Summary
Her presenterer vi en protokoll for å generere vev konstruert fartøy grafts som er funksjonelle for pode i mus ved å dobbelt seeding delvis indusert pluripotent stamcelle (PiPSC) - avledet glatte muskelceller og PiPSC - avledet endotelceller på en decellularized fartøy stillas bioreaktor.
Introduction
Byggingen av vaskulære kanaler er en grunnleggende strategi for kirurgisk reparasjon av ødelagte og skadde fartøy som følge av hjerte- og karsykdommer. Til dags dato, pode materialer som brukes i kirurgi inkluderer biokompatible syntetiske polymerer (polytetrafluoretylen [Teflon], utvidet polytetrafluoretylen [ePTFE, Gore-Tex] eller polyetylentereftalat [Dacron]), allografter, autolog vev (hjerteposen eller saphenavene) og xenografts en. Mens kunstige transplantater (f.eks, Gore-Tex og Dacron) er mest brukt, disse materialene sannsynlig føre til mange kortsiktige og langsiktige komplikasjoner som inkluderer stenose, kalsium deponering, trombo-embolisering og infeksjoner. Selv om pasienter med biologiske grafts stede med redusert tromboemboliske hendelser, de fortsatt har begrensninger som sekundær graft svikt og forkortet holdbarhet på grunn av forkalkning degradering to. Derfor, til tross for betydelige forbedringer i kirurgisk techniques gjennom årene, forskere og klinikere er fortsatt beheftet med behovet for å identifisere den ideelle kanal for vaskulære sykdommer. Mer nylig har forskningsfeltet av vaskulær tissue engineering generert et konsept der cellene er innlemmet i biologisk nedbrytbare stillaser, med sikte på å skape en biomimetisk miljø som illustrerer en funksjonell fartøy for vellykket pode en. Fundamentalt, suksessen av de vaskulære konstruerer avhenge av tre viktige komponenter; celler som utgjør stillaset, dvs. en endotelcelle indre lag og en glatt muskelcellelaget, et stillas som inneholder den passende ekstracellulær matriks for å tilveiebringe mekaniske egenskaper sammenlignbare med det native vaskulatur, og molekyl / cellulær signalisering som er nødvendig for å initiere / regulerings reparasjon.
Langsiktig graft blod og bærekraftig utvikling av de neo-vev er svært avhengig av effektiv celle seeding av stillas, thereby rende avgjørelsen av celletype av avgjørende betydning. Flere rapporter demonstrere bruken av modne endothelial og glatte muskelceller fra ulike kilder for å utvikle liten diameter rør 3-6. Selv om lovende, av mangel på tilstrekkelige autologe fartøy få modne endotel og glattmuskelceller forblir en betydelig belastning. Mer nylig har stamceller fra forskjellige kilder blitt utnyttet for vaskulære vev tekniske anvendelser. Faktisk, en rekke stamcelletyper, inkludert embryonale stamceller 7, induserte pluripotente stamceller (iPSCs) 8,9, PiPSC 10,11, benmarg-avledet mononukleære celler 12, mesenchymale stamceller 13, endotelceller stamceller og voksen kar vegg -avledede stamceller antigen-1 (SCA-1) + stammen / progenitorceller 14,15 har alle blitt vist å være i stand til differensiering til enten funksjonell endotelceller og glatte muskelceller som respons på definerte medier ogdyrkningsforhold. Videre er den ubegrenset selvfornyelse kapasitet av stamceller gjøre dem bedre kandidater motsetning modne endotel- og glatte muskelceller som bare skiller etter et endelig antall ganger før under vekststans og begynnende alderdom.
Valget av stillasmateriale for å generere vellykket vev konstruert fartøy for poding, avhenger av flere faktorer slik som biokompatibilitet, biomekaniske egenskaper, og frekvensen av biologisk nedbrytning. Fundamentalt, materialer som brukes til å lage stillaser for grafts bør være biologisk nedbrytbart og vil ikke montere unødvendig mottakerimmunresponser. I tillegg må det omfatter en egnet porøsitet og mikrostrukturen for cellebinding og etterfølgende overlevelse. Til dags dato er de mest vanlige materialer som benyttes for stillas i vaskulært vev teknikk omfatter polymerer av polyglykolsyre, polymelkesyre, og poly ε-kaprolakton 16. Mer nylig decellularized biologiske materialer harogså blitt anvendt med en viss suksess. Flere laboratorier har vist at seeding decellularized menneske, hund eller svin fartøy med autologe celler gitt en biologisk pode som motsto blodpropp og intimal hyperplasia 17-19. Andre strategier i vaskulær tissue engineering inkluderer ekstracellulære matrix proteiner basert vaskulære implantater f.eks seeding celler i fibringel 13 og genererer celle ark uten stillas støtte 20, 21.
Den nåværende protokoll viser differensiering av humane PiPSC til funksjonell endotel og glattmuskelceller, generering av en bioreaktor som består av et fartøy decellularized stillaset til havn funksjonelle PiPSC-avledede vaskulære celler, og poding av vevet konstruert fartøy i alvorlig kombinert immunsvikt (SCID ) mus. PiPSC er en optimal celletype som skal brukes for tissue engineering av fartøys grafts fordi disse cellene ikke danne svulster hos mus eller høyne etisk ogallo-immunresponser. Videre har vi vist at strategien for å generere Pips-endotelceller og Pips-glatte muskelceller er effektiv og reproduserbar 10,11. Deretter laget vi en decellularized fartøy for såing av PiPSC-avledet vaskulære celler til tett etterligner matrix proteiner som finnes innenfor en innfødt fartøy, og dermed forsterke pode og overlevelse effekt. Videre er det decellularization av fartøyene før PiPSC seeding forhindrer forekomst av inflammatoriske responser montert immuncelletyper slik som makrofager. Enda viktigere, ikke denne protokollen ikke bare representerer en metode for å generere lovende vaskulære kanaler for oversettelse til mennesker, men gir også verdifull måte å studere og forstå de molekylære mekanismene som styrer vaskulær vev gjenfødelse gjennom musemodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Utføre alle dyreforsøk i henhold til protokoller godkjent av Institutional komité for bruk og vedlikehold av forsøksdyr.
1. Utarbeidelse av Culture Media
- Gjør kulturmedier for human-fibroblast-cellelinje CCL-153: F-12K Medium, 10% føtalt bovint serum (FBS) og 100 U / ml penicillin og streptomycin.
- Gjør Omprogrammering Media for PiPSC generasjon: Knockout Dulbeccos modifiserte eagle medium (DMEM) som inneholder 20% Knockout Serum Replacement, 0,1 mM β-mercaptoetanol, 0,1 mm Minste Essential Medium (MEM) Ikke-essensielle aminosyrer, 10 ng / ml basic fibroblastvekstfaktor 2 (bFGF-2) og 100 U / ml penicillin og streptomycin. Legg bFGF-2 fersk hver gang før du bruker mediene.
- Gjør Differensiering Media (DM) for å indusere glatt muskelcelle (SMC) differensiering: α-MEM medium inneholdende 10% FBS, 0,1 mM β-merkaptoetanol, 100 U / ml penicillin og streptomycin og 25 ng / ml blodplateavledet vekstfaktor(PDGF-ββ).
- Gjør endothelial Differensiering Media (EF-DM) for å indusere endotelceller (EF) differensiering: endothelial vekst media-2 (EGM-2) media inneholder 50 ng / ml vascular endothelial growth factor (VEGF) og 100 U / ml penicillin og streptomycin.
2. omprogrammering humane fibroblaster inn Delvis-indusert Pluripotent stamceller (PiPSC)
- Kultur human-fibroblast-cellelinje CCL-153 på 0,04% gelatin løsning belagte kolber i kulturmediet.
- Passage celler hver 3 dager på forholdet 1: 6. Bruke celler før passering 9 for optimal effektivitet av PiPSC generasjon. Cellene er klar for transfeksjon ved oppnådd 80-90% confluency.
- Linearize polycistronic plasmid pCAG2LMKOSimO inneholder 4 omprogrammering faktorer octamer-bindende transkripsjonsfaktor 4 (OCT4), SOX2, Kruppel-lignende faktor 4 (KLF4) og C-MYC (pCAG-OSKM). Fordøye 5 ug plasmid med 5 enheter av restriksjonsenzymet Pvul i 3 timer ved 37 ° C. Renseplasmidet med et kommersielt kit ifølge produsentens protokoll.
- Transfektere 2 x 10 6 humane fibroblaster med 4 ug linearisert pCAG-OSKM plasmid ved elektroporering med humane dermale fibroblaster (NHDF) nucleofection kit ifølge produsentens protokoll. Forsiktig frø transfekterte celler på pre- 0,04% gelatin belagt T25 kolbe som inneholder 5 ml forvarmet Omprogrammering Media.
- Etter 24 timer, endrer medium med tilskudd av 25 pg / ml neomycin for å velge en ren populasjon av transfekterte celler.
- Endre medium annenhver dag til dag 4.
Merk: Menneske fibroblaster bli PiPSC etter 4 dager med omprogrammering.
3. Differensiering av PiPSC inn endothelial og glatte muskelceller
- Seed PiPSC på kollagen IV pre-belagt retter som inneholder DM for 4 dager å indusere differensiering i SMC. Endre medium annenhver dag til dag 4.
- Seed PiPSC på kollagen IV forbelagte retter containing endotelial-DM i 6 dager for å indusere differensiering i endotelceller. Endre medium annenhver dag til dag 6.
4. Decellularized Aorta Graft Forberedelse
Merk: Alle løsninger og utstyr skal være sterile.
- Ofre mus ved halshugging og fikse musen i liggende posisjon under disseksjon mikroskop.
- Skjær gjennom brystbenet og rundt brystkassen for å åpne brysthulen. Fjern de hjerte, lunger og spiserør å eksponere aorta. Fjern forsiktig peri-aorta fett med pinsett.
- Skjær aorta fra fremre ende med saks og hold den enden med sløv tang. Løsne aorta fra ryggraden kolonne bak ved stump disseksjon. Lukke nøye alle forgreninger arterier fra aorta ved ligering med en bipolar electrocoagulator og sager fra enden av ligation med saks.
- Bruk en 5 ml sprøyte til å spyle aorta lumen med 3 ml saltløsning inneholdende 100 U heparin for å forhindre dannelse av blodpropper.
- Skjær den bakre enden av aorta før det grener inn i nyrene. Å holde integriteten av aorta er svært viktig under hele prosedyren.
- Spyl aorta lumen med 5 ml av 0,075% natrium-dodecyl-sulfat (SDS) -løsning fortynnet i fosfat-bufret saltvann (PBS).
- Suge thorakalaorta i 0,075% SDS-løsning i en 10 cm petriskål. Plasser petriskål på en orbital-rystemaskin i 2 timer ved 150 rpm ved RT.
- Spyl aorta lumen med 5 ml PBS.
- Suge aorta i PBS i en 10 cm petriskål. Plasser petriskål på orbitalrister i 2 timer ved 150 rpm ved RT. Oppdatere PBS hvert 20 min.
- Spyl aorta lumen med 5 ml PBS.
- Hold decellularized aorta pode i PBS ved 4 ° C i opptil en uke.
5. Dual Seeding av PiPSC og Bioreactor Conditioning
Merk: All løsnings og utstyr bør være sterile. Utføre alle operasjoner i en vev kultur hette.
- Montere bioreaktoren strømningskrets som vist på figur 1. Koble inkubasjon kammeret, media reservoaret, peristaltisk pumpe, og overholdelse kammer med slangen. Minimalt volum av medium som er nødvendig for sirkulasjonen er 40 ml.
- Forutsetningen den decellularized fartøy med dyrkingsmedium ved soaking aorta i DM medium i en 10 cm petriskål. Plasser petriskål på orbitalrister i 1 time ved 50 rpm ved RT.
- Sett 1 cm lengde Nylon rør (utvendig diameter 0,9 mm, ID 0,75 mm) inn i begge ender av decellularized beholder under mikroskop. Binde fartøyet og rørene med 8-0 silkesuturer.
- Monter decellularized aorta pode i inkubasjon kammeret ved å koble Nylon rør med innløps- og utløpsportene (1/32 "rør) fra kammerveggen. Opprettholde inkubasjon kammer med 5mls av medium hver gang.
- Trypsineres PiPSC ved å legge forvarmettrypsin å dekke dyrkningsskålen og rock forsiktig fatet 10 ganger. Kast trypsin og la fatet i inkubator for 2 - 3 min. Legg forvarmet kultur medium i fatet og bland mediet med cellene.
- Telle celle nummer ved hjelp av en hemocytometer. Sentrifuger to alikvoter av cellesuspensjoner inneholdende 5 x 10 5 celler hver i 5 min ved 300 x g. Aspirer supernatanten helt.
- Etter å aspirere supernatanten helt, suspendere en pellet av PIPS cellepelleter i 50 mL av DM. Injisere denne cellesuspensjon i decellularized årehulrommet.
- Deretter, resuspender den andre PIPSs cellepelleten i 100 ul av Matrigel. Pipettere forsiktig blandingen på den decellularized aorta pode.
- Vent i 10 - 15 minutter inntil blandingen blir til en gel-lignende tilstand og jevnt brytes rundt fartøyet ytre overflate. Fyll inkubasjon kammer med DM.
- Plassere hele bioreaktor innstilling i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C. Manuelt rotere decellularized pode 90 ° rundt lengdeaksen hver halvtime i første 2 timer.
- Hold statisk kultur i 12 timer for å aktivere celle adhesjon.
- Lever DM gjennom hulrommet av den peristaltiske pumpe for å indusere glattmuskelcelledifferensiering. Starte innledende strømningshastighet på 5 ml / min og trinnvis økning til 20 ml / min i løpet av 24 timer.
- Holde det sirkulerende medium strømningshastighet på 20 ml / min i 24 timer.
- Stopp medium flyt og flytte bioreaktor innstillingen ut av inkubatoren.
- Re-seed lumen av pode med PiPSC. Trypsineres, telle og sentrifuger 1 x 10 6 PiPSC som i trinn 5.5 til 5.6. Resuspender cellene i 50 pl av EGM-2-medium inneholdende 50 ng / ml VEGF. Injiser celleblanding i lumen av transplantatet.
- Endre mediet i inkubasjonen kammeret og hele sirkulasjonen til EGM-2-medium inneholdende 50 ng / ml VEGF for å indusere endotelisk differensiering.
- Flytt bioreaktor innstillingen tilbake til the kuvøse. Manuelt rotere pode 90 ° hver 30 min i første 2 timer og deretter holde en statisk kultur i 12 timer.
- Starte sirkulasjonsstrømning fra 5 ml / min og trinnvis økning til 35 ml / min. Holde strømningshastighet på 35 ml / min i 5 dager. Endre sirkulerende og kammer medium annenhver dag.
- Høste konstruert pode for ytterligere pode til mus.
6. Negl Double-seeded PiPSC Graft inn Mus
- Bruk NOD.CB17-Prkdc scid / NcrCrl hannmus som fartøy pode mottakere. Pass alltid på at musene er ca 10 uker gammel, veier ca 25 - 35 g, og er i gode helsemessige forhold.
- Bedøve mottaker mus ved administrering av en kombinasjon av Hypnorm (25 mg / kg) og Hypnovel (25 mg / kg) intraperitonealt. Påfør petrolatum oftalmisk salve på øynene for å hindre tørrhet mens under narkose. Bekreft effektiv anesthetization ved å sikre at mus har avslappede muskler og puster jevnt og trutt.
- Fikse musen i liggende stilling med halsen barbert og utvidet. Administrere atropinsulfat (1,7 mg / kg) i kombinasjon med de anestetika for å sikre at musen luftveier forblir klar.
- Forberede et midtlinjesnitt fra kjeven til sternum av musen. Under et disseksjonsmikroskop med 5- til 10-gangers amplifikasjon, løfter de riktige spyttkjertler lateralt og fjerne den riktige cleidomastoid muskel for å eksponere den høyre arteria carotis communis.
- Fjern forsiktig festet vev for å mobilisere høyre felles halsarterie fra den fjerne enden mot nærmeste ende. Ligere midtpartiet av den felles halsarterie to ganger med en 8-0 silkesutur og dissekere mellom de to bånd.
- Passere gjennom en mansjett laget av autoklaverbare nylon tube i hvert fartøy ende og fikse hver ende med microhemostat klemmer.
- Fjern sutur tie i den ene enden og bruke en dråpe heparin (100 U / ml). Umiddelbart etter, inverterer den distale enden av the arterie å dekke hele mansjetten kroppen og fikse den inverterte fartøyet med en 8-0 silke sutur til mansjetten.
- Gjenta fremgangsmåten til den andre delen av arterien. Flush arterie med saltvannsoppløsning for å fjerne blodpropper.
- Implantere en decellularized fartøy pode mellom to endene av halspulsåren ved å skyve decellularized fartøyet endene av de over arterien mansjetter og fikse det med 8-0 silkesuturer. Fjern vaskulære klemmer fra enten slutter før du evaluerer pulse av pode.
- Legg høyre spyttkjertel tilbake til sin opprinnelige posisjon. Lukke huden på kirurgisk plassering med en avbrutt sutur ved hjelp av en 6-0 polyglaktin sutur.
- Konsekvent observere vitale tegn til mus etter at prosedyren er fullført, før det fortsetter bevissthet. Ofre resipientmus ved halshugging og høste fartøyet grafts enten 24 timer eller tre uker senere for videre analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den vellykkede generasjonen av PiPSC ble bekreftet fire dager etter nucleofecting humane fibroblaster med ein lineær pCAG2LMKOSimO plasmidbærende fire transkripsjonsfaktorer, Oct4, SOX2, KLF4 og c-MYC (OSKM). PiPSC viste en markert forskjellig fenotype i forhold til fibroblaster (figur 2A) og uttrykte de fire reprogrammerings faktorer på mRNA (figur 2B) og protein (figur 2C) nivåer 10. Effekten av en PiPSC basert vaskulær transplantasjon er svært avhengig av evnen til å differensiere til PiPSC begge endotelceller og glatte muskelceller i rett linje. Det er derfor avgjørende å bekrefte disse egenskaper PiPSC in vitro ved å differensiere cellene i definerte medier før anvendelse av dem for å generere fartøyet grafts. Figur 3 viser kapasiteten til PiPSC å differensiere til funksjonelle endotelceller både genet (figur 3A) og protein ( Figur 3B-D) levels, basert på endotel-spesifikke markører 10. Tilsvarende PiPSC er også i stand til å differensiere i glatt muskulatur avstamning som svar på spesifikke media (Figur 3E-H) 11.
Hele aorta decellularization ble oppnådd ved behandling med SDS, et anionisk vaskemiddel som lyserer cellene og oppløseliggjør cytoplasmatiske komponenter. Etter to timers behandling, dukket decellularized aorta som et gjennomskinnelig acellulær stillas i forhold til en nyhøstet aorta (Figur 4A-B) 22. Histologisk evaluering i figur 4C-F illustrerer fraværet av kjerner eller cytoplasmisk farging i decellularized fartøy, men ikke i den normale mus aorta. Etter dobbel seeding av PiPSC-avledet endothelial og glatte muskelceller i decellularized aortaer, de konstruerte vaskulære implantater vise endotelceller og glatte muskel celle egenskaper hhv. Hematoksylin og eosin (HE) farging av dobbel-seeded grafts avslørte en arkitektur som ligner på den native fartøy (figur 4G) med flere lag av glatte muskelceller og et monolag av endotelceller som bekreftet av positiv farging for glattmuskel-22α (SM22), glatt muskel-α aktin (SMA) henholdsvis (figur 4H-M) 11 CD31 og CD144 markører.
For å bekrefte at åpenheten av vevet konstruerte fartøyer in vivo, ble de doble seeded PiPSC-avledet fartøy podet i mus - både normale mus og decellularized arterier ble anvendt som kontroller. Påfølgende analyse viste at mens mus podet med decellularized fartøy presentert med markert høyere dødelighet så tidlig som dag 1, PiPSC fartøyet grafts konferert en overlevelse på 60% 3 uker etter transplantasjon (Figur 5A) 11. I tillegg ble tre uker gamle PiPSC-avledet grafts fullstendig karakterisert med hensyn til nærvær av humant PiPSC-avledet endotel og glatte muskelceller og vertsmakrofaginfiltrering (figur 5B og tabell 1) 11. Tatt sammen tyder resultatene på at PiPSC har kapasitet til å differensiere i begge vaskulære linjene, og er potente for å generere funksjonelle vevs-konstruert fartøy som kan erstatte opprinnelige skip in vivo.
Figur 1. Skjematisk representasjon av decellularized pode bioreaktor strømningskrets. Den decellularized fartøyet pode er montert i kammeret inkubasjon. En peristaltisk pumpe er på oppstrømsiden av inkubering kammeret for å tilveiebringe stabilt medium perfusjon strømmen. Mediene reservoaret er på nedstrømsiden av inkubering kammeret. Den samsvar kammeret er å forbedre strømningsregime. Strømningsretningen er angitt med piler.large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. generasjon av PiPSC fra humane fibroblaster. Menneskelige fibroblaster ble nucleofected med enten fire omprogrammering gener (OCT4, SOX2, KLF4 og C-MYC) eller en tom vektor (kontroll). (A) Fase bildene kontrast viser morfologi av PIPS etter 4 dager. PiPSC uttrykte alle fire transkripsjonsfaktorer, både på mRNA (B) og protein (C) nivåer. Målestokk for bilder som vises er 50 mikrometer og data er midler ± SEM (n = 3); * P <0,05, *** P <0,001. Dette tallet har blitt forandret fra Margariti, A. et al. 10 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. </ A>
Figur 3. PiPSC kan differensiere til begge endotelceller og glatte muskelceller. PiPSC eller kontrollceller ble differensiert i endotelceller. (A) I forhold til kontrollcellene, PiPSC avledet endotelceller uttrykt endotel-spesifikke markører så som CD31, CD144, kinase innsats domene-reseptor (KDR), endotelial nitrogenoksydsyntase (eNOS), og von Willebrand faktor (vWF) på mRNA nivå. (B) Dette ble bekreftet på proteinnivå ved hjelp av western blot analyse. (C) Immunfluorescens farging indikerte positive farging av CD144 (VE-cadherin) i PiPSC-endotel, men ikke kontroll-celler. (D) Flowcytometrisk analyse bekreftet PiPSC-endotelceller uttrykk for CD31 og CD144. Kollagen IV-seeded PiPSC (eller kontrollceller) ble også differensiert iglatte muskelceller. (E, F) I motsetning til å kontrollere celler, PiPSC-avledet glatte muskelceller uttrykte glatte muskelceller spesifikke markører på gennivå, inkludert SMA, calponin, SM22, glatt muskulatur myosin tung kjede II (SMMHC), serum responsfaktor (SRF) , myocardin, smoothelin, elastin og kollagen 1A1. (G) uttrykket nivåer av SMA, calponin og SM22 i PiPSC-avledede celler ble bekreftet ved hjelp av western blot-analyse. (H) Immunfluorescens flekker ved hjelp konfokalmikroskopi viste en typisk glatt muskulatur markør farging for calponin og SM22. Data representerer middelverdier ± SEM (n = 3); * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001. Målestokk for bilder som vises er 25 mikrometer eller 50 mikrometer. Disse tallene har blitt forandret fra Margariti, A. et al. 10 og Karamariti, E. et al. 11 Værklikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Dannelse av dobbelt-seeded PiPSC-avledet vev konstruert vaskulære implantater. (A, B) Decellularization av mus torakal aorta bevarte sin struktur og fortsatt lignet som et vanlig fartøy, opprinnelig forstørrelse 2X. (CF) HE-farging av decellularized aorta bekreftet vellykket decellularization og fullstendig fjerning av celler sammenlignet med kontroller, opprinnelig forstørrelse: 50X og 200X. (G) HE farging av PiPSC-avledet endothelial og glatte muskelceller dobbel-seeded fartøy avslørte en arkitektur som var lik en innfødt fartøy. (J, M) Dobbel-seeded PiPSC vev konstruert fartøy farget positivt for endothelial (CD31 og CD144) og glatte muskelceller (SM22 og SMA) markører motsetning decellularized fartøy grafts. (H, K) Samtidig ekspresjon av vaskulære markører, så vel som den karakteristiske morfologi og lokalisering av PiPSC-avledet endoteliale og glatte muskelceller i intima og mediale områder var sammenlignbare med opprinnelige skip. Målestokk for bilder som vises er 50 mikrometer. Disse tallene har blitt forandret fra Tsai, T. et al. 22 og Karamariti, E. et al. 11 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Dobbelt seeded PiPSC-avledet vev konstruert vaskulære implantater er patent for å erstatte innfødte fartøyer in vivo. PiPSC-avledet fartøyene ble podet inn i halspulsåren av alvorlig kombinert immunsvikt (SCID) mus, normal mouSE og decellularized arterier ble anvendt som kontroller. (A) Analyse av mus podet med PiPSC-avledet fartøy viste 60% overlevelse tre uker etter operasjonen, mens mus podet med decellularized fartøy presentert med markert høyere dødelighet og lavere overlevelse (20%). Data representerer middel (n = 10). (B) Vevet konstruerte skip ble også høstet tre uker etter pode og utsatt for HE (venstre panel) eller immunfluorescens farging (høyre panel) for tilstedeværelse av menneskelig CD144 og calponin eller mus CD11b / CD18 (Mac-en); kvantifisering av farging er oppsummert i tabell 1. Original forstørrelse for bilder som vises er 400X med mindre oppgitt. Dette tallet har blitt forandret fra Karamariti, E. et al. 11 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Positive celler Field (40X) | Konstruert-fartøy før pode | Konstruert-fartøy pode (3 uker) |
| calponin | 72 ± 9 | 22 ± 11 * |
| CD144 | 20 ± 8 | 5 ± 6 * |
| Mac-en | 0 | 71 ± 11 * |
Tabell 1. Karakterisering av vevs-konstruert fartøy 3 uker etter poding. Antallet PiPSC avledet endotelceller og glatte muskelceller og vertsmakrofager ble kvantifisert etter immunfluorescens farging med human calponin, human og mus CD144 Mac-1 hhv. Data representerer gjennomsnitt ± SEM (n = 6); * P <0,05, signifikant forskjell fra vev konstruerte skip før poding. Denne tabellen har blitt forandret fra Karamariti, E. et al. 11
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nåværende protokollen indikerer en lyd, rask, enkel, effektiv og reproduserbar strategi der funksjonelle vev konstruert fartøy kan genereres ved hjelp PiPSC fra humane fibroblaster. Denne teknikken representerer et verdifullt verktøy for regenerativ medisin, tissue engineering og potensielt pasientspesifikk celleterapi i nær fremtid. Kritiske skritt for å sikre effekten av protokollen omfatter utarbeidelse av PiPSC, fremstilling av sterile og fullt decellularized aorta grafts, vellykket seeding og differensiering av PiPSC i stillasene og opprettholde sterilitet av aorta grafts i vaskulær bioreaktor.
For å starte vellykket generasjon av vev-konstruert grafts, er det av største betydning for å sikre at utarbeidelse av PiPSC utføres effektivt. Protokollen har lykkes "omprogrammert" en menneskelig fibroblastcellelinje inn PiPSC via nucleofection med en pCAG2LMKOSimO OSKM plasmid. Den survival av fibroblaster etter nucleofection er avhengig av flere viktige punkter som for eksempel bruk av høykvalitets OSKM plasmider, plasmider av konsentrasjoner som varierer mellom 500 - 1000 ng / mL, unngå forsinkelser i såing av fibroblaster umiddelbart etter nucleofection som celler er spesielt følsomme etter innføring av relativt store plasmider og til slutt vil oppføring av FGF-2, som er avgjørende og bør legges inn nylagde media like før bruk. I tillegg har vi funnet at det var viktig å benytte celler av opp til passasjen 9 for å unngå replikative senescens, for å sikre effektiv 'omprogrammering' inn PiPSC og påfølgende differensiering til endotelceller og glatte muskelceller. Renheten av PiPSC kan forbedres ved valg av nucleofected celler med neomycin. Den pCAG2LMKOSimO plasmidet har et neomycin-resistent gen, og således tilsetning av neomycin i et område på 25 pg / ml av en dag etter at nucleofection i 3 dager vil resultere i utvelgelse av en ren populasjon avPiPSC. Å konstruere en effektiv PiPSC fartøy for pode i mus, vurderte vi integriteten og sterilitet av decellularized aortaer å være av høyeste prioritet. For å opprettholde integriteten av Aorta før og etter decellularization, var det nødvendig å stadig bruke fingerferdighet mens håndtering av fartøy, som de var relativt skjøre og betydelig diminutiv i størrelse. Den effektive fjerning av perivaskulær vev og tetting av forgrenings arterier ved hjelp av en bipolar elektro coagulator var kritisk for å sikre etterfølgende kompetent celle såing og for å unngå lekkasje av medier. På ethvert punkt, vi sikret at alle materialer og apparatet som anvendes for å generere bioreaktoren (dvs. tenger, rør, flasker, kamre, saks, adaptere og kontakter) var autoklaveres, og dermed redusere risikoen for bakterieforurensning, og svikt i vaskulære transplantater før kirurgi .
Mens den nåværende protokollen holder lovende kliniske applikasjoner i hjerte disepasientrapportert, er det noen begrensninger som bør forbedres i nær fremtid for å ytterligere forbedre metodikken. Så langt, ble OSKM transkripsjonsfaktorer introdusert i humane fibroblaster via nucleofection. Selv om denne teknikken er relativt enkel og grei, det resulterte også i variable transfeksjonseffektiviteter ved forskjellige eksperimentelle ganger. Spesielt, kan denne uoverensstemmelse kan overvinnes ved å innføre et ytterligere trinn av den ovenfor nevnte neomycin. På samme måte kan man ta hensyn til innføring av de fire faktorer i humane fibroblaster ved hjelp av lentivirus integrasjon, som potensielt kan øke effektiviteten av 'omprogrammering' og forbedrer overlevelse av celler etter infeksjon. I form av bioreaktor, fant vi at fullstendig decellularization av Aorta kan oppnås ved hjelp 0,075% SDS. Selv om denne teknikk ble ansett for å være optimal for cellefjerning sammenlignet med andre vaskemidler (f.eks Triton-X-100), det kan imidlertid forårsake potential endringer innenfor de ultra-strukturer av ekstracellulære matrix proteiner 23. Dette fenomenet garanterer derfor mer effektive decellularization strategier for å minimere avbrudd av de tilknyttede ekstracellulære matrix proteiner. I tillegg har vi også vurdert at diameteren og veggtykkelse decellularized aortaer variere mellom mus, avhengig av deres alder, belastning og bakgrunn, og dermed føre til potensielle forskjeller i hastigheten på flyt og skjær stress i bioreaktorer og fordelingen av PiPSC følgende PiPSC seeding . Alt dette er fortsatt ikke avklart.
Denne protokollen her er beskrevet generering av funksjonelle vev konstruert grafts hjelp PiPSC som holder et lovende potensial for fremtidige kliniske applikasjoner i stamcelleterapi for kardiovaskulær sykdom. Denne fremgangsmåte som utnytter den direkte reprogrammering fra en somatisk avstamning (fibroblaster) til et annet (enten endotelceller og glatte muskelceller) ved å hoppe over pluripotency kan være en måte for å oppnå sikker og egnede celler av interesse. Faktisk har flere protokoller blitt publisert for å beskrive den generasjonen av stamcellelinjer fra menneskelige embryoer, iPS-celler og voksne stamceller 24-26, som alle er imidlertid fortsatt øke om problemer med hensyn til deres bruk i klinikken. Det er nå kjent at PiPSC ikke utvikler teratomas i SCID-mus, og dermed eliminere bekymring for tumordannelse. Videre er cellene tar en vesentlig kortere tid for å generere, kultur og differensiere 10,11, og har vist seg å generere vellykkede og funksjonelle vev konstruert fartøy grafts som er sammenlignbare med opprinnelige aortaer. Derfor PiPSC stede som en lovende celle kilde for behandling av pasienter som bruker personlig celleterapi fordi fibroblaster (f.eks fra huden) kan utledes fra en bestemt person. Den decellularised fartøy system i denne protokollen gir en mer biomimetisk modell som gir seeded celler med en extracellular matrise protein som er mer representativt for det av en innfødt aorta 11. Disse viktige punktene er avgjørende for å sikre overlevelsen, differensiering og funksjonaliteten til de seeded celler og vev konstruert fartøy etterpå. Fersk undersøkelse utført av Sumitran-Holgersson og kolleger viste en vellykket repopulation av en tidligere decellularized illiac blodåre graft fra en avdød person før engraftment 27, og dermed postulerte en overføringsverdi av dagens protokoll til mennesker i nær fremtid. Videre kan decellularized fartøyet grafts representere en god modell der rolle og opptreden av andre vaskulære celletyper som også bidrar til vev-konstruert grafts kan vurderes. Dette modellsystem i mus kunne gi et kraftig verktøy for fremtidig medikamentscreening og også å belyse de cellulære og molekylære mekanismer som er involvert i vaskulære stamcellebiologi. Tatt sammen, holder den gjeldende protokollen lovende verdi for sin søknad i VASCular tissue engineering og et gjennombrudd i personlig medisin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen motstridende økonomiske interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Fibroblasts CCL-153 | ATCC | CCL-153 | Prenatal human embryonic fibroblasts |
| ATCC F-12K Medium (Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium) | ATCC | 30-2004 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells | Life technologies (Gibco) | 12660-012 | |
| Knockout Serum Replacement | Life technologies (Invitrogen) | 10828-028 | |
| Human Basic FGF-2 | Miltenyi Biotech | 130-093-837 | |
| alpha-MEM medium | Life technologies (Invitrogen) | 32571093 | |
| Human PDGF | R&D System | 120-HD-001 | |
| Gelatin Solution 2% | Sigma | G1393 | |
| Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC) | Addgene | 20866 | |
| PvuI Restriction Enzyme | New England Biolabs | RO150S | |
| SureClean Plus | Bioline | BIO-37047 | |
| Nucelofection Kit (NHDF Kit) | LONZA | VPD-1001 | |
| Neomycin | SIGMA | G418 | |
| KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy | SCHOTT | KL 1500 LCD | Cold light illumination for stereo microscopy |
| Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800 | Nikon | SMZ800 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| 10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent | Severn Biotech | CAS 151-21-3 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Matrigel (10mg/ml) | BD | A6661 | |
| Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7 | Jepson Bolton's, Janke&Kunkel | S32-102 | |
| Masterflex L/S Digital Pump Drive | Cole-Parmer | WZ-07523-80 | |
| Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head | Cole-Parmer | EW-07519-15 | |
| Masterflex L/S large cartridges for pump head | Cole-Parmer | EW-07519-75 | |
| Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft | Cole-Parmer | WZ-96410-14 | Tubing goes through the peristaltic pump |
| 0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing | SILEX | N/A | Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber |
| Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline | Ibidi | 10829 | Adapter connect above two types of tubings |
| 1/32" Tubing, ID 0.01" (250µm) Material: PEEK | LabSmith | T-132-010P | Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing |
| One-Piece Fittings | LabSmith | T-132-100 | Fix the above tubings through the incubation chamber wall |
| Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm) | Smiths Medical | N/A | Tubings insert into two ends of the aorta graft |
| NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mouse | Charles River | ||
| Surgical sutures, 8-0 silk | ETHICON | W819 | |
| Hypnorm | Vetapharm | Vm21757/4000 | Neuroleptanalgesic for use in mice |
| Hypnovel (Midazolam) | Roche | 59467-70-8 | Induction of anaesthesia |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Nylon Tubing | Portex LTD | 800/200/100/200 | 0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff |
| Electrocoagulator | Martin | SN 54.131 | Ligation of artery branches on aorta |
| Bipolar micro hemostat forceps | Martin | 80-91-12-04 | Fixation of vessel ends |
| Vessel Dilator | S&T | JFX-7 | |
| Vessel Dilator | S&T | JFL-3dZ | |
| Vessel Dilator | S&T | D-5aZ | |
| Mini applier | AESCULAP | FE572K | |
| Micro hemostats clips | AESCULAP | FE720K | |
| Surgical sutures, 6-0 VICRYL | ETHICON | V489 |
References
- Kurobe, H., Maxfield, M. W., Breuer, C. K., Shinoka, T. Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future. Stem Cells Transl Med. 1 (7), 566-571 (2012).
- Jonas, R. A., Freed, M. D., Mayer, J. E. Jr Long-term follow-up of patients with synthetic right heart conduits. Circulation. 72, II77-II83 (1985).
- Heureux, N., et al. Technology insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts-from research to clinical practice. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, 389-395 (2007).
- Zhang, W. J., Liu, W., Cui, L., Cao, Y. Tissue engineering of blood vessel. J Cell Mol Med. 11, 945-957 (2007).
- Cearbhaill, E. D., et al. Response of mesenchymal stem cells to the biomechanical environment of the endothelium on a flexible tubular silicone substrate. Biomaterials. 29, 1610-1619 (2008).
- Gong, Z., Niklason, L. E. Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs). FASEB J. 22, 1635-1648 (2008).
- Wong, M. M., et al. Over-expression of HSP47 augments mouse embryonic stem cell smooth muscle differentiation and chemotaxis. PLoS One. 9 (1), e86118 (2014).
- Park, S. W., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells into functional CD34+ progenitor cells by combined modulation of the MEK/ERK and BMP4 signaling pathways. Blood. 116, 5762-5772 (2010).
- Samuel, R., et al. Generation of functionally competent and durable engineered blood vessels from human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 12774-12779 (2013).
- Margariti, A., et al. Reprogramming of fibroblasts into endothelial cells capacble of angiogenesis and reendothelialization in tissue-engineered vessels. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 13793-13798 (2012).
- Karamariti, E., et al. Smooth muscle cells differentiated from reprogrammed embryonic lung fibroblasts through DKK3 signaling are potent for tissue engineering of vascular grafts. Circ Res. 112, 1433-1443 (2013).
- Udelsman, B., et al. Development of an operator-independent method for seeding tissue-engineered vascular grafts. Tissue Eng Part C Methods. 17 (7), 731-736 (2011).
- Cearbhaill, E. D., Murphy, M., Barry, F., McHugh, P. E., Barron, V. Behavior of human mesenchymal stem cells in fibrin-based vascular tissue engineering constructs. Ann Biomed Eng. 38 (3), 649-657 (2010).
- Wong, M. M., et al. Macrophages control vascular stem/progenitor cell plasticity through tumor necrosis factor-α-mediated nuclear factor-κB activation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (3), 635-643 (2014).
- Wong, M. M., et al. Sirolimus stimulates vascular stem/progenitor cell migration and differentiation into smooth muscle cells via epidermal growth factor receptor/extracellular signal-regulated kinase/β-catenin signaling pathway. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (10), 2397-2406 (2013).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: State of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14, 61-86 (2008).
- Hung, H. S., Hsu, S. H. Current Advances of stem cell-based approaches to tissue-engineering vascular grafts. OA Tissue Engineering. 1 (1), 2 (2013).
- Quint, C., et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (22), 9214-9219 (2011).
- Zhang, X., Xu, Y., Thomas, V., Bellis, S. L., Vohra, Y. K. Engineering an antiplatelet adhesion layer on an electrospun scaffold using porcine endothelial progenitor cells. J Biomed Mater Res A. 97 (2), 145-151 (2011).
- Hibino, N., et al. Evaluation of the use of an induced puripotent stem cell sheet for the construction of tissue-engineered vascular grafts. J Thorac Cardiovasc Surg. 143 (3), 696-703 (2012).
- Zhao, J., et al. A novel strategy to engineer small-diameter vascular grafts from marrow-derived mesenchymal stem cells. Artif Organs. 36 (1), 93-101 (2012).
- Tsai, T., et al. Contribution of stem cells to neointimal formation of decellularized vessel grafts in a novel mouse model. Am J Pathol. 181 (1), 362-373 (2012).
- Kasimir, M. T., et al. Comparison of different decellularization procedures of porcine heart valves. Int J Artif Organs. 26 (5), 421-427 (2003).
- Stephenson, E., et al. Derivation and propagation of human embryonic stem cell lines from frozen embryos in an animal product-free environment. Nature Protocols. 7, 1366-1381 (2012).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).
- McCall, F. C., et al. Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine. Nature Protocols. 7, 1479-1496 (2012).
- Olausson, M., et al. Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study. Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).
