à ce que le mélange se transforme en un état de gel et se enroule autour de la surface extérieure de la cuve uniformément. Remplir la chambre d'incubation avec DM.
  10. Placer l'ensemble dans l'établissement d'un incubateur à CO2 à 5% bioréacteur à 37 ° C. Faire tourner manuellement le greffon décellularisé 90 ° autour de l'axe longitudinal de toutes les demi-heures pendant les 2 premières heures.
  11. Garder culture statique pendant 12 heures pour permettre l'adhésion cellulaire.
  12. Délivrer DM à travers la lumière par la pompe péristaltique pour induire la différenciation des cellules des muscles lisses. Lancer débit initial à 5 ​​ml / min et augmentation progressive à 20 ml / min pendant 24 h.
  13. Gardez le débit moyen de circulation à 20 ml / min pendant 24 heures.
  14. Arrêter l'écoulement moyen et déplacer le réglage de l'incubateur bioréacteur.
  15. Re-graines de la lumière de la greffe avec l'IPFPC. Trypsiniser, compter et centrifuger 1 x 10 6 IPFPC comme dans les étapes 5.5 à 5.6. Remettre en suspension les cellules dans 50 ul de milieu EGM-2 contenant 50 ng / ml de VEGF. Injecter le mélange de cellules dans la lumière du greffon.
  16. Changer le milieu dans la chambre d'incubation et de la circulation de tout le milieu EGM-2 contenant le VEGF 50 ng / ml pour induire la différenciation endothéliale.
  17. Déplacez le bioréacteur mise revenir à the incubateur. Faites tourner manuellement la greffe 90 ° toutes les 30 min dans les 2 premières heures, puis maintenir une culture statique pendant 12 heures.
  18. Lancer flux circulant à partir de 5 ml / min et augmentation progressive à 35 ml / min. Gardez le débit à 35 ml / min pendant cinq jours. Changer de circulation et le milieu de la chambre tous les deux jours.
  19. Récolter la greffe d'ingénierie pour de plus amples greffage souris.

6. Intensification des Double-tête de série IPFPC Graft à des souris

  1. Utilisez NOD.CB17-Prkdc SCID / NcrCrl souris mâles que les greffés du navire. Toujours se assurer que les souris sont âgés d'environ 10 semaines, pèsent environ 25 à 35 g, et sont dans de bonnes conditions de santé.
  2. Anesthetize souris receveuse par administration d'une combinaison d'Hypnorm (25 mg / kg) et Hypnovel® (25 mg / kg) par voie intraperitoneale. Appliquer la vaseline pommade ophtalmique sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. Confirmez anesthésie efficace en se assurant que les souris ont des muscles détendus et respirent régulièrement.
    1. Fixer la souris dans une position couchée avec son cou rasé et étendu. Administrer le sulfate d'atropine (1,7 mg / kg) en combinaison avec les anesthésiques pour se assurer que les voies respiratoires de la souris reste claire.
  3. Préparer une incision médiane de la mandibule pour sternum de la souris. Sous un microscope de dissection avec 5 à 10 fois amplification, lever les glandes salivaires droite latéralement et retirer le muscle cleidomastoid droit d'exposer le droit artère carotide commune.
  4. Retirez délicatement les tissus attachés à mobiliser le droit artère carotide commune de l'extrémité distale vers l'extrémité proximale. Ligaturer la partie centrale de l'artère carotide commune à deux reprises avec une suture de soie 8-0 et disséquer entre les deux traverses.
  5. Traverser un brassard en nylon tube autoclavable dans chaque extrémité de l'enceinte et fixer chaque extrémité avec des colliers de microhemostat.
  6. Retirer tie suture à une extrémité et appliquer une goutte de l'héparine (100 U / ml). Immédiatement après, inverser l'extrémité distale du the artère pour couvrir l'ensemble du corps de gaine et fixer le navire inversée avec une suture de soie 8-0 à la manchette.
    1. Répéter la même opération à l'autre partie de l'artère. Artère Rincer avec une solution saline pour éliminer les caillots sanguins.
  7. Implanter un greffon de vaisseau décellularisé entre deux extrémités de l'artère carotide par coulissement les extrémités des vaisseaux de la décellularisées sur les poignets de l'artère et le fixant avec des sutures en soie 8-0. Retirer de clamps vasculaires soit se termine avant l'évaluation de la pulsation de la greffe.
  8. Placez la glande salivaire de retour à sa position initiale. Fermer la peau à l'emplacement chirurgical avec une suture interrompue en utilisant une suture 6-0 de polyglactine.
  9. Constamment observer les signes vitaux de souris après la procédure est terminée, jusqu'à ce qu'il reprenne conscience. Sacrifiez souris receveuses par dislocation et des vaisseaux de la récolte des greffons col de l'utérus soit 24 h ou trois semaines plus tard pour une analyse ultérieure.

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Representative Results

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La production réussie de l'Institut a été confirmé 4 jours après nucleofecting fibroblastes humains avec un plasmide linéarisé pCAG2LMKOSimO portant quatre facteurs de transcription, Oct4, Sox2 Klf4 et c-Myc (OSKM). IPFPC affiché un phénotype nettement distincte par rapport aux fibroblastes (figure 2A) et a exprimé les facteurs de reprogrammation au 4 ARNm (figure 2B) et de protéines (figure 2C) 10 niveaux. L'efficacité d'une greffe vasculaire base de l'Institut dépend fortement de la capacité de l'Institut de se différencier en deux lignées musculaires lisses et endotheliales. Il est donc essentiel pour confirmer ces propriétés de l'IPFPC in vitro en différenciant les cellules dans des milieux définis avant de les utiliser pour générer des greffes de vaisseaux. La figure 3 montre la capacité de l'IPFPC se différencier en cellules endothéliales fonctionnelles à la fois gène (figure 3A) et en protéines ( Figure 3B-D) levEls, sur la base de marqueurs spécifiques endothéliales 10. De même, l'IPFPC sont également capables de se différencier en la lignée de muscle lisse en réponse aux médias spécifique (Figure 3E-H) 11.

Whole aorte décellularisation a été obtenue par un traitement avec du SDS, un détergent anionique qui lyse des cellules et solubilise composants cytoplasmiques. Après 2 heures de traitement, l'aorte décellularisé est apparu comme un échafaudage acellulaire translucide par rapport à une aorte fraîchement récolté (figure 4A-B) 22. L'évaluation histologique sur la figure 4C-F illustre l'absence de noyaux ou de coloration cytoplasmique dans des récipients décellularisées, mais pas dans l'aorte de souris normale. Suite à double ensemencement de l'Institut endotheliales dérivées et les cellules musculaires lisses à l'intérieur aortes décellularisées, les greffes vasculaires artificielles présentent des propriétés de cellules musculaires lisses et endotheliales respectivement. Hématoxyline et l'éosine (HE) coloration de la double-sgreffes eeded révélé une architecture similaire à celle de vaisseaux natifs (figure 4G) avec de multiples couches de cellules musculaires lisses et une monocouche de cellules endothéliales comme confirmé par coloration positive pour le muscle lisse-22α (SM22), muscle lisse-α actine (SMA) , CD31 et CD144 marqueurs de respectivement (figure 4H-M) 11.

Pour confirmer la perméabilité des tissus navires conçus in vivo, les navires double ensemencées IPFPC dérivés ont été greffées à des souris - à la fois la souris normale et artères décellularisées ont été utilisés comme témoins. Une analyse ultérieure a montré que tandis que les souris greffées avec des navires décellularisées présentés avec des taux de mortalité nettement plus élevés dès le jour 1, IPFPC greffes de vaisseaux conféré un taux de 60% ​​de survie trois semaines après la transplantation (figure 5A) 11. En outre, trois semaines vieux greffons dérivés de l'Institut ont été entièrement caractérisés par la présence de l'Institut endothéliales humaines dérivées et les cellules musculaires lisses et les macrophages de l'hôte infiltration (figure 5B et tableau 1) 11. Pris ensemble, les résultats indiquent que l'IPFPC ont la capacité de se différencier en deux lignées vasculaires et sont puissant pour générer des navires de l'ingénierie tissulaire fonctionnels qui peuvent remplacer les navires indigènes in vivo.

Figure 1
Figure 1. Représentation schématique du circuit d'écoulement du bioréacteur greffé décellularisé. Le greffon de vaisseau décellularisé est monté dans la chambre d'incubation. Une pompe péristaltique est à l'amont de la chambre d'incubation pour fournir stable flux de perfusion du milieu. Le réservoir à fluide est à l'aval de la chambre d'incubation. La chambre de compliance est d'améliorer le régime d'écoulement. Le sens d'écoulement est indiqué par des flèches.large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Génération de l'IPFPC à partir de fibroblastes humains. Fibroblastes humains ont été nucleofected soit avec quatre gènes de reprogrammation (OCT4, SOX2, KLF4 et C-MYC) ou un vecteur vide (de contrôle). (A) contraste de phase photos montrent la morphologie de pépins après 4 jours. IPFPC exprimé les quatre facteurs de transcription, les deux à l'ARNm (B) et de protéines (C) les niveaux. La barre d'échelle pour les images montrées sont 50 um et les données sont des moyennes ± SEM (n = 3); * P <0,05, *** p <0,001. Ce chiffre a été modifié depuis Margariti, A. et al. 10 Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. </ A>

Figure 3
Figure 3. IPFPC peut se différencier en deux cellules endothéliales et musculaires lisses. Cellules de l'IPFPC ou de contrôle ont été différenciées en cellules endothéliales. (A) En comparaison aux cellules témoins, l'Institut dérivées des cellules endotheliales exprimé marqueurs spécifiques endotheliales tels que CD31, CD144, le récepteur du domaine d'insertion de kinase (KDR), synthase endothéliale de l'oxyde nitrique (eNOS) et von facteur de Willebrand (vWF) à l'ARNm niveau. (B) Cela a été confirmé au niveau de la protéine en utilisant une analyse Western blot. (C) Immunofluorescence indiqué coloration positive de CD144 (VE-cadhérine) dans IPFPC-endothélial, mais pas contrôler cellules. (D) Débit analyse cytométrique confirmé expression de cellules endothéliales de l'IPFPC-CD31 et CD144. IPFPC (ou de contrôle) cellules collagène IV graines ont également été différenciées enles cellules musculaires lisses. (E, F) Contrairement à contrôler cellules, cellules musculaires lisses IPFPC dérivés exprimés marqueurs spécifiques musculaires lisses au niveau du gène, y compris SMA, calponine, SM22, myosine de muscle lisse chaîne lourde II (SMMHC), facteur de réponse sérique (SRF) , myocardin, smoothelin, élastine et de collagène 1A1. (G) Les niveaux d'expression de SMA, calponine et SM22 dans des cellules dérivées de l'IPFPC ont été confirmés par une analyse Western blot. (H) la coloration par immunofluorescence en utilisant la microscopie confocale a montré une coloration typique lisse marqueur de muscle pour calponine et SM22. Les données représentent la moyenne ± SEM (n = 3); * P <0,05, ** P <0,01, *** p <0,001. La barre d'échelle pour les images montrées sont 25 um ou 50 um. Ces chiffres ont été modifiées par Margariti, A. et al. 10 et Karamariti, E. et al. 11 Se il vous plaîtcliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Génération de la double tête de série tissu IPFPC dérivés conçu greffes vasculaires. (A, B) de la souris Décellularisation aorte thoracique a conservé sa structure et encore ressemblait à celle d'un vaisseau normal, grossissement 2X. (CF) SE coloration de l'aorte décellularisée confirmé décellularisation succès et l'élimination complète des cellules par rapport aux témoins, grossissement: 50X ou 200X. (G) SE coloration des endothéliale IPFPC dérivés et les cellules musculaires lisses des navires à double têtes de série a révélé une architecture qui était semblable à un vaisseau natif. (J, M) navires à double tête de série IPFPC ingénierie tissulaire colorées positif pour endothéliales (CD31 et CD144) et les cellules musculaires lisses (SM22 et SMA) marqueurs contrairement decegreffes de vaisseaux llularized. (H, K) L'expression simultanée de marqueurs vasculaires ainsi que la morphologie caractéristique et la localisation de l'Institut endotheliales dérivées et les cellules musculaires lisses dans les zones médianes et intima était comparable à vaisseaux natifs. La barre d'échelle pour les images affichées sont de 50 um. Ces chiffres ont été modifiées par Tsai, T. et al., 22 et Karamariti, E. et al. 11 Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Double-têtes de série de l'ingénierie tissulaire greffons vasculaires IPFPC dérivés sont patentes pour remplacer les navires indigènes in vivo. Navires IPFPC dérivés ont été greffés dans l'artère carotide du déficit immunitaire combiné sévère (SCID), mou ​​normaleet les artères se décellularisées ont été utilisés comme témoins. (A) Analyse des souris greffées avec des navires IPFPC dérivés a montré 60% le taux de survie chirurgie trois semaines de poste, alors que les souris greffées avec des navires décellularisées présentés avec des taux de mortalité nettement plus élevés et une survie plus faible (20%). Les données représentent la moyenne (n = 10). (B) Les navires de l'ingénierie tissulaire ont également récolté trois semaines après la greffe, et soumis à SE (panneaux de gauche) ou immunofluorescence (des panneaux de droite) pour la présence de CD144 humain et calponine ou la souris CD11b / CD18 (Mac-1); quantification de coloration est résumé dans le tableau 1. agrandissement d'origine pour les images montrées sont 400X sauf indication. Ce chiffre a été modifié depuis Karamariti, E. et al. 11 Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Les cellules positives Champ (40x) Conçu navire avant la greffe Conçu greffon vasculaire (3 semaines)
calponine 72 ± 9 22 ± 11 *
CD144 20 ± 8 5 ± 6 *
Mac-1 0 71 ± 11 *

Tableau 1. Caractérisation des navires de l'ingénierie tissulaire trois semaines après la greffe. Le nombre de cellules endothéliales IPFPC dérivés et musculaires lisses et les macrophages de l'hôte a été quantifiée suivante immunofluorescence avec calponine humaine, CD144 humain et de souris Mac-1 respectivement. Les données représentent la moyenne ± ETM (n = 6); * P <0,05, différence significative à partir de navires de l'ingénierie tissulaire avant greffage. Ce tableau a été modifié depuis Karamariti, E. et al. 11

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Discussion

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Le protocole actuel indique un son, rapide, stratégie simple, efficace et reproductible dans lesquelles les navires de l'ingénierie tissulaire fonctionnels peuvent être générés en utilisant l'IPFPC à partir de fibroblastes humains. Cette technique représente un outil précieux pour la médecine régénérative, l'ingénierie tissulaire et la thérapie cellulaire potentiellement patient spécifique dans le proche avenir. Des mesures essentielles pour assurer l'efficacité du protocole comprennent la préparation de l'IPFPC, préparation de greffons aortiques stériles et entièrement décellularisées, ensemencement succès et la différenciation de l'IPFPC dans les échafaudages et le maintien de la stérilité de greffons aortiques dans le bioréacteur vasculaire.

Pour lancer la génération succès des greffes de l'ingénierie tissulaire, il est de la plus haute importance de se assurer que la préparation de l'IPFPC est réalisée efficacement. Le protocole a avec succès 'reprogrammé' une lignée cellulaire de fibroblaste humain dans l'Institut via nucléofection avec un plasmide pCAG2LMKOSimO OSKM. Le SURVIVal de fibroblastes après nucléofection se appuie sur plusieurs points clés tels que l'utilisation de plasmides OSKM de haute qualité, des plasmides de concentrations comprises entre 500 - 1000 ng / ul, éviter les retards dans l'ensemencement des fibroblastes immédiatement après nucléofection que les cellules sont particulièrement sensibles après l'introduction de relativement grandes plasmides et enfin l'addition de FGF-2 qui est crucial et doit être ajouté dans les milieux fraîchement préparés juste avant utilisation. En outre, nous avons trouvé qu'il était crucial d'utiliser des cellules de passage jusqu'à neuf pour éviter sénescence réplicative, d'assurer l'efficacité "reprogrammation" dans IPFPC et la différenciation ultérieure dans les cellules endothéliales et musculaires lisses. La pureté de l'Institut peut être améliorée par sélection des cellules nucleofected avec la néomycine. Le plasmide pCAG2LMKOSimO a un gène de résistance à la néomycine et donc l'ajout de néomycine dans une plage de 25 ug / ml un jour après la nucléofection pendant 3 jours entraînera la sélection d'une population pure deIPFPC. Pour concevoir un vaisseau IPFPC efficace pour greffage à des souris, nous avons considéré l'intégrité et la stérilité des aortes décellularisées d'être la plus haute priorité. Pour maintenir l'intégrité des aortes avant et après décellularisation, il était nécessaire d'appliquer constamment la dextérité manuelle lors de la manipulation des vaisseaux, comme ils étaient relativement fragile et considérablement diminutif de taille. L'élimination efficace de tissu périvasculaire étanchéité et de ramification des artères au moyen d'un électro-coagulation bipolaire était essentielle pour assurer l'ensemencement ultérieure de cellules compétentes et pour éviter les fuites de médias. À tout moment, nous nous sommes assurés que tous les matériaux et appareils utilisés pour générer le bioréacteur (IE, forceps, tubes, flacons, des chambres, des ciseaux, des adaptateurs et connecteurs) étaient autoclavable, réduisant ainsi les risques de contamination bactérienne et l'échec des greffes vasculaires avant la chirurgie .

Alors que le protocole actuel détient applications cliniques prometteurs dans dise cardiovasculairesAses, il ya quelques limitations qui devraient être améliorés dans un proche avenir pour améliorer encore la méthodologie. Jusqu'à présent, les facteurs de transcription de OSKM ont été introduits dans des fibroblastes humains par nucléofection. Bien que cette technique est relativement simple et directe, elle a aussi entraîné des efficacités de transfection variables à différents moments expérimentaux. Notamment, cette incohérence peut être surmonté par l'introduction d'une étape supplémentaire de la sélection à la néomycine précité. De même, on pourrait envisager l'introduction de quatre facteurs dans des fibroblastes humains en utilisant l'intégration lentivirus, qui peuvent potentiellement augmenter l'efficacité de la «reprogrammation» et améliorer la survie des cellules après l'infection. En termes de bioréacteur, nous avons constaté que décellularisation complète des aortes peut être réalisé en utilisant 0,075% SDS. Bien que cette technique a été considéré comme optimal pour l'élimination des cellules par rapport aux autres (par exemple détergents, Triton X-100), il peut cependant provoquer pPOTENTIELS altérations dans les ultra-structure des protéines de la matrice extracellulaire 23. Ce phénomène garantit donc stratégies de décellularisation plus efficaces pour réduire au minimum la perturbation des protéines de la matrice extracellulaire sont associées. En outre, nous avons également considéré que l'épaisseur de diamètre et le mur de aortes décellularisées varient entre les souris, selon leur âge, la souche et le fond, et donc entraîner des différences potentielles dans la vitesse d'écoulement et le stress de cisaillement dans des bioréacteurs et de la distribution de l'IPFPC suivante IPFPC ensemencement . Tout cela reste à clarifier.

Ce protocole décrit ici la génération de greffons fonctionnels de l'ingénierie tissulaire en utilisant l'IPFPC qui détiennent un potentiel prometteur pour futures applications cliniques de la thérapie de cellules souches pour les maladies cardiovasculaires. Ce processus qui utilise la reprogrammation directe d'une lignée somatique (fibroblastes) à l'autre (soit des cellules musculaires lisses ou endothéliales) en sautant pluripocompé- peut être un moyen d'obtenir des cellules appropriées et sûres d'intérêt. En effet, plusieurs protocoles ont été publiés pour décrire la génération de lignées de cellules souches à partir d'embryons humains, des cellules iPS et les cellules souches adultes de 24 à 26, qui tous posent toutefois encore concernant les questions en ce qui concerne leur utilisation dans la clinique. Il est maintenant connu que l'IPFPC ne développent pas tératomes dans des souris SCID, éliminant ainsi la préoccupation de la formation de tumeurs. En outre, les cellules prennent un temps beaucoup plus court pour générer, de la culture et de différencier 10,11, et ont été montrés pour générer succès et fonctionnelles navires de l'ingénierie tissulaire greffons qui sont comparables à aortes indigènes. Par conséquent, l'Institut présente comme une source cellulaire prometteuse pour le traitement des patients utilisant la thérapie cellulaire personnalisée parce fibroblastes (par exemple, de la peau) peuvent être dérivées d'un individu spécifique. Le système de récipient decellularised dans ce protocole fournit un modèle qui fournit plus biomimétique cellules ensemencées avec une extracellular protéine de matrice qui est plus représentative de celle d'une aorte native 11. Ces points clés sont essentiels pour assurer la survie, la différenciation et la fonctionnalité des cellules ensemencées et les navires de l'ingénierie tissulaire par la suite. Une étude récente par Sumitran-Holgersson et ses collègues a démontré un repeuplement succès d'une greffe de la veine iliaque précédemment décellularisé sur une personne décédée avant la greffe 27, postulant ainsi une valeur de translation du protocole actuel à l'homme dans un avenir proche. En outre, les greffes de vaisseaux décellularisées peuvent représenter un bon modèle dans lequel le rôle et le comportement des autres types de cellules vasculaires qui contribuent également à des greffes de l'ingénierie tissulaire peuvent être évalués. Ce système modèle chez la souris pourrait fournir un outil puissant pour l'avenir de dépistage des drogues et aussi dans la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la biologie vasculaire de cellules souches. Pris ensemble, le protocole actuel détient valeur prometteuse pour son application dans Vascingénierie tissulaire parti- et une percée dans la médecine personnalisée.

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Disclosures

Les auteurs ne ont aucun intérêts financiers divergents.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Fibroblasts CCL-153 ATCC CCL-153 Prenatal human embryonic fibroblasts
ATCC F-12K Medium (Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium) ATCC 30-2004
Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020
Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells Life technologies (Gibco) 12660-012
Knockout Serum Replacement Life technologies (Invitrogen) 10828-028
Human Basic FGF-2  Miltenyi Biotech 130-093-837
alpha-MEM medium Life technologies (Invitrogen) 32571093
Human PDGF R&D System 120-HD-001
Gelatin Solution 2% Sigma G1393
Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC) Addgene 20866
 PvuI Restriction Enzyme New England Biolabs RO150S
SureClean Plus Bioline BIO-37047
Nucelofection Kit (NHDF Kit) LONZA VPD-1001
Neomycin SIGMA G418
KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy SCHOTT KL 1500 LCD Cold light illumination for stereo microscopy
Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800 Nikon SMZ800
Heparin sodium salt Sigma H3393
10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent Severn Biotech CAS 151-21-3
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma D8537
Matrigel (10mg/ml) BD A6661
Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7  Jepson Bolton's, Janke&Kunkel S32-102
Masterflex L/S Digital Pump Drive Cole-Parmer WZ-07523-80
Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head Cole-Parmer EW-07519-15
Masterflex L/S large cartridges for pump head Cole-Parmer EW-07519-75
Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft Cole-Parmer  WZ-96410-14 Tubing goes through the peristaltic pump
0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing SILEX N/A Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber 
Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline Ibidi 10829 Adapter connect above two types of tubings
1/32" Tubing, ID 0.01" (250µm) Material: PEEK LabSmith T-132-010P Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing
One-Piece Fittings  LabSmith T-132-100 Fix the above tubings through the incubation chamber wall
Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm)  Smiths Medical N/A Tubings insert into two ends of the aorta graft
NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mouse Charles River
Surgical sutures, 8-0  silk ETHICON W819
Hypnorm Vetapharm Vm21757/4000 Neuroleptanalgesic for use in mice
Hypnovel (Midazolam) Roche 59467-70-8 Induction of anaesthesia
Dissecting microscope Carl Zeiss Stemi 2000
Nylon Tubing Portex LTD 800/200/100/200 0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff
Electrocoagulator Martin  SN 54.131 Ligation of artery branches on aorta
Bipolar micro hemostat forceps Martin 80-91-12-04 Fixation of vessel ends
Vessel Dilator S&T JFX-7
Vessel Dilator S&T JFL-3dZ
Vessel Dilator S&T D-5aZ
Mini applier  AESCULAP FE572K
Micro hemostats clips AESCULAP FE720K
Surgical sutures, 6-0 VICRYL ETHICON V489

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References

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Génération et greffage des navires par ingénierie tissulaire dans un modèle de souris
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Wong, M. M., Hong, X., Karamariti, E., Hu, Y., Xu, Q. Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (97), e52565, doi:10.3791/52565 (2015).More

Wong, M. M., Hong, X., Karamariti, E., Hu, Y., Xu, Q. Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (97), e52565, doi:10.3791/52565 (2015).

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