Summary
ここでは、二重播種部分的人工多能性幹細胞がマウスにグラフトするための機能的な組織工学血管移植片を生成するためのプロトコルを提示する（PiPSC）は - 脱細胞化血管足場バイオリアクターに由来内皮細胞 - 平滑筋細胞およびPiPSC由来。
Introduction
血管導管の建設は、心血管疾患に起因する破損して負傷した血管の外科的修復のための基本的な戦略である。 、同種移植片、自家組織（心膜または伏在静脈）と移植片1、今日まで、外科手術で使用される移植片材料は、生体適合性の合成ポリマー（ポリエチレンテレフタレート[ダクロン】ポ リテトラフルオロエチレン[テフロン（登録商標）]、延伸ポリテトラフルオロエチレン[ゴアテックスのePTFE]）を含む。人工移植片（ 例えば、ゴアテックスおよびダクロン）が最も一般的に使用されている一方で、これらの材料は、おそらく狭窄症、カルシウム沈着、血栓、塞栓および感染を含む多数の短期および長期の合併症を引き起こす。本生物学的な移植片を有する患者は血栓塞栓事象を減少したが、彼 らはまだ石灰化の劣化2のためにこのような二次移植の失敗と短縮耐久性などの制限が発生した。したがって、外科トンの大幅な改善にもかかわらず年間のechniquesは、研究者や臨床医は、まだ血管疾患のための理想的なコンジットを識別するための必要性を抱えている。さらに最近では、血管組織工学の研究分野は、細胞が正常な移植の1のための機能的血管を具現化するバイオミメティック環境を作ることを目的に、生分解性足場に組み込まれている概念を生成した。基本的に、血管の構築体の成功は3必須成分に依存。足場を含む細胞、 すなわち、内皮細胞の内層と、平滑筋細胞層、天然の血管系に匹敵する機械的特性を提供するために適切な細胞外マトリックスを含有する足場、および開始/調節するために必要とされる分子/細胞シグナル修理。
長期グラフト開存とネオ·組織の持続的な発展は、番目の足場の効果的な細胞播種に大きく依存しているereby決定的な重要性の細胞型の決定をレンダリングする。いくつかの報告は、小径導管3-6を開発するためにさまざまなソースから成熟内皮および平滑筋細胞の使用を実証する。有望であるが、成熟した内皮細胞および平滑筋細胞を得るのに十分な自家血管の欠如は、大きな負担残る。より最近では、様々な供給源からの幹細胞は、血管組織工学用途のために開発されてきた。実際には、胚性幹細胞7を含む幹細胞型の多様な、誘導多能性幹細胞（iPS細胞）8,9、PiPSC 10,11、骨髄由来単核球12、間葉系幹細胞13、内皮前駆細胞および成体血管壁14,15は 、定義されたすべてのメディアに対応して機能的な内皮細胞または平滑筋細胞のいずれかに分化できることが実証されている細胞抗原-1（のSca-1）+幹/前駆細胞を幹細胞由来と培養条件。さらに、幹細胞の無制限の自己再生能力が彼らにのみ増殖停止および老化を受ける前に有限回数に分割することができる成熟内皮および平滑筋細胞とは異なり、より良い候補者を作る。
移植のために成功した組織工学血管を生成するための足場材料の選択は、生体適合性、生体力学的特性、および生分解速度のようないくつかの要因に依存する。基本的には、移植片のための足場を作成するために使用される材料は、生分解性であるべきであり、不必要な受信者の免疫応答をマウントしません。加えて、細胞付着およびその後の生存に適し多孔性およびミクロ組織を包含する必要があります。現在までに、血管組織工学における足場のために使用される最も一般的な材料は、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリεカプロラクトン16のポリマーが挙げられる。さらに最近では、脱細胞化生物学的材料が持っているまた、ある程度の成功を収めて適用されて。いくつかの研究室は、自己細胞で脱細胞化ヒト、イヌ又はブタ血管を播種すると、凝固し、内膜肥厚17-19抵抗し、生物学的移植片を提供したことが示されている。血管組織工学における他の戦略は、フィブリンゲル13中に細胞を播種し、足場支持体20、21せずに細胞シートを生成し、例えば 、細胞外マトリックスタンパク質ベースの血管移植片が含まれる。
現在のプロトコルは、SCID（重症複合免疫不全に官能内皮細胞および平滑筋細胞、機能的なPiPSC由来の血管細胞を港に脱細胞化血管足場から成るバイオリアクターの生成、および組織工学血管のグラフトへのヒトPiPSCの分化を実証）マウス。 PiPSCは、これらの細胞がマウスにおいて腫瘍を形成するか、または倫理的な発生させないので、血管移植片の組織工学に使用する最適な細胞型であると同種免疫応答。さらに、我々は、PIPS内皮細胞およびPIPS平滑筋細胞を生成するための戦略は、10,11、効率的かつ再現可能であることを示している。その後、我々はこのようにグラフトと生存効果を増強する、密接にネイティブ血管内に存在するマトリックスタンパク質を模倣するPiPSC由来の血管細胞の播種のための脱細胞化容器を設計しました。さらに、従来PiPSC播種に血管の脱細胞はマクロファージなどの免疫細胞の種類によってマウント炎症反応の発生を防止する。さらに重要なことに、このプロトコルは、ヒトへの翻訳のための有望な血管の導管を生成する方法を表すだけでなく、マウスモデルを介して、血管組織再生を支配する分子メカニズムを研究し、理解する貴重な手段を提供しないだけでなく。
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Protocol
実験動物の使用とケアのための制度委員会によって承認されたプロトコルに従って、すべての動物実験を行う。
文化メディアの調製
- F-12K培地、10％ウシ胎児血清（FBS）および100 U / mlペニシリンおよびストレプトマイシン：ヒト線維芽細胞株CCL-153のための培地を加える。
- PiPSC生成のためのリプログラミングメディアを行いますノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）20％のノックアウト血清代替、0.1 mMのβメルカプトエタノールを含む、0.1 mMの最小必須培地（MEM）非必須アミノ酸、10ng / mlの塩基性線維芽細胞増殖因子2（のbFGF-2）、および100 U / mlペニシリンおよびストレプトマイシン。メディアを使用する前のbFGF-2をたてたびに追加します。
- 10％FBSを含むα-MEMを媒体、0.1mMのβメルカプトエタノール、100 U / mlペニシリン及びストレプトマイシン及び25 / mlの血小板由来成長因子：平滑筋細胞（SMC）の分化を誘導する分化培地（DM）を作る（PDGF-ββ）。
- 確認内皮分化メディア内皮細胞（EC）の分化を誘導する（EC-DM）：内皮増殖培地-2（EGM-2）の50ngを含有する培地/ mlの血管内皮増殖因子（VEGF）および100 U / mlペニシリンおよびストレプトマイシン。
部分的に人工多能性幹細胞へのリプログラミング2.ヒト線維芽細胞（PiPSC）
- 培養液中の0.04％ゼラチン溶液コーティングしたフラスコに培養ヒト線維芽細胞株CCL-153。
- 継代細胞1の比率で3日毎：6。 PiPSC生成の最適な効率のための通路9の前に細胞を使用してください。 90％の集密度 - セルが80に到達すると、トランスフェクションのために準備ができている。
- 八量体結合転写因子4（OCT4）、SOX2、クルッペル様因子4（KLF4）とC-MYC（のpCAG-OSKM）4再プログラミング因子を含むポリシストロンプラスミドpCAG2LMKOSimOを線形化する。 37℃で3時間のPvuI制限酵素5ユニットの5μgのプラスミドを消化する。浄化する製造業者のプロトコルに従って、市販のキットを有するプラスミド。
- 製造業者のプロトコルに従って、ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）ヌクレオキットでエレクトロポレーションにより線状のpCAG-OSKMプラスミドの4μgのトランスフェクション2×10 6個のヒト線維芽細胞。穏やかに予め温め書き換えメディアを5 mlを含有するプレ0.04％ゼラチンコーティングしたT25フラスコにトランスフェクトされた細胞を播種する。
- 24時間後、トランスフェクションされた細胞の純粋な集団を選択するために25 / mlのネオマイシンのサプリメントを含む培地に変更。
- 4日目まで一日おきに培地を変更します。
注：ヒト線維芽細胞は、再プログラミングの4日後にPiPSCになる。
内皮細胞および平滑筋細胞にPiPSC 3.分化
- 平滑筋細胞への分化を誘導するために4日間DMを含むコラーゲンIV予め被覆した皿上にシードPiPSC。 4日目まで一日おきに培地を変更します。
- コラーゲンIVのプレコーティング皿c上のシードPiPSC内皮細胞への分化を誘導するために6日間、内皮-DMをontaining。 6日目まで一日おきに培地を変更します。
4.脱細胞化大動脈移植の準備
注：すべてのソリューションおよび機器は、無菌であるべきである。
- 頚椎脱臼によりマウスを犠牲にし、解剖顕微鏡下での仰臥位でマウスを修正する。
- 胸腔を開くには、胸骨を通って、胸郭の周りにカット。大動脈を露出させ、心臓、肺や食道を削除します。静かに鉗子でペリ大動脈脂肪を取り除く。
- ハサミで前端から大動脈を切断し、優しく鈍ピンセットで終わりを開催しています。鈍的切開によって背後にある背骨列から大動脈を切り離します。慎重にはさみとのライゲーションの遠端からバイポーラelectrocoagulatorとカッティングで連結することにより大動脈からすべての分岐動脈を閉じます。
- 3メートルで大動脈内腔をフラッシュするの5ml注射器を使用血栓の形成を防ぐために、ヘパリンの100 Uを含む食塩水のリットル。
- 腎臓にそれ支店前に大動脈の後端をカット。大動脈の整合性を保つことは全体の手順の間に非常に重要です。
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に希釈した0.075％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）水溶液5mlで大動脈内腔を洗い流す。
- 10センチメートルペトリ皿中0.075％SDS溶液中の胸部大動脈を浸す。 RTで150rpmで2時間オービタルシェーカー上でペトリ皿を置きます。
- PBS 5mlの大動脈内腔を洗い流す。
- 10センチメートルペトリ皿にPBSに大動脈を浸す。 RTで150rpmで2時間オービタルシェーカー上のペトリ皿を置きます。 PBSを20分毎に更新します。
- PBS 5mlの大動脈内腔を洗い流す。
- 最大1週間4℃でPBS中に脱細胞化大動脈移植片を保管してください。
PiPSCバイオリアクターコンディショニング5.デュアル播種
注：すべてのソリューションsおよび機器は、無菌であるべきである。組織培養フード内のすべての操作を実行します。
- 図1に示すように、バイオリアクターの流れ回路を組み立てるチューブをインキュベーションチャンバー、媒体リザーバ、蠕動ポンプ、コンプライアンス室を接続する。循環のために必要な媒体の最小体積を40mlである。
- 事前条件10センチメートルシャーレにDM培地における大動脈を浸漬することによって培養培地で脱細胞化容器。 RTで50 rpmで1時間オービタルシェーカー上のペトリ皿を置きます。
- 顕微鏡下で脱細胞化容器の両端に1センチメートル長ナイロンチューブ（OD 0.9ミリメートル、ID 0.75ミリメートル）を挿入します。 8-0絹縫合糸で容器とチューブを接続します。
- チャンバ壁の入口および出口ポート（1/32 "のチューブ）とナイロンチューブを接続することにより、インキュベーションチャンバー内の脱細胞化された大動脈ステントグラフトを組み立てる。培地の5mlのたびにとのインキュベーション室を維持します。
- トリプシン処理PiPSC予め温めを追加することで10回培養皿をカバーし、優しく料理を岩にトリプシン。トリプシンを破棄し、2インキュベーター中で料理を残す - 3分。皿に予め温めた培地を加え、細胞と培地を混合する。
- 血球計数器を用いて細胞数を数えます。 300×gで5分間、5×10 5個の細胞をそれぞれ含有する細胞懸濁液の遠心つのアリコート。完全に上清を吸引除去する。
- 完全に上清を吸引した後、DM50μlのPIPS細胞ペレットの1ペレットを再懸濁。脱細胞化された血管内腔に、この細胞懸濁液を注入する。
- 次に、マトリゲル100μlの他のPIPSの細胞ペレットを再懸濁します。脱細胞化大動脈移植片の上に物を慎重にピペット。
- 混合物はゲル状の状態になり、均等に容器外表面をラップするまで15分 - 10のを待ちます。 DMとのインキュベーション室を埋める。
- 37℃、5％CO 2インキュベーター内で全体バイオリアクターの設定を配置。手動で最初の2時間ですべての縦軸の周りに半時間を脱細胞化移植片を90°回転させます。
- 細胞接着を可能にするために12時間静置培養してください。
- 平滑筋細胞の分化を誘導するために蠕動ポンプにより内腔を通ってDMを配信。 5ml /分で24時間かけて20ml /分の段階的増加の初期流量を開始する。
- 24時間、20ml /分の循環媒体の流量を維持する。
- 媒体流を停止し、培養器の外に設定するバイオリアクターを移動します。
- 再シードPiPSCグラフトの内腔。 5.6 -トリプシン処理は、ステップ5.5のように数えると遠心分離機1×10 6 PiPSC。 50ng / mlのVEGFを含むEGM-2培地50μlの細胞を再懸濁。移植片の内腔に細胞混合物を注入。
- 内皮分化を誘導する50ng / mlのVEGFを含むEGM-2培地にインキュベーションチャンバー中の培地と全体の循環を変更します。
- 目に戻って設定するバイオリアクターを移動Eインキュベーター。手動で移植片を最初2時間で90度30分ごとに回転した後、12時間静置培養を続ける。
- 5ml /分で35 ml /分まで段階的増加からの流れを循環開始。 5日後、35 ml /分での流速を維持する。一日おきに循環し、チャンバ中に変更します。
- マウスへのさらなる移植のための設計移植片を収穫。
ダブルシードPiPSC移植片の6.移植マウスに
- 使用NOD.CB17-PRKDC血管移植片レシピエントとしてSCID / NcrCrl雄マウス。 35グラム、および良好な健康状態である - 常にマウスは、約10週齢で約25の重量を量ることを確認してください。
- 腹腔Hypnorm（25ミリグラム/ kg）およびHypnovel（25mg / kgの）の組合せを投与することにより、レシピエントマウスを麻酔。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目にワセリン眼軟膏を適用します。マウスはリラックスした筋肉を持っていると着実に呼吸していることを確実にすることにより、効率的な麻酔を確認してください。
- その首を剃毛し、延長に仰臥位でマウスを修正。マウス気道が透明なままであることを確実にするために麻酔薬と組み合わせて、硫酸アトロピン（1.7ミリグラム/ kg）を管理します。
- マウスの胸骨に下顎から正中切開を準備します。 5〜10倍の増幅と解剖顕微鏡下では、横方向に右の唾液腺を持ち上げ、右総頸動脈を露出させ、右cleidomastoid筋肉を取り除く。
- 静かに、近位端に向かって先端から右総頸動脈を動員する添付組織を取り除く。 8-0絹縫合糸で二回総頸動脈の中間部分を連結する二つの関係の間に解剖。
- 各容器の最後でオートクレーブ可能ナイロンチューブで作られたカフを通過してmicrohemostatクランプとのそれぞれの端を固定します。
- 一方の端部に縫合糸ネクタイを外し、ヘパリンのドロップ（100 U / ml）を適用する。直後に、目の遠位端を反転電子動脈全体カフ本体をカバーし、カフの8-0絹縫合糸で反転容器を固定する。
- 動脈の他の部分に同じ手順を繰り返します。食塩水でフラッシュ動脈が血餅を除去する。
- 動脈カフの上の脱細胞化された血管の端部を摺動し、8-0絹縫合糸でそれを固定することにより、頸動脈の両端間に脱細胞化された血管移植片を移植する。移植片の脈動を評価する前に、いずれかの端から血管クランプを取り外します。
- 元の位置に右の唾液腺を置きます。 6-0ポリグラクチン縫合糸を使用して中断した縫合糸で外科場所に皮膚を閉じます。
- 手続きが完了した後にそれが意識を再開するまで一貫して、マウスのバイタルサインを観察する。頸椎脱臼や収穫血管移植片による犠牲レシピエントマウスさらなる分析のために24時間または3週間後のどちらか。
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Representative Results
PiPSCの成功した世代は、4転写因子、OCT4、SOX2、KLF4およびc-MYC（OSKM）を運ぶ線形化さpCAG2LMKOSimOプラスミドでヒト線維芽細胞をnucleofectingた後、4日確認された。 PiPSCは、線維芽細胞（ 図2A）と比較した場合に顕著に異なる表現型を表示し、mRNA（ 図2B）およびタンパク質（ 図2C）レベル10で4の再プログラミング因子を発現した。 PiPSCベースの血管移植片の有効性は、両方の内皮細胞および平滑筋系統に分化するPiPSCの能力に大きく依存する。それは、血管移植片を生成するためにそれらを利用する前に、規定された培地中で細胞を分化することによって、インビトロで PiPSCのこれらの特性を確認することが重要である。 図3は PiPSCの容量は、遺伝子（ 図3A）およびタンパク質（両方で機能的内皮細胞に分化することを示し図3B-D）レフELS、内皮特異的マーカー10に基づく。同様に、PiPSCは、特定のメディア（ 図3E-H）11に応答して平滑筋系統へと分化することができる。
全大動脈の脱細胞化は、SDS、細胞を溶解し、細胞質成分を可溶化アニオン性界面活性剤で処理することによって達成された。治療の2時間後、脱細胞化大動脈を新たに採取した大動脈（ 図4A-B）22に比べて半透明の無細胞の足場として登場。 図4C-Fにおける組織学的評価は、脱細胞化血管ではなく、通常のマウスの大動脈中の核や細胞質染色がないことを示している。 PiPSC由来内皮および脱細胞化された大動脈内の平滑筋細胞の二重の播種後、操作された血管移植片は、それぞれ内皮細胞および平滑筋細胞の特性を示す。ダブルsのヘマトキシリンおよびエオシン（HE）染色平滑筋-22α（SM22）、平滑筋αアクチンについて陽性染色（SMA）によって確認されるようにeeded移植片は、平滑筋細胞および内皮細胞の単層の複数の層を有する天然の血管（ 図4G）と同様のアーキテクチャを明らかにしたそれぞれCD31およびCD144マーカー（ 図4H-M）11。
in vivoでの組織工学血管の開存性を確認するために、二重シードのPiPSC由来の血管がマウスに移植された-正常マウス及び脱細胞化動脈の両方を対照として使用した。その後の分析は、早くも1日目として、著しく高い死亡率を提示脱細胞化された血管でグラフト化されたマウスが、PiPSC血管移植片は、移植3週間（ 図5A）、11から60％の生存率を付与したことを示した。さらに、3週齢のPiPSC由来の移植片は、完全ヒトPiPSC由来内皮の存在を特徴づけたと平滑筋細胞および宿主マクロファージの浸潤（ 図5Bおよび表1）11。まとめると、結果はPiPSCの両方血管系統に分化する能力を有し、 インビボで天然の血管を置換することができる機能的な組織工学血管を生成するための強力であることを示している。
図1の脱細胞化グラフトリアクター流れ回路の略図。脱細胞化された血管移植片は、インキュベーションチャンバー内に組み立てられる。蠕動ポンプは、安定した培地の灌流を提供するために、インキュベーションチャンバーの上流にある。メディアリザーバは、インキュベーションチャンバーの下流にある。コンプライアンス室は、流れ状態を改善することである。流れの方向は矢印で示されている。large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ヒト線維芽細胞からPiPSC図2.世代は。ヒト線維芽細胞は、4つの初期化遺伝子（OCT4、SOX2、KLF4、およびC-MYC）または空のベクター（対照）のいずれかでヌクレオフェクトた。 （A）位相コントラストの写真は、4日後にPIPSの形態を示す。 PiPSC両方のmRNA（B）およびタンパク質（C）のレベルで、すべての4つの転写因子を発現した。示されている画像のためのスケールバーは50μmであり、データは平均±SEMである（N = 3）; * P <0.05、*** P <0.001。この図は、Margariti、A. らから変更されている。10 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</ A>
図3 PiPSCは、内皮細胞および平滑筋細胞の両方に分化することができる。PiPSCまたは対照細胞は内皮細胞へ分化させた。 （A）細胞を制御するために比較し、PiPSC由来の内皮細胞は、mRNAにおけるCD31、CD144、キナーゼ挿入ドメイン受容体（KDR）、内皮一酸化窒素合成酵素（eNOS）およびフォンビルブラント因子（vWF）などの内皮細胞特異的マーカーを発現しレベル。 （B）これは、ウェスタンブロット分析を用いてタンパク質レベルで確認された。 （C）免疫蛍光染色は、CD144 PiPSC -内皮中（VEカドヘリン）の陽性染色を示したが、コントロール細胞ではない。 （D）フローサイトメトリー分析は、CD31およびCD144のPiPSC内皮細胞発現を確認した。コラーゲンIVシードPiPSC（または対照細胞）もに分化した平滑筋細胞。 （E、F）のセルを制御するために反して、PiPSC由来の平滑筋細胞はSMA、カルポニン、SM22、平滑筋ミオシン重鎖II（SMMHC）、血清応答因子（SRF）を含む、遺伝子レベルでの平滑筋特異的マーカーを発現し、ミオカルジン、スムーセリン、エラスチンやコラーゲン1A1。 （G）PiPSC由来細胞におけるSMA、カルポニンおよびSM22の発現レベルは、ウェスタンブロット分析を用いて確認した。共焦点顕微鏡を使用して（H）免疫蛍光染色は、カルポニンおよびSM22の典型的な平滑筋マーカーの染色を示した。データは、平均±SEMを表す（N = 3）; * P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001。示されている画像のためのスケールバーは25μm以上50μm以下である。これらの図は、A。 ら。10 Karamariti、E. ら 、Margaritiから変更されている。11 くださいこの図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図の二重シードPiPSC由来の組織工学血管移植片の4世代。（A、B）脱細胞化マウスの胸部大動脈は、その構造を保存し、まだ正常な血管、元の倍率2Xのことに似ていた。 50Xまたは200X：コントロール、元の倍率と比較した場合、脱細胞化された大動脈の（CF）HE染色は、正常細胞化および細胞の完全な除去を確認した。 PiPSC由来の内皮細胞および平滑筋細胞の（G）HE染色は、二重シード血管が本来の血管に類似したアーキテクチャを明らかにした。 （J、M）ダブルシードPiPSCの組織工学血管内皮（CD31およびCD144）および平滑筋細胞（SM22とSMA）DECEとは異なり、マーカーについて陽性に染色血管移植片をllularized。 （H、K）は、血管マーカーの同時発現ならびに内側および内膜領域内PiPSC由来内皮細胞および平滑筋細胞の特徴的な形態および局在は、天然血管に匹敵した。示されている画像のためのスケールバーは50μmである。これらの数字はツァイ、T. ら22とKaramariti、E. らから変更されている。11は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5.ダブルシードPiPSC由来の組織工学血管移植片は、生体内でネイティブ血管を置換するための特許である。PiPSC由来の血管が通常のMOU、重症複合免疫不全（SCID）マウスの頸動脈に移植したそれと脱細胞化された動脈を対照として用いた。マウスは著しく高い死亡率および低い生存率（20％）が提示脱細胞化された血管でグラフト化されたのに対しPiPSC由来の血管でグラフト化されたマウスの（A）の分析は、60％の生存率が3週間後の手術であった。データは、平均を表した（n = 10）。 （B）は、組織工学血管はまた、移植後3週目に採取し、HE（左パネル）またはヒトCD144及びカルポニンまたはマウスのCD11b / CD18（Mac-1の）の存在について免疫蛍光染色（右パネル）に供した。染色の定量化は、 表1に要約する。明記しない限り表 示される画像のためのオリジナルの倍率は400倍である。この図は、Karamariti、E. らから変更されている。11 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 陽性細胞フィールド（40X） | 設計血管グラフトの前に | 設計血管移植片（3週間） |
| カルポニン | 72±9 | 22±11 * |
| CD144 | 20±8 | 5±6 * |
| Mac-1の | 0 | 71±11 * |
組織工学血管の表1キャラ移植後3週間。PiPSC由来内皮および平滑筋細胞とホストマクロファージの数は、それぞれヒトカルポニン、人間CD144とマウスはMac-1と以下の免疫蛍光染色を定量した。データは、平均±SEMを表す（N = 6）; * P <0.05、グラフトの前に組織工学血管からの有意差。この表はKaramariti、E。 らから変更されている。11
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Discussion
現在のプロトコルは、サウンド、機能的な組織工学血管がヒト線維芽細胞からPiPSCを使用して生成することができる、高速で簡単、効率的かつ再現可能な戦略を示している。この技術は、近い将来、再生医療、組織工学および潜在的に患者特異的細胞治療のための貴重なツールを表す。プロトコルの有効性を確保するための重要なステップは、PiPSCの準備、無菌であり、完全に脱細胞化大動脈移植片の準備、足場でPiPSCの成功播種と分化や血管のバイオリアクター中で大動脈移植片の無菌性を維持することが含まれる。
組織工学移植片の成功生成を開始するためには、PiPSCの準備が効果的に行われることを保証するために最も重要である。プロトコルが正常pCAG2LMKOSimO OSKMプラスミドとクレオ経由PiPSCへのヒト線維芽細胞株を「再プログラム」している。 surviv線維芽細胞ヌクレオは、このような高品質のOSKMのプラスミドの使用など、いくつかの重要なポイントに依存していた後、500との間の範囲の濃度のプラスミドのアル - 細胞は導入後特に敏感であるように千ng /μLでは、すぐにヌクレオ後に線維芽細胞の播種の遅れを避けるために比較的大きなプラスミドおよび最終的に重要であり、使用直前に新たに調製した培地に添加されるべきであるFGF-2を添加する。さらに、我々は、内皮細胞および平滑筋細胞にPiPSCとその後の分化に効果的な「再プログラミング」を確保するために、複製老化を回避するために、通路9までの細胞を用いることが重要であることがわかった。 PiPSCの純度は、ネオマイシンヌクレオフェクトした細胞を選択することによって改善することができる。 pCAG2LMKOSimOプラスミドは、ネオマイシン耐性遺伝子を有するため、3日間クレオ後に/ mlの1日25μgの範囲でネオマイシンの追加はの純粋な集団の選択になりますPiPSC。マウスにグラフトするため、効率的なPiPSC容器を設計するために、我々は、脱細胞化大動脈の完全性と無菌性が最優先であると考えた。彼らは比較的壊れやすい、サイズがかなり小柄であったように、前後の脱細胞化後の大動脈の完全性を維持するためには、常に、血管を処理しながら、手先の器用さを適用する必要があった。バイポーラ電気凝固器を使用して動脈の分岐血管周囲組織とのシールの効率的な除去は、その後のコンピテント細胞播種を確実にするとメディアの漏れを回避するために重要であった。任意の時点で、我々は、バイオリアクターを生成するために使用される全ての材料及び装置（ すなわち、鉗子、チューブ、ボトル、チャンバー、はさみ、アダプタおよびコネクタ）、したがって手術前に血管移植片の細菌汚染や故障のリスクを低減する、オートクレーブ処理可能であることを確実に。
現在のプロトコルは、心血管DISEで有望な臨床応用を保持しながら、アーゼ、さらなる方法論を強化するために、近い将来に改善されるべきいくつかの制限がある。これまで、OSKM転写因子はヌクレオを介して、ヒト線維芽細胞に導入した。この技術は、比較的単純で簡単であるが、それはまた、異なる実験時間に可変トランスフェクション効率をもたらした。注目すべきことに、この矛盾は、上記ネオマイシン選択する追加の工程を導入することによって克服することができる。同様に、人は、潜在的に「再プログラミング」の効率を高め、感染後の細胞の生存を増強することができるレンチウイルス統合を使用して、ヒト線維芽細胞への4つの因子の導入を検討する可能性がある。バイオリアクターの面では、大動脈の完全な脱細胞化は、0.075％SDSを用いて達成することができることを見出した。この技術は、細胞除去のために最適であると考えられたが、他の界面活性剤（ 例えば、トリトンX-100）、それがページを引き起こす可能性と比較して細胞外マトリックスタンパク質23の超構造内otential改変。この現象は、したがって、関連する細胞外マトリックスタンパク質の中断を最小限に抑え、より効率的な脱細胞化戦略を保証します。さらに、我々はまた、脱細胞化された大動脈の直径および壁部の厚さは、年齢、歪みおよび背景に応じて、マウスの間で変化し、従って、バイオリアクター内の流れとせん断応力の速度とPiPSC播種以下PiPSC分布の電位差を生じさせると考えられ。このすべてが明確にされていない。
このプロトコルは、本明細書に心血管疾患の幹細胞療法における将来の臨床応用のための有望な可能性を秘めてPiPSCを使用して機能的な組織工学移植片の生成を記載している。スキップして、別の（内皮細胞または平滑筋細胞のいずれか）に1体細胞系統（線維芽細胞）からの直接再プログラミングを利用してこのプロセスpluripoテンシは、対象の安全かつ適切な細胞を得るための方法であってもよい。実際、いくつかのプロトコルは、しかし、まだ臨床でのそれらの使用に関してに関する問題を提起全てが、ヒト胚のiPS細胞および成体幹細胞から24-26幹細胞株の生成を説明するために公開されている。今やPiPSC、したがって腫瘍形成の懸念を解消する、SCIDマウスにおいて奇形腫を発症しないことが知られている。さらに、細胞は、発生文化10,11を区別するためにかなり短い時間がかかる、ネイティブ大動脈に匹敵する成功と機能的な組織工学血管移植片を生成することが示されている。したがって、（皮膚から例えば、）線維芽細胞は、特定の個人に由来することができるので、個人細胞療法を使用する患者の治療のための有望な細胞源としてPiPSC存在する。このプロトコルで脱細胞化血管系はextracellulで播種された細胞を提供し、より生体模倣モデルを提供天然の大動脈11のより代表的なアルマトリックスタンパク質。これらのキーポイントは、その後、播種された細胞と組織工学血管の生存、分化と機能性を確保するために重要である。 Sumitran-Holgerssonらによる最近の研究では、このように、近い将来にヒトに現在のプロトコルの並進値を仮定すること、27を生着する前に亡くなった人から以前に脱細胞化ILLIAC静脈グラフトの成功した再増殖を示した。更に、脱細胞化された血管移植片は、組織工学移植片に寄与する他の血管細胞型の役割や行動を評価することができる良好なモデルを表すことができる。マウスにおけるこのモデルシステムは、将来の薬物スクリーニングのための、また、血管幹細胞生物学に関与する細胞および分子機構を解明する強力なツールを提供することができる。総合すると、現在のプロトコルはVASCへの応用のための有望な値を保持ウラル組織工学および個別化医療における画期的な製品。
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Disclosures
著者は、競合する経済的利益を持っていない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Fibroblasts CCL-153 | ATCC | CCL-153 | Prenatal human embryonic fibroblasts |
| ATCC F-12K Medium (Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium) | ATCC | 30-2004 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells | Life technologies (Gibco) | 12660-012 | |
| Knockout Serum Replacement | Life technologies (Invitrogen) | 10828-028 | |
| Human Basic FGF-2 | Miltenyi Biotech | 130-093-837 | |
| alpha-MEM medium | Life technologies (Invitrogen) | 32571093 | |
| Human PDGF | R&D System | 120-HD-001 | |
| Gelatin Solution 2% | Sigma | G1393 | |
| Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC) | Addgene | 20866 | |
| PvuI Restriction Enzyme | New England Biolabs | RO150S | |
| SureClean Plus | Bioline | BIO-37047 | |
| Nucelofection Kit (NHDF Kit) | LONZA | VPD-1001 | |
| Neomycin | SIGMA | G418 | |
| KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy | SCHOTT | KL 1500 LCD | Cold light illumination for stereo microscopy |
| Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800 | Nikon | SMZ800 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| 10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent | Severn Biotech | CAS 151-21-3 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Matrigel (10mg/ml) | BD | A6661 | |
| Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7 | Jepson Bolton's, Janke&Kunkel | S32-102 | |
| Masterflex L/S Digital Pump Drive | Cole-Parmer | WZ-07523-80 | |
| Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head | Cole-Parmer | EW-07519-15 | |
| Masterflex L/S large cartridges for pump head | Cole-Parmer | EW-07519-75 | |
| Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft | Cole-Parmer | WZ-96410-14 | Tubing goes through the peristaltic pump |
| 0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing | SILEX | N/A | Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber |
| Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline | Ibidi | 10829 | Adapter connect above two types of tubings |
| 1/32" Tubing, ID 0.01" (250µm) Material: PEEK | LabSmith | T-132-010P | Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing |
| One-Piece Fittings | LabSmith | T-132-100 | Fix the above tubings through the incubation chamber wall |
| Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm) | Smiths Medical | N/A | Tubings insert into two ends of the aorta graft |
| NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mouse | Charles River | ||
| Surgical sutures, 8-0 silk | ETHICON | W819 | |
| Hypnorm | Vetapharm | Vm21757/4000 | Neuroleptanalgesic for use in mice |
| Hypnovel (Midazolam) | Roche | 59467-70-8 | Induction of anaesthesia |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Nylon Tubing | Portex LTD | 800/200/100/200 | 0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff |
| Electrocoagulator | Martin | SN 54.131 | Ligation of artery branches on aorta |
| Bipolar micro hemostat forceps | Martin | 80-91-12-04 | Fixation of vessel ends |
| Vessel Dilator | S&T | JFX-7 | |
| Vessel Dilator | S&T | JFL-3dZ | |
| Vessel Dilator | S&T | D-5aZ | |
| Mini applier | AESCULAP | FE572K | |
| Micro hemostats clips | AESCULAP | FE720K | |
| Surgical sutures, 6-0 VICRYL | ETHICON | V489 |
References
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