Summary
여기, 우리는 두 번 시드를 부분적으로 유도 만능 줄기 세포로 쥐에 이식을위한 기능적인 조직 설계 혈관 이식을 생성하는 프로토콜을 제시 (PiPSC은) - 탈세 포화 선박 발판 생물 반응기에서 유래 내피 세포 - 평활근 세포 및 PiPSC 산출했다.
Introduction
혈관 도관의 건설은 심혈관 질환으로 인한 손상 및 손상된 혈관의 수술 수리에 대한 기본적인 전략이다. , 동종 이식,자가 조직 (심낭 또는 복재 정맥)과 이종 이식 1, 현재까지 수술에 사용 된 이식 재료는 생체 적합성 합성 고분자 ([고어 텍스의 ePTFE] 또는 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 [쿠론] 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 [테플론, 확장 된 폴리 테트라 플루오로 에틸렌)을 포함한다. 인공 이식 (예를 들어 고어 텍스 쿠론)이 가장 일반적으로 사용되는 반면, 이러한 재료 가능성 협착증, 칼슘 증착, 혈전 색전 감염을 포함 수많은 장단기 합병증을 일으킨다. 와 현재 생물학적 이식 환자는 혈전 색전증 감소하지만, 그들은 여전히 석회화 열화이 때문에 차 이식 실패 및 단축 내구성으로 제한을 발생합니다. 따라서, 수술 t을 크게 향상에도 불구하고년, 연구자와 임상의를 통해 echniques 여전히 혈관 질환을위한 이상적인 도관을 식별의 필요성 부담한다. 더 최근에, 혈관 조직 공학의 연구 분야는 세포를 성공적 래프팅 1 기능성 용기 전형 생체 모방 환경을 만들 목적으로, 생분해 성 지지체에 혼입되어있는 개념을 생성하고있다. 기본적으로 혈관 구조의 성공은 세 가지 필수 구성 요소에 따라 달라집니다; 즉, 발판, 내피 세포 내층 및 평활근 세포 층, 네이티브 맥관계에 필적 기계적 특성을 제공하기 위해 적절한 세포 외 기질을 함유하는 지지체, 및 / 조절을 개시에 필요한 세포 / 분자 시그널링을 포함 셀 수리.
장기 이식 개통과 신 조직의 지속적인 개발, 제 비계의 효과적인 세포 파종에 크게 의존ereby 매우 중요한 세포 유형의 결정을 렌더링. 몇몇 보고서 소경 도관 3-6 개발 성숙한 내피 다양한 소스로부터 평활근 세포의 사용을 입증한다. 유망하지만, 충분한자가 혈관 내피 부족 성숙한 평활근 세포가 상당한 부담으로 작용 얻었다. 최근에, 다양한 소스로부터의 줄기 세포는 혈관 조직 공학 어플리케이션에 이용되어왔다. 실제로, 배아 줄기 세포 (7)를 포함한 줄기 세포 다양한 종류의 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs) 8,9, PiPSC 10,11, 골수 유래 단핵구 (12), 중간 엽 줄기 세포 (13), 혈관 내피 전구 세포 및 성숙한 혈관벽 줄기 세포 유래 한 항원 SCA (-1) + (14, 15)이 정의 된 모든 미디어에 응답 내피 기능 중 하나 또는 평활근 세포로 분화 할 수있는 것으로 입증되었다 줄기 / 선조 세포 및배양 조건. 또한, 줄기 세포의 무제한 자기 갱신 용량은 그들 만 성숙한 내피 성장 정지 및 노화를 진행하기 전에 한정된 횟수 위해 나눌 수 평활근 세포와 달리 더 나은 후보를 만든다.
그 래프팅은 생체 적합성, 생체 역학적 특성 및 생분해 속도 등 여러 가지 요인에 따라 달라위한 골격 물질의 선택은 성공적인 조직 공학적 용기를 생성한다. 기본적으로, 물질은 생분해해야 이식을위한 발판을 만드는 데 사용하고 불필요한받는 사람 면역 반응을 탑재되지 않습니다. 또한, 세포 부착과 이후의 생존에 적합한 기공 및 미세을 포함해야합니다. 현재까지, 혈관 조직 공학에서 사용되는 지지체 가장 일반적인 재료는 폴리 글리콜 산, 폴리 락트산, 폴리 카프로 락톤 ε (16)의 중합체를 포함한다. 최근 탈세 포화 된 생물학적 물질은 할또한 일부 성공을 적용. 여러 실험실자가 세포와 탈세 포화 인간, 개 또는 돼지의 혈관을 뿌리는 것은 응고 내막 증식증 17-19 저항 생물학적 이식을 한 것으로 나타났습니다. 혈관 조직 공학의 다른 전략은 비계 지원 (20), (21)없이 예를 들어, 세포 외 기질 단백질 기반의 혈관 이식, 섬유소 젤 (13)에 파종 세포 생성 세포 시트를 포함한다.
현재의 프로토콜 기능 내피 세포와 평활근 세포, 중증 합병 면역 결핍증에 조직 공학 혈관의 기능 PiPSC 유래 혈관 세포를 항구 탈세 포화 된 혈관 지지체로 구성된 생물 반응기 및 이식의 세대 (SCID에 인간 PiPSC의 분화를 보여줍니다 ) 마우스. PiPSC이 세포는 쥐에서 종양을 형성 윤리적 제기하지 않기 때문에 혈관 이식의 조직 공학에 사용할 최적의 세포 유형이며,동종 면역 반응. 더욱이, 우리는 핍 내피 세포 및 핍 - 평활근 세포를 생성하기위한 전략이 효율적인 10,11 재현임을 보여 주었다. 그 후, 우리는 따라서 이식과 생존 효능을 향상 밀접하게 네이티브 용기 내에 존재하는 기질 단백질을 모방하는 PiPSC 유래 혈관 세포의 파종을위한 탈세 포화 된 선박을 설계했습니다. 또한, 종래 PiPSC 뿌리기에 용기의 탈세 포화가 대 식세포 등의 면역 세포 유형에 의해 마운트 염증 반응의 발생을 방지한다. 더 중요한 것은,이 프로토콜은 단지 인간 번역에 대한 혈관 도관 유망 생성하는 방법을 나타내지 않는, 또한 연구 및 마우스 모델을 통해 혈관 조직 재생을 제어하는 분자 메커니즘을 이해 귀중한 수단을 제공한다.
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Protocol
실험 동물의 사용 및 관리에 대한 기관위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 모든 동물 실험을 수행합니다.
문화 미디어 1. 준비
- F-12K 보통, 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 100 U / ml의 페니실린과 스트렙토 마이신 : 인간 섬유 아 세포주 CCL-153 배지 만들기.
- PiPSC 생성을위한 프로그램을 다시 미디어를 확인 : 마네 둘 베코의 수정 독수리의 매체 (DMEM) 20 % 녹아웃 혈청 교체, 0.1 MM의 β-머 캅토 에탄올, 0.1 mM의 최소 필수 중간 (MEM) 비 필수 아미노산, 10 NG / ml의 염기성 섬유 아세포 성장 인자를 포함하는 2 (bFGF를-2) 및 100 U / ml의 페니실린과 스트렙토 마이신. 미디어를 사용하기 전에 bFGF를-2를 갓마다 추가합니다.
- 평활근 세포를 유도 분화 매체 (DM)를 확인 (SMC) 분화 : 10 % FBS, 0.1 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 100 U가 / ㎖ 및 스트렙토 마이신 25 NG / ml의 혈소판 유래 성장 인자를 포함하는 미디어-MEM (α)(PDGF-ββ).
- 확인 내피 분화 미디어 내피 세포 (EC)의 분화를 유도하는 (EC-DM) : 내피 성장 미디어 -2- (EGM-2) 50 NG를 함유 배지 / ㎖ 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 100 U / ml의 페니실린과 스트렙토 마이신.
부분적으로 유도 다 능성 줄기 세포로 재 프로그램 2. 인간 섬유 아세포 (PiPSC)
- 배양액을 0.04 % 젤라틴 용액 도포 플라스크에 배양 인간 섬유 아세포 세포주 CCL-153.
- 통로 셀 (1)의 비율로 3 일마다 6. PiPSC 발생의 최적의 효율성을 위해 통로 (9) 전에 세포를 사용합니다. 90 % 컨 플루 - 세포는 80에 도달하면 형질 전환을위한 준비가되어 있습니다.
- (4) 재 프로그래밍 인자를 함유하는 폴리 시스 트론 플라스미드 pCAG2LMKOSimO 선형화 옥타 - 결합 전사 인자 4 (인 Oct4)를 SOX2, 크 룹펠 형상 인자 4 (KLF4) 및 C-MYC (pCAG-OSKM). 37 ° C에서 3 시간 동안 PvuI 제한 효소 5 유닛 플라스미드 5 μg의 다이제스트. 정화제조 업체의 프로토콜에 따라 상용 키트와 함께 플라스미드.
- 트랜 제조 업체의 프로토콜에 따라 인간 피부 섬유 아세포 (NHDF) nucleofection 키트와 함께 전기에 의한 선형 pCAG-OSKM 플라스미드 4 μg의 2 × 10 (6) 인간 섬유 아세포. 부드럽게 미리 예열 재 프로그래밍 매체 5 mL를 함유하는 미리 0.04 % 젤라틴 코팅 된 T25 플라스크에 형질 감염된 세포를 시드.
- 24 시간 후, 형질 세포의 순수한 인구를 선택하는 25 ㎍ / ml의 네오 마이신의 보충제 매체 변경합니다.
- 4 일까지 매일 매체를 변경합니다.
참고 : 인간 섬유 아세포는 재 프로그래밍 4 일 후에 PiPSC된다.
내피 세포 및 평활근 세포에 PiPSC 3. 차별화
- 4 일 동안 DM을 포함하는 콜라겐 IV의 사전 코팅 요리에 씨 PiPSC는 SMCs로 분화를 유도합니다. 4 일까지 매일 매체를 변경합니다.
- 콜라겐 IV의 사전 코팅 요리 C에 씨앗 PiPSC육일에 대한 내피-DM을 ontaining은 내피 세포로 분화를 유도합니다. 6 일까지 매일 매체를 변경합니다.
4. 탈세 포화 대동맥 이식 준비
참고 : 모든 솔루션과 장비는 멸균해야한다.
- 자궁 경부 전위로 마우스를 희생하고 해부 현미경 부정사 위치에 마우스를 고정합니다.
- 흉강을 엽니 다 흉골을 통해 흉곽 주위를 잘라. 대동맥을 노출 심장, 폐, 식도를 제거합니다. 부드럽게 집게로 사망시 대동맥의 지방을 제거합니다.
- 가위로 앞쪽 끝에서 대동맥을 잘라 부드럽게 무딘 집게로 끝을 잡고. 무딘 절개에 의한 뒤에 척추 열에서 대동맥를 분리합니다. 조심스럽게 바이폴라 electrocoagulator와 결찰에 의해 대동맥에서 모든 분기 동맥을 닫고 가위로 결찰의 끝에서 절단.
- 3m로 대동맥 루멘를 세척하기 위해 5 ML의 주사기를 사용하여혈전의 형성을 방지하기 위해 100 U 헤파린을 함유하는 식염수 L.
- 신장으로 가지 전에 대동맥의 뒤쪽 끝을 잘라. 대동맥의 무결성을 유지하면 전체 절차를 수행하는 동안 매우 중요합니다.
- 인산 완충 식염수 (PBS)에 희석 0.075 % 소듐 도데 실 설페이트 (SDS) 용액 5 ㎖와 대동맥 루멘 플러시.
- 10cm 페트리 접시에 0.075 % SDS 솔루션의 흉부 대동맥을 적 십니다. 실온에서 150 rpm에서 2 시간 동안 진탕에 페트리 접시를 놓습니다.
- PBS의 5 ml의 대동맥 루멘을 플래시합니다.
- 10cm 페트리 접시에 PBS의 대동맥을 적 십니다. 실온에서 150 rpm에서 2 시간 동안 진탕에 페트리 접시를 놓습니다. PBS마다 20 분을 새로 고칩니다.
- PBS의 5 ml의 대동맥 루멘을 플래시합니다.
- 최대 일주일 동안 4 ° C에서 PBS에서 탈세 포화 대동맥 이식을 유지합니다.
PiPSC 및 생물 반응기 컨디셔닝 5. 듀얼 시드
참고 : 모든 솔루션을s와 장비는 멸균해야한다. 조직 문화 후드에서 모든 작업을 수행합니다.
- 그림 1에 도시 된 바와 같이. 생물 반응기의 흐름 회로를 조립 튜브와 함께 배양 챔버, 미디어 저수지, 연동 펌프 및 규정 준수 챔버를 연결합니다. 순환에 필요한 매체의 최소한의 부피는 40 ml의입니다.
- 전제 조건 10cm 페트리 접시에 DM 매체 대동맥 담가 배지와 탈세 포화 된 용기. 실온에서 50 rpm으로 1 시간 동안 진탕에 페트리 접시를 놓습니다.
- 현미경으로 탈세 포화 된 선박의 양쪽에 1cm 길이 나일론 튜브 (OD 0.9 mm, ID 0.75 mm)를 삽입합니다. 선박과 8-0 실크 봉합사와 튜브를 묶어.
- 챔버 벽으로부터의 입구 및 출구 포트 (1/32 "튜브)와 나일론 튜브를 연결하여 배양 챔버에서 탈세 포화 된 대동맥 이식술을 조립한다. 매체의 5mls 각 시간 배양 챔버를 유지한다.
- 추가 예열로를 Trypsinize PiPSC트립신은 배양 접시를 커버하고 부드럽게 요리 10 배 바위. 트립신을 취소하고 2 인큐베이터에서 접시를 떠나 - 3 분. 접시에 예열 문화 매체를 추가하고 세포와 매체를 혼합한다.
- 혈구를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 원심 분리기 300 x g에서 5 분 동안 5 × 105 세포를 함유하는 각각의 세포 현탁액의 두 분액. 완전히 뜨는을 대기음.
- 완전히 상층 액을 흡입 한 후, DM의 50 μL에 주사위 세포 펠렛 1 펠렛을 재현 탁. 탈세 포화 혈관 내강에이 세포 현탁액을 주입한다.
- 이어서, 마트 리겔 100 ㎕의 주사위에 다른 세포 펠렛을 재현 탁. 조심스럽게 탈세 포화 대동맥 이식 상 혼합물을 피펫.
- 혼합물이 용기 외부 표면을 감싸는 고르게 겔 상태로 전환 때까지 15 분 - 10 기다립니다. DM으로 배양 챔버를 입력합니다.
- 37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에서 설정 전체 생물 반응기를 배치. 수동으로 처음 2 시간에서 탈세 포화 이식을 종축 모든 반 시간 약 90 ° 회전합니다.
- 세포 부착 가능하도록 12 시간 동안 정적 문화를 유지합니다.
- 평활근 세포의 분화를 유도하는 연동 펌프로 루멘을 통해 DM을 제공한다. 5 ml / 분 및 24 시간에 걸쳐 20 ㎖ / 분으로 단계적으로 증가시 초기 유속을 시작합니다.
- 24 시간 동안 20 ㎖ / 분에서 매체 순환 유량을 유지.
- 매체 흐름을 중지하고 인큐베이터에서 설정 생물 반응기를 이동합니다.
- 다시 씨앗 PiPSC와 이식의 루멘. 5.6 -를 Trypsinize는, 단계 5.5로 계산 원심 분리기 1 × 6 PiPSC. 50 NG / ㎖ VEGF를 함유 EGM-2 배지에 50 μl의 세포를 재현 탁. 그래프트의 루멘으로 세포 혼합액을 주입한다.
- 내피 세포의 분화를 유도하기 위해 50 NG / ml의 VEGF를 포함 EGM-2 배지에 배양 챔버 및 전체 순환 매체를 변경합니다.
- 토륨 설정을 다시 생물 반응기를 이동전자 인큐베이터. 수동으로 이식을 처음 2 시간 90 ° 30 분마다 회전 한 다음 12 시간 동안 정적 문화를 유지.
- 5 ㎖ / 분, 35 ㎖ / 분으로 단계적으로 상승에 순환류 시작. 오일에 35 ㎖의 유속 / 분 유지. 매일 순환 챔버 매체 변경합니다.
- 마우스에 더 이식에 대한 설계 이식을 수확.
마우스로 두 번 시드 PiPSC 이식 6. 손톱
- 사용 NOD.CB17-Prkdc의 SCID / 혈관 이식받는 사람으로 NcrCrl 수컷 마우스. 35g, 그리고 좋은 건강 상태를 유지하고 있습니다 - 항상 마우스는 약 10 주입니다 약 25의 무게를 확인합니다.
- 복강 Hypnorm (25 ㎎ / kg) 및 Hypnovel (25 ㎎ / kg)의 조합을 투여함으로써받는 마우스를 마취. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 바셀린 안과 연고를 적용합니다. 마우스는 편안한 근육을 가지고 꾸준히 호흡하도록함으로써 효율적인 마취를 확인합니다.
- 목 면도 및 확장에 누운 위치에 마우스를 고정합니다. 마우스 호흡기가 선명합니다 있는지 확인하기 위해 마취제와 함께 아트로핀 황산 (1.7 ㎎ / ㎏)을 관리합니다.
- 마우스의 흉골에 하악에서 중간 선 절개를 준비합니다. 5 ~ 10 배 증폭과 해부 현미경, 측면 오른쪽 침샘을 들어 올려 오른쪽 경동맥을 노출 할 권리 cleidomastoid 근육을 제거합니다.
- 조심스럽게 기단을 향해 선단에서 오른쪽 경동맥을 동원에 부착 된 조직을 제거합니다. 8-0 실크 봉합사로 두 번 경동맥 중간 부분을 결찰하고 두 관계 사이 해부.
- 각 용기의 끝에서 멸균 나일론 튜브로 만든 커프를 통과 microhemostat 클램프 각 끝을 고정합니다.
- 한 끝에 봉합 넥타이를 제거하고 헤파린의 드롭 (100 U / ml)에 적용됩니다. 직후 번째의 선단부를 반전전자 동맥 전체 커프 몸을 커버하고 팔목에 8-0 실크 봉합사로 반전 용기를 해결합니다.
- 동맥의 다른 부분에 동일한 절차를 반복한다. 식염수로 세척 동맥이 혈전을 제거합니다.
- 동맥 커프 통해 용기의 탈세 포화 된 단부 슬라이딩 8-0 실크 봉합사로 고정하여 경동맥 양단 탈세 포화 용기 그래프트 임플란트. 이식의 맥동을 평가하기 전에를 종료에서 혈관 클램프를 제거합니다.
- 원래 위치로 오른쪽 침샘을 놓습니다. 6-0 polyglactin 봉합사를 사용하여 중단 된 봉합 수술 위치에 피부를 닫습니다.
- 절차가 완료된 후에는 의식이 재개 될 때까지 지속적으로, 마우스의 활력 징후를 관찰한다. 자궁 경부 전위 수확 용기 이식에 의해 24 시간 이상 추가 분석을 위해 삼주를받는 사람 쥐를 희생.
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Representative Results
PiPSC의 성공적인 세대는 4 전사 인자, 인 Oct4, SOX2, KLF4 및 C-MYC (OSKM)를 운반하는 선형화 된 pCAG2LMKOSimO 플라스미드와 인간의 섬유 아세포를 nucleofecting 후 사일 확인되었다. PiPSC 섬유 아세포 (그림 2A)에 비해 현저하게 별개의 표현형을 표시의 mRNA (그림 2B)와 단백질 (그림 2C) 레벨 10에서 4 재 프로그래밍 요소를 표명했다. PiPSC 기반 혈관 이식의 효능은 모두 내피 세포와 평활근 계통으로 분화 할 수있는 PiPSC의 능력에 크게 의존한다. 그것은 그림 3. 혈관 이식을 생성하기 위해 그들을 이용하기 전에 정의 미디어의 세포를 구별하여 체외에서 PiPSC의 이러한 속성을 확인하는 것이 중요하다 (두 유전자 (그림 3A)에서 기능 내피 세포로 분화 할 수 PiPSC의 용량을 보여주고 단백질 그림 3B-D) 레프ELS, 내피 특정 마커 (10)를 기반으로. 마찬가지로 PiPSC 또한 특정 미디어 (도 3E-H) (11)에 응답하여 평활근 계통으로 분화 할 수있다.
전체 대동맥 탈세 포화가 SDS, 세포 lyses 세포질 성분을 가용화 음이온 성 세제로 처리하여 달성되었다. 갓 수확 대동맥 (도 4A-B) (22)에 비해 2 시간 처리 후, 탈세 포화 대동맥 반투명 무 세포 골격으로 나타났다. 도 4c-F 조직 학적 평가가 아니라 통상의 마우스의 대동맥, 탈세 포화 핵 또는 세포질 염색 혈관의 부재를 나타낸다. PiPSC 유래 내피와 탈세 포화 대동맥 내 평활근 세포의 두 번 시드에 따라, 설계 혈관 이식은 각각 내피 세포와 평활근 세포의 속성을 표시합니다. 이중의의 헤 마톡 실린 및 에오신 (HE) 염색평활근-22α (SM22), 평활근-α 액틴 양성 염색 (SMA)에 의해 확인으로 eeded 이식은 평활근 세포와 내피 세포의 단층 여러 계층의 네이티브 선박 (그림 4 세대)와 유사한 구조를 밝혀 각각 (그림 4H-M) 11 CD31와 CD144 마커.
생체 내에서 조직 공학 혈관의 개통 성을 확인하기 위해 두 번 시드 PiPSC 유래 혈관 마우스에 이식 한 - 일반 마우스와 탈세 포화 동맥 모두가 대조군으로 사용 하였다. 후속 분석 생쥐 빠르면 일 1과 현저하게 높은 사망률되게 탈세 포화 혈관 그래프트하면서 PiPSC 혈관 이식 3 주 11 이식 (도 5a) 후 60 %의 생존율을 부여한 것으로 나타났다. 또한 3 주 이전 PiPSC 파생 이식은 완전한 인간 PiPSC 유래 내피 세포의 존재를 특징으로하고, 평활근 세포와 호스트 식세포 침윤 (도 5b 및 표 1) (11). 함께 찍은, 결과는 PiPSC 모두 혈관 계통으로 분화 할 수있는 능력을 가지고 생체 내에서 네이티브 혈관을 대체 할 수있는 기능 조직 공학 혈관을 생성하기위한 강력한 것을 나타냅니다.
탈세 포화 이식 생물 반응기의 흐름 회로의 도식 표현을 그림. 탈세 포화 혈관 이식은 배양 챔버에서 조립된다. 연동 펌프는 안정된 중간 관류 유동을 제공하도록 배양 챔버의 상류에있다. 미디어 저수지 배양 챔버의 하류에있다. 준수 챔버는 흐름 제도를 개선하는 것입니다. 유동 방향은 화살표로 표시된다.large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 인간 섬유 아세포에서 PiPSC의 2 세대. 인간 섬유 아세포 중 네 재 프로그래밍 유전자 nucleofected되었다 (인 Oct4, SOX2, KLF4 및 C-MYC) 또는 빈 벡터 (제어). (A) 위상 콘트라스트 사진 4 일 후 주사위의 형태를 보여줍니다. PiPSC는 mRNA의 (B)와 단백질 (C) 수준에서 네 전사 인자를 모두 발현. 표시된 이미지 스케일 바는 50 μm의 아르와 데이터는 평균 ± SEM이다 (N = 3); * P <0.05, *** P <0.001. 이 수치는 Margariti, A. 등 알에서 수정되었습니다. (10) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. </>
PiPSC 모두 내피 세포와 평활근 세포로 분화 할 수 있습니다 그림 3.. PiPSC 또는 제어 세포는 내피 세포로 분화되었다. 대조군 세포와 비교하여 (A), 내피 세포 PiPSC는 유래 예컨대 CD31, CD144, 키나제 삽입 도메인 수용체 (KDR), mRNA의 내피 산화 질소 합성 효소 (eNOS의) 및 폰의 빌레 브란트 인자 (vWF의)와 같은 내피 세포 특이 마커를 발현 수준. (B)는이 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 단백질 수준에서 확인되었다. (C) 면역 형광 염색 CD144 PiPSC - 내피 (VE-cadherin의)의 긍정적 인 염색을 표시하지만, 세포를 제어하지. (D) 흐름 세포 측정 분석 CD31와 CD144의 PiPSC 내피 세포 발현을 확인했다. 콜라겐 IV-시드 PiPSC (또는 제어 세포)도로 분화되었다평활근 세포. (E, F) 셀을 제어 달리 PiPSC 유래 평활근 세포는 SMA, calponin, SM22, 평활근 미오신 중쇄 II (SMMHC), 혈청 반응 인자 (SRF)를 포함하여, 유전자 수준에서 평활근 특이 마커를 발현 , myocardin, smoothelin, 엘라스틴과 콜라겐 1A1. (G) PiPSC 유래 세포에서 SMA, calponin와 SM22의 발현 수준은 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 확인 하였다. 공 초점 현미경을 사용하여 (H) 면역 형광 염색 및 calponin SM22위한 전형적인 평활근 마커 염색을 보여 주었다. 데이터는 평균 ± SEM을 나타낸다 (N = 3); * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. 표시된 이미지 스케일 바는 25 μm의 50 μm의입니다. 숫자는 Margariti, A. 등. 10 Karamariti, 등. 11 E.에서 수정 된 하세요이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
두 번 시드 PiPSC 유래 조직 공학 혈관 이식의 그림 4 세대. (A는 B) 마우스 흉부 대동맥의 탈세 포화는 구조를 보존하고 여전히 닮은 그 보통의 용기, 원래 배율 2 배의. 50X 또는 200X : 컨트롤, 원래의 확대에 비해 탈세 포화 대동맥 (CF) HE 염색 성공 탈세 포화와 세포의 완전한 제거를 확인했다. PiPSC 유래 내피 세포와 평활근 세포의 (G) HE 염색을 두 번 시드 선박 고유의 용기와 유사했다 아키텍처를 밝혔다. (J, M) 내피 세포 (CD31 및 CD144) 양성 스테인드 두 번 시드 PiPSC 조직 공학 혈관 평활근 세포 (SM22 및 SMA) 가감 속과는 달리 마커를llularized 혈관 이식. (H, K) 혈관 마커뿐만 아니라 PiPSC 유래 내피 내막과 내측 영역 내 평활근 세포의 형태 및 특성 편재 수반 네이티브 식 용기에 필적 하였다. 표시된 이미지 스케일 바는 50 μm의입니다. 이 수치는 영, T. 등. 22 Karamariti, E. 등에서 수정되었습니다. (11)는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 두 번 시드 PiPSC 유래 조직 공학 혈관 이식은 생체 내에서 네이티브 혈관을 대체하기위한 특허이다. PiPSC 유래 혈관 중증 합병 면역 결핍증의 경동맥 (SCID) 마우스, 일반 양해 각서 (MOU)에 이식되었다탈세 포화 SE 및 동맥을 대조군으로 사용 하였다. PiPSC 유래 혈관에 이식 생쥐의 (A) 분석 생존율 3 주 수술 후 60 %를 보여, 현저하게 높은 사망률과 낮은 생존율 (20 %)되게 탈세 포화 혈관과 이식 생쥐 반면. 데이터는 (N = 10) 수단을 나타냅니다. (B)는 조직 공학 혈관은 이식 후 3 주 수확 HE (왼쪽 패널) 또는 인간의 CD144 및 calponin 또는 마우스는 CD11b / CD18 (맥-1)의 존재에 대한 면역 형광 염색 (오른쪽 패널)을 실시 하였다; 염색의 정량은 표 1에 요약되어있다. 명시되지 않는 한 표시 이미지 원본 배율이 400 배입니다. 이 그림은 Karamariti에서 수정 된, E. 등. (11)는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 양성 세포 필드 (40X) | 이식 전에 엔지니어링 혈관 | 엔지니어링 혈관 이식 (3 주) |
| calponin | 72 ± 9 | 22 ± 11 * |
| CD144 | 20 ± 8 | 5 ± 6 * |
| 맥-1 | 0 | 71 ± 11 * |
식립 후 3 주 조직 공학 혈관 표 1. 특성. PiPSC 유래 내피 세포와 평활근 세포와 호스트 대 식세포의 수는 인간의 calponin과 면역 형광 염색법 다음 정량 하였다, 인간의 CD144 및 마우스 맥 각각 1. 데이터는 평균 ± SEM 대표 (N = 6); * P <0.05, 이식 전에 조직 공학 혈관에서 유의 한 차이. 이 테이블은 Karamariti, E. 등에서 수정되었습니다. (11)
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Discussion
현재 프로토콜은 기능적 조직 공학 혈관 PiPSC 인간 섬유 아세포를 사용하여 생성 될 수있는 사운드, 빠르고, 단순하고 재현성 효율적인 전략을 나타낸다. 이 기술은 가까운 미래의 재생 의학, 조직 공학 및 잠재적 환자 맞춤형 세포 치료를위한 유용한 도구를 나타냅니다. 프로토콜의 효능을 보장하는 중요한 단계는 혈관 생물 반응기에서 PiPSC의 준비, 멸균 완전히 탈세 포화 대동맥 이식, 발판에 PiPSC의 성공적인 파종과 분화의 준비와 대동맥 이식의 유지 불임을 포함한다.
조직 공학 이식의 성공적인 생성을 시작하기 위해, PiPSC의 제조를 효과적으로 수행되도록하여 가장 중요하다. 프로토콜 성공적 pCAG2LMKOSimO OSKM 플라스미드와 nucleofection 통해 PiPSC로 인간 섬유 아세포 세포주 '를 재 프로그램'있다. surviv 중nucleofection 후 섬유 아세포의 알은 높은 품질의 OSKM 플라스미드를 사용하는 등 몇 가지 주요 포인트에 의존, 500 사이의 범위의 농도의 플라스미드 - 세포의 도입 다음에 특히 민감로 1,000 ng 등 / μL, 즉시 nucleofection 후 섬유 아 세포의 파종 지연을 방지 마지막으로 비교적 큰 플라스미드 및 중요하고 사용 직전 새로 제조 매체에 첨가되어야 FGF-2의 첨가. 또한, 우리는 내피 세포 및 평활근 세포로 PiPSC 이후 분화에 효과적인 '재 프로그래밍'을 보장하기 위해 통과 9, 복제 성 노화를 방지 할 수있는 최대의 세포를 사용하는 것이 중요한 것을 발견했다. PiPSC의 순도는 네오 마이신과 nucleofected 셀 선택함으로써 개선 될 수있다. pCAG2LMKOSimO 플라스미드의 순수한 인구의 선택을 초래할 것이다 네오 마이신 내성 유전자 및 3 일간 nucleofection 후 25 ㎍ / ㎖의 1 일의 범위로 마이신 따라서 첨가을 갖는다PiPSC. 마우스에게 이식하기위한 효율적인 PiPSC 선박을 설계하기 위해, 우리는 탈세 포화 된 대동맥의 무결성 및 불임이 가장 높은 우선 순위의 것으로 간주된다. 전 대동맥의 무결성을 유지하고 지속적으로 그들은 상대적으로 약해과 크기에 상당히 소형 말하자면, 혈관을 처리하는 동안 손재주를 적용하는 탈세 포화 후에는 필요하다고합니다. 혈관 주위 조직 및 바이폴라 전기 coagulator를 이용한 분파 동맥 밀봉 효과적으로 제거 능력은 후속하는 배양을 보장하고 매체의 누출을 방지하는 것이 중요했다. 어떤 시점에서, 우리는 모든 재료와 장치는 생물 반응기 (즉, 집게, 튜브, 병, 실, 가위, 어댑터 및 커넥터) 따라서 세균 오염과 수술 전에 혈관 이식 실패의 위험을 감소, 오토 클레이브했다 생성하는 데 사용 보장 .
현재의 프로토콜은 심혈관 dise에 유망한 임상 응용 프로그램을 보유하는 동안ASE는, 상기 방법을 향상시키기 위해 가까운 미래에 개선되어야 몇 가지 제한이있다. 지금까지 OSKM의 전사 인자는 nucleofection를 통해 인간의 섬유 아세포에 도입되었다. 이 기술은 비교적 단순하고 간단하지만, 이는 또한 다른 실험 시간에 가변 형질 전환 효율의 결과. 특히, 이러한 불일치는, 상기 네오 마이신 선택의 추가 단계를 도입함으로써 극복 될 수있다. 유사하게, 하나의 잠재적 다음 감염 세포의 생존을 '리 프로그래밍'의 효율을 향상시킬 수있다 높이고 렌티 바이러스 통합을 사용하여 섬유 아세포로 4 가지 요소의 도입을 고려할 수있다. 생물 반응기의 관점에서, 우리는 완전한 대동맥의 탈세 포화가 0.075 % SDS를 사용하여 달성 할 수 있음을 발견 하였다. 이 기술은 세포의 제거를위한 최적으로 간주되었지만, 다른 계면 활성제 (예 : 트리톤 X-100), 그러나 그것은 P 발생할 수에 비해세포 외 기질 단백질 (23)의 구조 내의 울트라 otential 변경. 따라서,이 현상은 관련된 세포 외 기질 단백질의 혼란을 최소화하기 위해보다 효율적인 전략을 탈세 포화 보증. 또한, 우리는 또한 탈세 포화 대동맥의 직경과 벽 두께는 나이, 변형 및 배경에 따라, 마우스 사이에서 변화하고, 따라서 생물 반응기 내에서의 흐름과 전단 응력의 속도와 PiPSC 시드 다음 PiPSC의 분포에 잠재적 인 차이가 발생할 수 있음을 고려 . 이 모든 명확히 남아있다.
이 프로토콜은 본 명세서에서 심혈관 질환을위한 줄기 세포 치료의 임상 적용을위한 장래의 유망한 잠재력을 보유 PiPSC을 이용한 기능성 이식 조직 공학의 생성을 설명했다. 건너 뛰어 다른 (내피 또는 평활근 세포 중) 하나의 체세포 계보 (섬유 아세포)에서 직접 리 프로그래밍을 활용하여이 과정 pluripotency 관심의 안전하고 적절한 세포를 얻을 수있는 방법이 될 수 있습니다. 실제로, 몇몇 프로토콜은 그러나 여전히 병원에서의 사용과 관련하여 문제를 제기 관한 모두 인간 배아, 만능 줄기 세포와 성체 줄기 세포 24-26에서 줄기 세포의 생성을 설명하는 발표되었다. 이제 PiPSC 따라서 종양 형성의 우려를 제거 SCID 마우스에서 기형 종을 개발하지 않는 것으로 알려져있다. 또한, 세포 생성, 문화, 10, 11을 차별화 상당히 짧은 시간을, 네이티브 대동맥에 필적 성공적이고 기능적인 조직 설계 혈관 이식을 생성하는 것으로 나타났다. 따라서, (예, 피부) 섬유 아세포는 특정 개인으로부터 유도 될 수 있기 때문에 개인 세포 치료제를 사용하는 환자의 치료를위한 유망한 셀 소스로서 본 PiPSC. 이 프로토콜의 decellularised 혈관 시스템은 extracellul와 시드 세포를 제공하는 더 생체 모방 모델을 제공합니다네이티브 대동맥 (11)의 더 많은 대표 인 AR 매트릭스 단백질. 이 키 포인트는 그 후 시드 세포 및 조직 공학 혈관의 생존, 분화 및 기능을 확보하는 데 아주 중요하다. Sumitran-Holgersson와 동료의 최근 연구는 따라서 가까운 미래에 인간으로 현재 프로토콜의 번역 값을 가정 함, 27 생착하기 전에 사망 한 사람에서 이전에 탈세 포화 illiac 정맥 이식을 성공적으로 다시 채우기를 보여 주었다. 또한, 탈세 포화 혈관 이식편과 같은 역할과 조직 공학적 이식 혈관에 기여 다른 세포 유형의 동작은 평가 될 수있는 좋은 모델을 나타낼 수있다. 쥐에이 모델 시스템은 미래의 약물 검사하고 또한 혈관 줄기 세포 생물학에 관련된 세포 및 분자 메커니즘을 밝히는데 강력한 도구를 제공 할 수있다. 이와 함께, 현재의 프로토콜은 VASC에서의 응용 프로그램에 대한 유망한 값을 유지울라 조직 공학 및 맞춤 의학의 획기적인.
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Disclosures
저자는 충돌하는 금전적 이해 관계가 없습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Fibroblasts CCL-153 | ATCC | CCL-153 | Prenatal human embryonic fibroblasts |
| ATCC F-12K Medium (Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium) | ATCC | 30-2004 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells | Life technologies (Gibco) | 12660-012 | |
| Knockout Serum Replacement | Life technologies (Invitrogen) | 10828-028 | |
| Human Basic FGF-2 | Miltenyi Biotech | 130-093-837 | |
| alpha-MEM medium | Life technologies (Invitrogen) | 32571093 | |
| Human PDGF | R&D System | 120-HD-001 | |
| Gelatin Solution 2% | Sigma | G1393 | |
| Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC) | Addgene | 20866 | |
| PvuI Restriction Enzyme | New England Biolabs | RO150S | |
| SureClean Plus | Bioline | BIO-37047 | |
| Nucelofection Kit (NHDF Kit) | LONZA | VPD-1001 | |
| Neomycin | SIGMA | G418 | |
| KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy | SCHOTT | KL 1500 LCD | Cold light illumination for stereo microscopy |
| Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800 | Nikon | SMZ800 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| 10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent | Severn Biotech | CAS 151-21-3 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Matrigel (10mg/ml) | BD | A6661 | |
| Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7 | Jepson Bolton's, Janke&Kunkel | S32-102 | |
| Masterflex L/S Digital Pump Drive | Cole-Parmer | WZ-07523-80 | |
| Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head | Cole-Parmer | EW-07519-15 | |
| Masterflex L/S large cartridges for pump head | Cole-Parmer | EW-07519-75 | |
| Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft | Cole-Parmer | WZ-96410-14 | Tubing goes through the peristaltic pump |
| 0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing | SILEX | N/A | Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber |
| Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline | Ibidi | 10829 | Adapter connect above two types of tubings |
| 1/32" Tubing, ID 0.01" (250µm) Material: PEEK | LabSmith | T-132-010P | Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing |
| One-Piece Fittings | LabSmith | T-132-100 | Fix the above tubings through the incubation chamber wall |
| Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm) | Smiths Medical | N/A | Tubings insert into two ends of the aorta graft |
| NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mouse | Charles River | ||
| Surgical sutures, 8-0 silk | ETHICON | W819 | |
| Hypnorm | Vetapharm | Vm21757/4000 | Neuroleptanalgesic for use in mice |
| Hypnovel (Midazolam) | Roche | 59467-70-8 | Induction of anaesthesia |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Nylon Tubing | Portex LTD | 800/200/100/200 | 0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff |
| Electrocoagulator | Martin | SN 54.131 | Ligation of artery branches on aorta |
| Bipolar micro hemostat forceps | Martin | 80-91-12-04 | Fixation of vessel ends |
| Vessel Dilator | S&T | JFX-7 | |
| Vessel Dilator | S&T | JFL-3dZ | |
| Vessel Dilator | S&T | D-5aZ | |
| Mini applier | AESCULAP | FE572K | |
| Micro hemostats clips | AESCULAP | FE720K | |
| Surgical sutures, 6-0 VICRYL | ETHICON | V489 |
References
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