Introduction
Des études récentes ont démontré que le chauffage transitoire associée à l'absorption de la lumière infrarouge par l'eau (longueur d'onde> 1400 nm) peut être utilisée pour induire des potentiels d'action dans le tissu nerveux et une transitoires calciques intracellulaires dans les cardiomyocytes 2. L'utilisation de la lumière infrarouge a soulevé un grand intérêt pour des applications dans les prothèses neurales, en raison de la résolution spatiale plus fine potentiel, l'absence de contact direct avec le tissu, la minimisation des artefacts de stimulation, et l'élimination de la nécessité de modifier génétiquement les cellules avant la stimulation ( le cas échéant en optogénétique) 1. Malgré tous ces avantages, les modèles thermiques récemment développés ont suggéré que les tissus / cellules cibles peuvent être affectés par les effets cumulatifs de chauffage, lorsque plusieurs sites de stimulation et / ou des taux de redoublement élevés sont utilisés 3,4.
En réponse à ces défis, les chercheurs ont reconnu le potentiel d'utiliser Absor extrinsèquebres pour la stimulation du nerf à produire des effets de chauffage plus localisées dans le tissu. Huang et al. A démontré ce principe en utilisant des nanoparticules de ferrite superparamagnétiques à activer à distance des canaux de TRPV1 sensibles à la température dans les cellules HEK 293 avec une haute fréquence de champ magnétique 5. Bien que cette technique peut permettre une pénétration plus profonde (champs magnétiques interagissent avec les tissus relativement faiblement), les réponses ont été enregistrées seulement sur des périodes de secondes, plutôt que les durées de millisecondes nécessaires dans les dispositifs bioniques 5. De même, Farah et al. Stimulation électrique démontré des neurones corticaux de rat avec des micro-particules noires in vitro. Ils ont montré une précision de niveau de cellule dans la stimulation en utilisant des durées d'impulsion de l'ordre de centaines de ps et des énergies de l'ordre de pJ, permettant potentiellement à des taux de redoublement plus rapides 6.
L'utilisation d'absorbeurs extrinsèques a également été appliquée pour induirechangements morphologiques in vitro. Ciofani et al. Ont montré une augmentation de ~ 40% de l'excroissance de cellules neuronales en utilisant piézoélectriques nanotubes de nitrure de bore excité par ultrasons 7. De même, les nanoparticules d'oxyde de fer endocytose dans les cellules PC12 ont été rapportés pour améliorer la différenciation des neurites d'une manière dépendante de la dose, du fait de l'activation des molécules d'adhésion cellulaire avec l'oxyde de fer 8.
Récemment, l'intérêt des absorbeurs extrinsèques pour aider la stimulation neuronale a également porté sur l'utilisation de nanoparticules d'or (Au IP). Au IP ont la capacité d'absorber efficacement la lumière laser au sommet plasmonique et de dissiper dans l'environnement sous forme de chaleur 9. Parmi toutes les formes de particules disponibles, l'absorption optique des nanotubes d'or (Au NR) correspond idéalement la fenêtre thérapeutique de tissus biologiques (proche infrarouge - NIR, longueur d'onde entre 750-1,400 nm) 10. En outre, dans la suiteposte de stimulation neurale, l'utilisation de Au NR fournit biocompatibilité relativement favorable et un large éventail d'options de fonctionnalisation de surface 11. Des études récentes ont montré que un effet stimulant sur la différenciation peut être induite après des expositions de laser continus de Au NR dans NG108-15 cellules neuronales 12. De même, les transitoires de calcium intracellulaire ont été enregistrées dans les cellules neuronales cultivées avec Au NR après l'irradiation laser modulé avec des fréquences variables et impulsions longueurs 13. dépolarisation de la membrane cellulaire a également été enregistrée après NIR éclairage laser de Au NRs dans des cultures primaires de neurones du ganglion spiral 14. Le premier dans la demande de vivo avec irradié Au NR a été démontrée récemment. Eom et ses collaborateurs exposés Au NR à leur apogée plasmonique et enregistré une multiplication par six de l'amplitude des potentiels d'action composé de nerf (CNAPS) et une diminution triple du seuil de stimulation chez le rat nerfs sciatiques. La sallediée réponse a été attribuée aux effets de chauffage locaux résultant de l'excitation du pic plasmonique NR 15.
Dans le présent document, protocoles pour enquêter sur les effets de la stimulation laser dans NG108-15 cellules neuronales cultivées avec l'UA NR sont spécifiés. Ces méthodes fournissent un simple, mais puissant, moyen pour irradier populations de cellules in vitro en utilisant des techniques et des matériaux biologiques standard. Le protocole est basé sur une diode laser à fibre couplé (LD) qui permet le fonctionnement en toute sécurité et d'alignement répétable. La préparation de l'échantillon et des méthodes d'irradiation laser Au NR peuvent être étendues à des formes de particules différentes et des cultures de cellules neuronales, pour autant que les protocoles de synthèse et de culture spécifiques sont connues, respectivement.
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Protocol
1. Au NR Préparation
Remarque: Au NR peut être synthétisé par un 16 certain nombre de recettes, ou achetés auprès de fournisseurs commerciaux.
- Mesurer la densité optique initiale (DO) de la solution Au NR par spectroscopie UV-Vis, en enregistrant les valeurs d'absorption de 300 nm à 1000 nm avec une résolution de 0,5 à 2 nm. Faire varier le volume de la solution à utiliser avec la cuvette disponible.
- Évaluer la concentration initiale NP molaire avec une technique appropriée 17 (spectroscopie UV-Vis par exemple, seule particule spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif, la microscopie électronique à transmission) ou utiliser les valeurs de concentration fournies par le vendeur.
- Préparer une solution stock de 5 ml en diluant l'échantillon initial Au NR pour atteindre une DO = 1. Pour la meilleure répétabilité, maintenir constante la DO pour tous les échantillons testés. Suivre le protocole du fournisseur commercial de la composition du solvant de dilution. En cas de doute, Utiliser de l'eau déminéralisée.
- Centrifugeuse de 1 ml de la solution Au NR deux fois pendant 15 min à 7800 x g pour éliminer tout excès de produit chimique à partir de la solution. cycles de centrifugation peuvent varier en vigueur et le temps (par exemple 20 min à 5600 × g) 18.
- Retirez les surnageants et remettre en suspension les NR dans l'eau déminéralisée. Comme particules remises en suspension peuvent former des agrégats en solution, préparer tous les jours pour avoir les meilleurs résultats. Alternativement, stocker dans un réfrigérateur pendant plus de 1 semaine. Ne pas congeler.
- Avant d'utiliser dans des conditions de culture cellulaire, la sonication Au NR solution pendant 5 minutes et ensuite stériliser avec de la lumière UV pendant 30 min (intensité de rayonnement UV d'au moins 400 mW m -2 ∙ à 254 nm).
Ligne 2. NG108-15 cellules neuronales Culture et de la différenciation
- Pour le milieu de culture cellulaire, de préparer 500 ml d'Eagle modifié de milieu stérile de Dulbecco (DMEM) contenant 10% (p / v) de sérum de veau foetal (SVF), 1% (p / v) L-glutamine, 1%(P / v) de pénicilline / streptomycine et 0,5% (p / v) de l'amphotéricine B.
Note: Les suppléments peuvent être aliquotés, stocké à -20 ° C et ajoutés aux médias le jour nécessaire. milieu de culture cellulaire peut être réfrigéré à l'état stérile pendant un maximum de 1 mois. - Pour le milieu de différenciation cellulaire, de préparer 50 ml de DMEM stérile contenant 1% (p / v) L-glutamine, 1% (p / v) de pénicilline / streptomycine et 0,5% (p / v) de l'amphotéricine B.
- NG108-15 croître des cellules neuronales dans 10 ml de milieu de culture de cellules dans des flacons T75 en polystyrène dans un incubateur à atmosphère humidifiée (5% de CO2 à 37 ° C). Normalement, ensemencer 1,5 à 2 × 10 5 cellules dans chaque flacon pour être prêt en 3-4 jours. Changer le milieu de culture de cellules tous les deux jours.
Remarque: Pour éviter les dérives génétiques ou variation, ne pas utiliser des cellules de plus de passage 21 pour les expériences. - Lorsque 70-80% de confluence dans la culture, changer le milieu avec un milieu frais chaude de culture cellulaire. Mécaniquement détacher les cellules par délicatement KNOCroi du fond du ballon de confluence. Ne pas utiliser la trypsine.
- Centrifuger la suspension de cellules pendant 5 min à 600 x g et remettre en suspension le culot de cellules dans 2 ml de milieu de différenciation de la cellule chaude.
- Graine 2 × 10 4 cellules / cm 2 dans une plaque de puits de culture tissulaire en polystyrène avec 96 200 ul de milieu de différenciation cellulaire. Incuber l'expérience pendant 1 jour à 5% de CO 2/37 ° C.
- Ajouter entre 3,2 × 10 9 -4,2 × 1 0 10 particules / ml de solution Au NR sur deux jours et incuber pendant 24 heures supplémentaires. Ne pas ajouter les particules pour les expériences témoins.
Remarque: Comme un contrôle alternatif, Au IP avec une longueur d'onde de pic d'absorption bien différencié peut être utilisé à des fins de comparaison 14. Pour un comportement cellulaire plus cohérente, maintenir la densité cellulaire constante et ne pas modifier la surface du puits avant l'ensemencement des cellules.
3. Croissance Des Neurites Enhancement
- Couplele laser avec une fibre optique à mode unique (ouverture numérique = 0,13) et se terminent par un connecteur de fibres (FC connecteurs sont pratiques et couramment disponibles). Mesurer la puissance de sortie du laser avec un mesureur de puissance standard. Pour obtenir les résultats les plus efficaces, correspondre à la longueur d'onde maximale du laser au pic de résonance de plasmon des ORA.
- Au jour d'incubation de 3 NR suivante, fixer le connecteur FC au puits. Irradier les échantillons et les contrôles à température ambiante pendant 1 min dans onde continue, pour différentes puissances laser. Laisser la culture se dérouler pendant 3 jours supplémentaires à 5% de CO 2/37 ° C. Répéter le rayonnement laser pendant un minimum de 3 mesures indépendantes.
Remarque: Les différents temps d'irradiation et les fréquences d'impulsions peuvent être sélectionnés en fonction de l'application. - Caractériser le laser en termes de diamètre du faisceau laser, et l'ensoleillement (W ∙ cm -2).
- Pour une fibre monomode standard, utilisez NA = n ∙ péché θ,où n est l'indice de réfraction du milieu en cours d'utilisation et θ est le demi-angle du cône de lumière sortant de la fibre (voir figure 1A). De trigonométrie, r = tan θ ∙ d, où r est le rayon du faisceau et d est la distance entre la fibre et l'échantillon. Le connecteur FC correspond au diamètre du puits, donc à éclairer l'échantillon à une distance d = 2,70 ± 0,20 mm. Lumière quitte la fibre dans l'eau (n = 1,33), ce qui donne r = tan (sin-1 (NA / n)) ∙ d.
- En utilisant cette dernière équation, calculer le rayon du faisceau laser, la zone de faisceau correspondant et le rayonnement laser moyenne (puissance de laser divisée par la superficie du faisceau) à la cible (voir l'exemple graphique de la figure 1B). Ces valeurs représentent l'éclairement moyen sur la zone éclairée.
- Évaluer les erreurs pour les mesures avec la théorie générale de propagation d'erreur.
Remarque: La distance bntre le connecteur de FC et l'échantillon peuvent être mesurées par des photographies du dispositif expérimental et post-traitement de l'image en utilisant un logiciel approprié (par exemple ImageJ).
- Au jour 5, éliminer le milieu de différenciation des cellules d'après les expériences et fixer les échantillons avec 3,7% (v / v) d'une solution de formaldehyde pendant 10 minutes, puis perméabiliser les cellules avec 0,1% (v / v) de Triton X-100 pendant 20 min.
- Ajouter 3% (p / v) de sérum-albumine bovine (BSA) pour les échantillons pendant 60 minutes pour bloquer les sites de liaison de la protéine ne ayant pas réagi. Étiqueter les échantillons pendant une nuit anti-BIII-tubuline (5 ug / ml dans du PBS supplémenté avec 1% de BSA) à 4 ° C.
- Incuber les cellules pendant 90 min à l'obscurité avec un anticorps secondaire approprié (anticorps anti-souris IgG conjugué TRITC par exemple) en utilisant une concentration de 0,4 à 2 ug / ml dans du BSA à 1% dans du PBS. Étiqueter les noyaux des cellules avec du DAPI (0,1 ug / ml dans de l'eau désionisée) pendant 10 minutes.
Remarque: la conjugaison d'anticorps et la concentration might varient selon le protocole de l'entreprise. Échantillons lavage avec du PBS deux fois pendant 5 min après chaque étape de coloration.
- des échantillons de l'image en épifluorescence ou microscopie confocale en utilisant au moins 20 × objectif. Choisissez le microscope filtre conséquence à l'anticorps secondaire. Sélectionnez un filtre DAPI (λ = 358 nm EX; λ EM = 488 nm) pour visualiser les noyaux cellulaires.
- Analyser les photos en évaluant: i) la longueur des neurites maximale (record de la longueur de la pointe de la neurites au début du corps de la cellule), ii) le nombre de neurites par cellule neuronale (résumer tous les neurites par cellule) et iii) le pourcentage de cellules avec des neurites (diviser le nombre total de cellules exprimant la ßlll-tubuline par le nombre total de cellules avec un noyau coloré positivement) 19.
4. induite par laser de l'imagerie de Ca intracellulaire
Remarque: solution BSS peut être préparé à l'avance et réfrigérée pour un maximum de 1 mois. Ajouter les suppléments (Fluo-quatre heures et Pluronic F-127) sur le jour de l'expérience.
- Mesurer la puissance de sortie du laser avec un mesureur de puissance standard. Insérez la fibre de livraison lumière en un support de fibre optique et l'apposer sur une micropositionneur. Reportez-vous à Brown et al. 20 pour plus de détails sur la préparation de fibre optique et de positionnement.
Attention: Suivez les règles générales relatives à la sécurité laser pendant la mesure de la puissance du laser (par exemple, ne regardez pas directement dans le faisceau laser, porter des lunettes de sécurité laser lors de la manipulation, de prévenir l'exposition de la lumière parasite à d'autres utilisateurs de laboratoire) <./ Li>
- Placer les cellules sous un microscope confocal inversé et la position de la fibre de distribution de lumière 250 ± 50 um loin de la cellule cible dans le mode d'illumination de transmission. A cette distance, utiliser les équations présentées en 3.3.1 pour calculer le rayon du faisceau sur la cible.
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Representative Results
En utilisant les protocoles 1, 2, et 3 décrites ici, un effet stimulant sur la différenciation a été observée dans les cellules neuronales cultivées NG108-15 avec l'UA IP (Au NR, poly (styrène sulfonate) doté d'un revêtement Au NR et revêtu de silice Au NR) après laser expositions entre 1,25 et 7,5 W · cm -2. Les images confocales de rhodamineB marqué Au NR ont montré que les particules ont été internalisés du jour 1 d'incubation 12. La localisation a été observée principalement dans le cytoplasme des cellules, ce qui indique que le mécanisme d'absorption préféré est via la membrane de corps 12 de la cellule. Les principaux changements morphologiques détectés après l'induction de la différenciation en cellules neuronales étaient NG108-15 l'arrêt de la prolifération, l'expression de la protéine ßlll-tubuline et l'excroissance de neurites, qui ont été analysés en termes de longueur maximale et le nombre 22.
Les échantillons cultivés avec NR ont montré une augmentation de la longueur des neurites au irradi laserniveaux d'assu- mesurées ici (entre 1,25 et 7,5 W · cm -2). Les échantillons témoins (cellules cultivées sans IP et irradiées avec la même puissance de laser) ne ont montré aucun changement significatif de la longueur. Utilisation d'une dose d'irradiation de 7,5 W · cm -2, la longueur finale des neurites en culture avec de NG108-15 Au NR était d'environ 36% plus élevé (p <0,01) que les échantillons non irradiés au laser. Ce comportement ne était pas spécifiquement liée à la chimie de surface des ORA. Ces valeurs étaient près de 20% supérieure à celle des neurites développés par NG108 -15 seul et exposés à la même valeur de l'exposition au laser (p <0,05) 12. Ces résultats sont en ligne avec les études précédemment publiées sur PC12 cellules neuronales cultivées avec des nanotubes piézoélectriques et irradiés avec des ultrasons rayonnement 7.
Des expériences de contrôle sans Au NR également montré certains effets stimulants de la lumière de 780 nm en termes de pourcentage de neurones avec neurites et le nombre de neurites par neurone. Cette stimulation a été plus efficace à des puissances de laser plus faibles (1,25 W ∙ cm -2) avec une diminution subséquente à l'énergie laser le plus élevé (7,5 W ∙ cm -2) de 12. Une stimulation modérée causée par les NP sans irradiation par laser (poly (styrène sulfonate de) doté d'un revêtement et de la silice revêtue seulement) a été détectée dans le pourcentage de neurones avec 12 neurites. Ces résultats sont en ligne avec les observations publiées récemment que les nanoparticules d'or peuvent augmenter l'activité neuronale in vitro 23,24. La figure 2 montre un exemple d'images de épifluorescence de cellules neuronales différenciées NG108-15 cultivées seules (figure 2A) ou avec l'UA NR (figure 2B ) et irradié avec différentes puissances laser (indiqués sur la figure).
Le potentiel pour la photo-généré intracellulaire de Ca 2+ de presse a été évaluée en utilisant la lumière NIR pulsé conformément aux protocoles 1, 2, et4. Les ions calcium jouent un rôle important dans diverses activités cellulaires, tels que la mitose, la contraction musculaire et l'extension des neurites 25,26. En réponse à un stimulus, Ca 2+ augmente, et oscille diminue, conduisant à l'activation, la modulation ou la cessation d'une fonction spécifique de la cellule. Récemment, les transitoires de Ca2 + ont également été observés à la suite de l'exposition au laser IR en cardiomyocytes. Dans ce travail, les réponses du Ca évoqués après l'exposition IR exposé des amplitudes plus faibles et des temps de récupération plus rapides que les spontanées Ca 2 + transitoires 2. La figure 3 montre un exemple de NG108-15 cellules neuronales chargées de Fluo-quatre heures et imagés avec un Microscope à foyer commun. Fluo-quatre heures a été observée pour entrer dans la membrane cellulaire d'une manière sans perturbation, ce qui entraîne une distribution généralement uniforme de l'indicateur à travers le cytoplasme de la cellule. Seulement mineure coloration organite nucléaire ou cytoplasmique a été détectée. Comme indiqué précédemment, NR devaient être situé au niveau intracellulaire 12. NG108-15 cellules neuronales cultivées seules ou avec des NR et Au poly (styrènesulfonate) doté d'un revêtement-Au-NR ont été exposés par la suite à des irradiations laser entre 0,07 J ∙ cm -2 et 370 J ∙ cm -2, avec la fréquence du laser modulé dans la gamme de 0,5 à 2 Hz.
La figure 4 montre la façon dont des exemples représentatifs de l'amplitude des réponses a été cartographiée en fonction du temps. L'amplitude de la réponse Ca2 + varie avec l'exposition rayonnante (Figure 4A - C) et on a observé de ne pas toujours être déclenché par les impulsions laser (Figure 4C) 13. Les explications les plus probables étaient l'épuisement transitoire de Ca2 + intracellulaire magasins attribués à incomplète Ca 2+ chargement 2 ou l'efficacité des différents NR internalisation dans les cellules neuronales. Lorsque NR ne ont pas été utilisés dans culture (expériences de contrôle, la figure 4D), un effet stimulateur de la lumière 780 nm a également été observée. Cependant, ce produit inférieurs pics de fluorescence d'amplitude et une plus faible probabilité d'activation (détecté dans seulement 16% des échantillons analysés). Dans l'ensemble, une probabilité de NR activation cellulaire induite par laser 48% a été atteint, et malgré les événements de fond dû à la lumière de 780 nm, l'exposition des cellules NR-traités a montré une plus grande efficacité de stimulation avec une énergie de laser inférieur et pics plus élevés de réponse 13. En fait, la réponse du calcium a été trouvé à pic à 0,33 J ∙ cm -2 dans les cellules NR-traités. Cela a été attribué à l'inhibition thermique 13. Pendant les expériences, aucune preuve de bourgeonnement ou toute autre forme de rupture de la membrane cellulaire a été détectée, ce qui est cohérent avec les résultats de Huang et al., Qui ont déclaré photodestruction cellulaire avec une densité de puissance relativement élevée de 19 W ∙ cm -2 appliquée pour 4 2 min7. Aucune activité spontanée dans les cellules NR-traités a été enregistrée sans exposition au laser.
Figure 1: Fibre dispositif expérimental (A) et irradiances moyennes laser en fonction de la puissance du laser pour un faisceau laser de la surface est égale à 0,4 mm 2 (B). paramètres de faisceau sont (A): le demi-angle du cône de lumière sortant maximale de la fibre (θ), le faisceau de rayon (r) et la distance entre la fibre optique et l'échantillon (d).
Figure 2: Exemples d'images de épifluorescence de cellules neuronales différenciées NG108-15 cultivées seules (A) ou avec l'UA NR (B) et irradié avec différentes puissances laser (indiqués sur la figure). Les échantillons ont été incubated pendant une journée avant l'irradiation au laser. Les cellules ont été fixées et marquées pour la tubuline anti-β-III (rouge) et DAPI (bleu) trois jours après l'irradiation au laser. Barres d'échelle sont 100 um.
Figure 3: Exemple de cellules neuronales différenciées NG108-15 chargés de Fluo4-AM Ca 2+ indicateur L'image a été prise avec un microscope confocal inversé avec un objectif huile d'immersion 40X..
Figure 4: Des exemples représentatifs de induites par laser Ca 2+ variations en fonction du temps dans NG108-15 cellules neuronales en culture dans des conditions sans sérum pendant trois jours avec (A) un poly (styrène sulfonate) -au NR, (B, C) Au NR, et (D) sans NR (échantillon témoin). Ces résultats étaientobtenus avec des impulsions laser de 100 ms (A, C, D) et 50 (B) ms. Les fréquences utilisées pour les expériences (lignes verticales en tirets) ont été 1 Hz (A - C) et 0,5 Hz (D). Les expositions par rayonnement sont calculées 69,4 J ∙ cm -2 (A), 34,7 J ∙ cm -2 (B), 0,37 J cm -2 ∙ (C) et 138,87 J ∙ cm -2 (D). F max / F 0 indique l'augmentation maximale de fluorescence détectée dans NG108 -15 cellules neuronales, l'étalonnage avec les ionomycine (reproduit avec la permission 13).
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Discussion
Les protocoles décrits dans cette présentation décrivent comment la culture, différencier et optiquement stimuler les cellules neuronales en utilisant absorbeurs extrinsèques. Les caractéristiques de NR (par exemple, les dimensions, la forme, plasmon longueur d'onde de résonance et de la chimie de surface) et les paramètres de stimulation laser (tels que la longueur d'onde, durée d'impulsion, taux de redoublement, etc.) peuvent être modifiées pour correspondre à différents besoins expérimentaux. Les effets sur le comportement des cellules peuvent être surveillées en utilisant des essais classiques et des matériaux biologiques. Dans l'ensemble l'approche fournit un moyen simple, mais puissant, moyen pour irradier populations de cellules in vitro et pourrait être étendu à des cellules primaires, des échantillons de tissus et dans les études in vivo.
Les principales exigences que NR Au besoin pour satisfaire à être utilisé pour des applications biologiques sont la stabilité (chimique et physique) et la biocompatibilité. Ce dernier point est particulièrement critique, du fait de la présence d'un agent tensioactif cationique (commonLy CTAB) sur la surface de l'UA. CTAB est connue pour induire une cytotoxicité in vitro 28 et in vivo 29 et il est couramment utilisé pendant le processus de synthèse pour entraîner la formation NR-forme 30. De stabilité et de la biocompatibilité sont souvent améliorées par le dépôt de revêtements additionnels sur la surface de Au NR (par exemple le polyethylene glycol, la silice) 31. Pour évaluer la biocompatibilité, différents essais peuvent être utilisés in vitro (par exemple vivants / morts, MTS, MTT, etc.) tandis que l'analyse histologique est souvent effectuée lors des expériences de tissus 7,8,12,15.
Un autre défi à relever quand on travaille avec des nanomatériaux est la difficulté de déterminer correctement leur concentration molaire. La grande variété des IP en termes de forme, la taille et les propriétés chimiques rend les techniques actuellement disponibles seulement approprié pour certaines catégories de particules. Par exemple, la lumière dynamique standard ScatteRing méthode suppose que les IP ont une forme sphérique et diffusion de la lumière isotrope 17. Par conséquent, l'application de cette méthode aux résultats Au RN des divergences entre la concentration mesurée et la vraie. La question de la concentration NP est particulièrement problématique si elle est liée au domaine de la nanomédecine, où la concentration administrée doit être contrôlée avec précision afin de maximiser l'efficacité du processus (par exemple pour des applications de délivrance de médicaments) et de minimiser la toxicité des nanomatériaux 17. Dans les études rapportées ici, la densité optique utilisé a donné de bons résultats en termes de la viabilité des cellules et le nombre des particules.
En raison de leurs propriétés d'absorption intrinsèques, Au IP sont souvent utilisés en combinaison avec une source laser. Au cours de l'exposition, l'absorption et la dispersion sont les deux procédés principaux susceptibles de se produire à la surface des NP. Si la longueur d'onde laser correspondant à la longueur d'onde de résonance de plasmons, absorption souventl'emporte sur la diffusion, excitant les électrons de conduction à la surface NP. Ceux-ci forment un gaz d'électrons qui se éloigne de sa position d'équilibre et crée une oscillation de résonance cohérent appelé résonance des plasmons de surface localisés (LSPR). L'énergie est ensuite transférée dans le réseau cristallin sous forme de chaleur NP, qui est ensuite dissipée rapidement dans le milieu ambiant 32. Puisque la chaleur est le principal effet observé après l'excitation du LSPR NR, il est recommandé de surveiller la viabilité des cellules après l'exposition au laser.
Il a été émis l'hypothèse que les effets observés sur l'excroissance des neurites et la concentration intracellulaire de Ca 2+ voie étaient dus à l'échauffement transitoire découlant de l'excitation de la LSPR. Cette hypothèse est en ligne avec l'activation du canal TRPV1 sensible à la température après l'exposition magnétique de ferrite IP 5. Ce processus est également compatible avec les observations que les chaînes de TRPV4 thermiquement sensibles play un rôle important dans la stimulation du nerf infrarouge 33. Au niveau moléculaire, il a été récemment montré que TRPV4 thermosensible est seulement après l'interaction de la phosphoinositide -4,5 -biphosphate (PIP 2) avec le canal 34. Par conséquent, il est possible que le chauffage transitoire survenant après excitation NR pourrait servir à accélérer et / ou induire l'ouverture des canaux de TRPV4. Cette hypothèse peut être confirmée par des expériences futures Ca 2+ en utilisant Ca 2+ - milieu exempt et / ou contrôles moléculaires sur le PIP 2 appauvrissement.
Différents groupes ont également démontré que les petits gradients de température sur la gamme de température physiologique peuvent être utilisés pour induire d'autres réactions, telles que cône de croissance neuronale de guidage 25 ou de dépolarisation des courants dans les cellules de rein embryonnaire humain 35. Yong et ses collègues ont enregistré une augmentation significative de l'activité de signal électrique dans le primaire auditive neurones culteme- avec revêtus de silice Au NR après l'irradiation laser des ORA au LSPR. Le chauffage produit par les particules irradiées par laser a été mesurée en utilisant des techniques de patch-clamp 14. Plus récemment, Eom et al. A enregistré une augmentation de l'amplitude de la CNaPS après l'exposition au laser de 3,4 × 10 9 Au NR lorsque perfusé en continu dans le voisinage de la gaine du faisceau nerveux d'un nerf sciatique de rat 15.
L'effet stimulateur de la diode laser 780 nm observée au cours des expériences était pas liée à la chaleur générée par absorption d'eau, comme cela est connu pour être négligeable à 780 nm 36. Les résultats publiés antérieurement ont également signalé des effets stimulants de 780 nm la lumière sur le tissu neuronal in vivo 37,38. Des études in vitro ont démontré l'implication des espèces réactives de l'oxygène dans le processus 39. Cependant, les mécanismes détaillés qui NIR stimulation affecte transcriptio géniquen et d'autres activités cellulaires sont actuellement en suspens. Les données actuelles suggèrent l'interaction des différents effets de la stimulation, y compris l'absorption de photons à l'intérieur de chromophores dans les mitochondries (près de 50% de l'énergie à 780 nm peut être absorbé par la cytochrome c oxydase) 37,39-41, des changements de perméabilité de la membrane au calcium et 37 l'inhibition de l'activité inflammatoire dans les cellules 37.
Les résultats présentés dans ce manuscrit démontrent que les absorbeurs de nanoparticules sont très prometteurs pour des applications futures dans stimulation optique des cellules neuronales. Le principal avantage réside dans la capacité de la lumière NIR de pénétrer profondément dans les tissus (fenêtre thérapeutique). Ces résultats montrent également que les absorbeurs de nanoparticules peuvent améliorer et / ou remplacer le processus de stimulation neurale infrarouge basé sur l'absorption d'eau. Pour les applications futures prothèses neurales, il serait intéressant d'étudier différents functionalizat de surfaceions avec une affinité chimique pour axones neuronaux, qui sont les principales cibles pour de nombreuses applications de stimulation optiques.
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Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier NanoVentures l'Australie pour le soutien financier de Voyage et le professeur John Haycock pour avoir partiellement accueilli cette recherche à l'Université de Sheffield et Mme Jaimee Mayne pour son aide pendant le tournage.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Au NR | Sigma Aldrich | 716812 | |
| NG108-15 | Sigma Aldrich | 8811230 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6546 | |
| FCS | Life Technologies | 10100147 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290018 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Triton X-100 | BDH | T8532 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2058 | |
| Anti-βIII-tubulin | Promega | G7121 | |
| TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody | Sigma Aldrich | T5393 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 472301 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| UV-Vis spectrometer | Varian Medical Systems Inc. | Cary 50 Bio | |
| Mini centrifuge | Eppendorf | Mini Spin | |
| Sonic bath | Unisonics Australia | FPX 10D | |
| Cell culture incubator | Kendro | Hera Cell 150 | |
| Cell culture centrifuge | Hettich | Rotofix 32A | |
| Laser diode | Optotech | 780 nm single mode fibre - coupled LD | |
| Optical fiber | Thorlabs | 780 HP | |
| Power meter | Coherent | Laser Check | |
| ImageJ | http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html | ||
| Epifluorescent microscope | Axon Instruments | ImageX-press 5000A | |
| μ-slide well | Ibidi | 80826 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy Ltd. | LSM 510 meta-confocal microscope | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS210 |
References
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