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Neuroscience

गोल्ड neuronal कोशिकाओं की ऑप्टिकल उत्तेजना nanorod की सहायता

Published: April 27, 2015 doi: 10.3791/52566
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biotactical Engineering, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology

Introduction

हाल के अध्ययनों से पानी (तरंगदैर्ध्य> 1400 एनएम) द्वारा अवरक्त प्रकाश के अवशोषण के साथ जुड़े क्षणिक हीटिंग तंत्रिका ऊतक एक और cardiomyocytes 2 में intracellular कैल्शियम यात्रियों में कार्रवाई क्षमता उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रदर्शन किया है। अवरक्त प्रकाश के उपयोग के कारण संभावित महीन स्थानिक संकल्प, तंत्रिका कृत्रिम अंग में अनुप्रयोगों के लिए महान ब्याज उठाया गया है, आनुवंशिक रूप से करने के लिए प्रत्यक्ष ऊतक के साथ संपर्क, उत्तेजना कलाकृतियों के न्यूनतम, और जरूरत को हटाने की कमी (उत्तेजना के लिए पहले कोशिकाओं को संशोधित ) optogenetics में आवश्यकता के रूप में एक। इन लाभों के सब होने के बावजूद, हाल ही में विकसित थर्मल मॉडल लक्ष्य ऊतक / कोशिकाएं कई प्रोत्साहन साइटों और / या उच्च पुनरावृत्ति दरों 3,4 उपयोग किया जाता है जब संचयी हीटिंग प्रभाव से प्रभावित किया जा सकता है कि सुझाव दिया।

इन चुनौतियों के जवाब में, शोधकर्ताओं ने बाह्य absor का उपयोग करने की क्षमता को मान्यता दी हैतंत्रिका उत्तेजना के लिए सदस्यों के ऊतकों में अधिक स्थानीय हीटिंग प्रभाव उत्पन्न करने के लिए। हुआंग एट अल। दूर से एक रेडियो आवृत्ति चुंबकीय क्षेत्र के साथ 5 HEK 293 कोशिकाओं में तापमान के प्रति संवेदनशील TRPV1 चैनलों को सक्रिय करने के superparamagnetic फेराइट नैनोकणों का उपयोग करके इस सिद्धांत का प्रदर्शन किया। इस तकनीक (चुंबकीय क्षेत्र ऊतक के साथ अपेक्षाकृत कमजोर बातचीत) गहरी पैठ के लिए अनुमति दे सकता है, प्रतिक्रियाओं का ही नहीं बल्कि बायोनिक उपकरणों 5 में आवश्यक मिलीसेकंड durations के तुलना में, सेकंड की अवधि में दर्ज किए गए। इन विट्रो में काला सूक्ष्म कणों के साथ चूहे cortical न्यूरॉन्स की इसी तरह, फराह एट अल। प्रदर्शन किया बिजली की उत्तेजना। वे संभावित तेजी से पुनरावृत्ति दरों 6 के लिए अनुमति देता है, μJ की रेंज में μs और ऊर्जा के सैकड़ों के आदेश पर नब्ज durations का उपयोग कर उत्तेजना में सेल-स्तर परिशुद्धता दिखाया।

बाह्य अवशोषक का उपयोग भी प्रेरित करने के लिए लागू किया गया हैइन विट्रो में morphological परिवर्तन। Ciofani एट अल। अल्ट्रासाउंड 7 से उत्साहित पीजोइलेक्ट्रिक बोरान नाइट्राइड नैनोट्यूब का उपयोग कर neuronal सेल परिणाम में एक ~ 40% वृद्धि देखी गई। इसी तरह, PC12 कोशिकाओं में endocytosed लोहे के आक्साइड नैनोकणों के कारण लोहे के आक्साइड 8 के साथ सेल आसंजन अणुओं की सक्रियता के लिए, एक खुराक पर निर्भर तरीके से neurite भेदभाव को बढ़ाने के लिए सूचित किया गया है।

हाल ही में, तंत्रिका उत्तेजना की सहायता के लिए बाह्य अवशोषक में ब्याज भी सोने के नैनोकणों के उपयोग (एयू एनपीएस) पर ध्यान केंद्रित किया है। एयू एनपीएस कुशलतापूर्वक plasmonic चरम पर लेजर प्रकाश को अवशोषित करने के लिए और गर्मी 9 के रूप में आसपास के वातावरण में फैलने की क्षमता है। - 10 उपलब्ध कण आकार के सभी के बीच, सोने nanorods की ऑप्टिकल अवशोषण (एयू एनआरएस) सुविधा (निर, 750-1,400 एनएम के बीच तरंगदैर्ध्य अवरक्त के पास) जैविक ऊतकों की चिकित्सीय खिड़की से मेल खाता है। इसके अलावा, शेष भाग मेंतंत्रिका उत्तेजना की, ext एयू एनआरएस के उपयोग अपेक्षाकृत अनुकूल biocompatibility और सतह functionalization विकल्पों में 11 की एक विस्तृत श्रृंखला उपलब्ध कराता है। हाल के अध्ययनों से भेदभाव पर एक उत्तेजक प्रभाव NG108-15 neuronal कोशिकाओं 12 में एयू एनआरएस के सतत लेजर जोखिम के बाद प्रेरित किया जा सकता है कि पता चला है। इसी तरह, intracellular कैल्शियम यात्रियों चर आवृत्तियों और नाड़ी के साथ संग्राहक लेजर विकिरण 13 लंबाई के बाद एयू एनआरएस साथ सुसंस्कृत neuronal कोशिकाओं में दर्ज किए गए। कोशिका झिल्ली विध्रुवण भी सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स 14 के प्राथमिक संस्कृतियों में एयू एनआरएस के NIR से लेजर रोशनी के बाद दर्ज की गई थी। विकिरणित एयू एनआरएस साथ विवो आवेदन में पहली अभी हाल ही में प्रदर्शित किया गया है। EOM और सहकर्मियों उनके plasmonic चरम पर एयू एनआरएस अवगत कराया और यौगिक तंत्रिका कार्रवाई क्षमता (CNAPs) के आयाम में छह गुना वृद्धि हुई है और चूहे sciatic नसों में उत्तेजना दहलीज में तीन गुना कमी दर्ज की गई। एनhanced प्रतिक्रिया एन.आर. plasmonic शिखर 15 की उत्तेजना से उत्पन्न स्थानीय हीटिंग प्रभाव के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था।

वर्तमान में कागज, एयू एनआरएस साथ सुसंस्कृत NG108-15 neuronal कोशिकाओं में लेजर उत्तेजना के प्रभाव की जांच के लिए प्रोटोकॉल निर्दिष्ट कर रहे हैं। इन विधियों मानक जैविक तकनीक और सामग्री का उपयोग इन विट्रो में सेल आबादी चमकाना करने के लिए एक सरल, अभी तक शक्तिशाली, जिस तरह से प्रदान करते हैं। प्रोटोकॉल सुरक्षित संचालन और repeatable संरेखण की अनुमति देता है कि एक फाइबर युग्मित लेजर डायोड (एलडी) पर आधारित है। एयू एन.आर. नमूना तैयार करने और लेजर विकिरण के तरीकों आगे विशिष्ट संश्लेषण और संस्कृति प्रोटोकॉल क्रमशः, जाना जाता है प्रदान करने, अलग कण आकार और neuronal सेल संस्कृतियों के लिए बढ़ाया जा सकता है।

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Protocol

1. एयू एनआरएस तैयारी

नोट: एयू एनआरएस व्यंजनों 16 के एक नंबर के द्वारा संश्लेषित, या वाणिज्यिक विक्रेताओं से खरीदा जा सकता है।

  1. यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से, 0.5-2 एनएम के एक संकल्प के साथ 300 एनएम एनएम 1000 से अवशोषण मूल्यों रिकॉर्डिंग से एयू एन.आर. समाधान की प्रारंभिक ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) को मापने। समाधान की मात्रा उपलब्ध क्युवेट के साथ प्रयोग किया जा करने के लिए बदलती हैं।
  2. एक उपयुक्त तकनीक 17 के साथ प्रारंभिक एनपी दाढ़ एकाग्रता (जैसे यूवी विज़ स्पेक्ट्रोस्कोपी, एक कण उपपादन द्वारा मिलकर प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी) मूल्यांकन नहीं है या विक्रेता द्वारा प्रदान की एकाग्रता मूल्यों का उपयोग करें।
  3. , सबसे अच्छा repeatability के लिए 1. = एक आयुध डिपो तक पहुंचने के परीक्षण के नमूने के सभी के लिए आयुध डिपो स्थिर रखने के लिए प्रारंभिक एयू एन.आर. नमूना गिराए द्वारा एक 5 मिलीलीटर शेयर समाधान तैयार है। गिराए विलायक की रचना के लिए वाणिज्यिक विक्रेता के प्रोटोकॉल का पालन करें। यदि अनिश्चित, विआयनीकृत पानी का उपयोग करें।
  4. दो बार 15 मिनट के लिए एयू एन.आर. समाधान के 1 एमएल 7800 XG पर अपकेंद्रित्र समाधान से किसी भी रासायनिक अतिरिक्त हटाने के लिए। केन्द्रापसारण चक्र शक्ति और समय (उदाहरण के लिए 20 मिनट पर 5600 × छ) 18 में भिन्न हो सकते हैं।
  5. Supernatants निकालें और विआयनीकृत पानी में एनआरएस फिर से निलंबित। फिर से निलंबित कणों समाधान में समुच्चय फार्म कर सकते हैं, सबसे अच्छा परिणाम है उन्हें दैनिक तैयार करते हैं। वैकल्पिक रूप से, एक हफ्ते से भी नहीं रह गया है के लिए एक फ्रिज में स्टोर। स्थिर नहीं रहो।
  6. सेल संस्कृति शर्तों के तहत उपयोग करने से पहले, 5 मिनट के लिए एयू एन.आर. समाधान sonicate और फिर (मेगावाट एम ∙ कम नहीं 400 से अधिक -2 254 एनएम पर पराबैंगनी विकिरण तीव्रता) 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ बाँझ।

2. NG108-15 Neuronal सेल लाइन संस्कृति और भेदभाव

  1. सेल संस्कृति माध्यम के लिए, बाँझ Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) भ्रूण बछड़ा सीरम (w / v) (एफसीएस) 10% से युक्त, 1% (डब्ल्यू / वी) एल glutamine, 1% की 500 मिलीलीटर की तैयारी(डब्ल्यू / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 0.5% (डब्ल्यू / वी) Amphotericin बी
    नोट: की खुराक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत, aliquoted और आवश्यक दिन पर मीडिया के लिए जोड़ा जा सकता है। सेल संस्कृति माध्यम 1 महीने की एक अधिकतम के लिए एक बाँझ हालत में प्रशीतित किया जा सकता है।
  2. सेल भेदभाव मध्यम के लिए, 1% से युक्त बाँझ DMEM के 50 मिलीलीटर की तैयारी एल glutamine, 1% (डब्ल्यू / वी) पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 0.5% (डब्ल्यू / वी) Amphotericin बी (w / v)
  3. (37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2) humidified माहौल के साथ एक मशीन में polystyrene से बना T75 बोतल में सेल संस्कृति के माध्यम से 10 एमएल में NG108-15 neuronal कोशिकाओं आगे बढ़ें। आम तौर पर, 3-4 दिनों में तैयार होने की प्रत्येक फ्लास्क में 1.5-2 × 10 5 कोशिकाओं बीज। हर दो दिन सेल संस्कृति के माध्यम से बदलें।
    नोट: प्रयोगों के लिए पारित होने के 21 से अधिक उम्र की कोशिकाओं का उपयोग नहीं करते, आनुवंशिक drifts या परिवर्तन को रोकने के लिए।
  4. जब 70-80% मिला हुआ संस्कृति में, गर्म ताजा सेल संस्कृति के माध्यम से मध्यम बदल जाते हैं। यंत्रवत् धीरे knoc द्वारा कोशिकाओं को अलगराजा मिला हुआ कुप्पी के नीचे। ट्रिप्सिन का प्रयोग न करें।
  5. अपकेंद्रित्र 600 XG और कम 5 मिनट के लिए सेल निलंबन फिर से निलंबित गर्म सेल भेदभाव मध्यम 2 मिलीलीटर में सेल गोली।
  6. सेल भेदभाव माध्यम के 200 μl के साथ एक टिशू कल्चर polystyrene के 96 अच्छी तरह से थाली में बीज 2 × 10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी। 5% सीओ 2/37 डिग्री सेल्सियस पर एक दिन के लिए प्रयोग सेते हैं।
  7. दिन 2 पर एयू एन.आर. समाधान के 10 0 1 × -4.2 9 10 × 3.2 के बीच कणों / मिलीलीटर जोड़ें और अतिरिक्त 24 घंटा के लिए यह सेते हैं। नियंत्रण प्रयोगों के लिए कणों न जोड़ें।
    नोट: एक विकल्प के नियंत्रण के रूप में, एक अच्छी तरह से भेदभाव शिखर अवशोषण तरंग दैर्ध्य के साथ Au एनपीएस तुलना प्रयोजनों के 14 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक और अधिक सुसंगत सेल व्यवहार के लिए, निरंतर सेल घनत्व रखने के लिए और सेल बोने के लिए पहले अच्छी तरह से सतह को संशोधित नहीं है।

3. neurite परिणाम संवर्धन

  1. युगलएक एकल मोड ऑप्टिकल फाइबर के साथ लेजर (संख्यात्मक एपर्चर = 0.13) और (एफसी कनेक्टर्स सुविधाजनक है और आमतौर पर उपलब्ध हैं) एक फाइबर कनेक्टर के साथ इसे समाप्त। एक मानक बिजली मीटर के साथ उत्पादन लेजर शक्ति को मापने। सबसे प्रभावी परिणाम प्राप्त करने के लिए, एनआरएस के plasmon अनुनाद पीक करने के लिए लेजर के शिखर तरंगदैर्ध्य से मेल खाते हैं।
  2. 3 दिन के निम्न एन.आर. ऊष्मायन पर, अच्छी तरह से करने के लिए एफसी कनेक्टर तय कर लो। अलग लेजर शक्तियों के लिए, निरंतर तरंग में 1 मिनट के लिए आरटी पर नमूने और नियंत्रण चमकाना। संस्कृति 5% सीओ 2/37 डिग्री सेल्सियस पर तीन अतिरिक्त दिनों के लिए आगे बढ़ने के लिए अनुमति दें। तीन स्वतंत्र मापन की एक न्यूनतम के लिए लेजर विकिरण दोहराएँ।
    नोट: अलग विकिरण टाइम्स और नाड़ी आवृत्तियों आवेदन के आधार पर, का चयन किया जा सकता है।
  3. किरण व्यास और लेजर विकिरण के मामले में लेजर विशेषताएँ (डब्ल्यू ∙ सेमी -2)।
    1. एक मानक एकल मोड फाइबर के लिए, एनए n = ∙ पाप θ का उपयोगएन उपयोग में मध्यम का अपवर्तनांक है और θ फाइबर बाहर निकलने प्रकाश की शंकु के आधे कोण है, जहां (चित्रा 1 ए देखें)। आर बीम त्रिज्या है जहां त्रिकोणमिति, आर = तन θ ∙ डी, और डी से फाइबर और नमूना के बीच की दूरी है। एफसी कनेक्टर इसलिए एक दूरी डी में नमूना = 2.70 ± 0.20 मिमी रोशन, अच्छी तरह के व्यास से मेल खाता है। लाइट, आर = टैन (पाप-1 (एनए / एन)) देने डी ∙ (एन = 1.33) पानी में फाइबर से बाहर निकालता है।
    2. बाद के समीकरण का प्रयोग, लेजर बीम त्रिज्या, इसी बीम क्षेत्र और लक्ष्य पर औसत लेजर विकिरण (बीम क्षेत्र से विभाजित लेजर पावर) की गणना (चित्रा 1 बी में उदाहरण ग्राफ देखें)। इन मूल्यों को प्रबुद्ध क्षेत्र में औसत विकिरण का प्रतिनिधित्व करते हैं।
    3. त्रुटि प्रचार के सामान्य सिद्धांत के साथ मापन के लिए त्रुटियों का मूल्यांकन।
      नोट: दूरी बीetween एफसी कनेक्टर और नमूना उपयुक्त सॉफ्टवेयर (जैसे ImageJ) का उपयोग कर छवि की प्रायोगिक व्यवस्था और बाद के प्रसंस्करण की तस्वीरों से मापा जा सकता है।
  4. 5 दिन में, प्रयोगों से सेल भेदभाव मध्यम हटाने और 3.7% 10 मिनट के लिए (वी / वी) formaldehyde के समाधान के साथ नमूनों को ठीक है, तो 0.1% 20 मिनट के लिए (वी / वी) ट्राइटन X-100 के साथ कोशिकाओं permeabilize।
  5. (W / v) 60 मिनट के लिए नमूने के गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) बाध्यकारी साइटों unreacted प्रोटीन ब्लॉक करने के लिए 3% जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर विरोधी βIII ट्यूबिलिन रातोंरात (पीबीएस में / एमएल 5 माइक्रोग्राम प्रति बीएसए का 1% के साथ पूरक) के लिए नमूने लेबल।
  6. पीबीएस में 1% BSA में 0.4-2 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल की एकाग्रता का उपयोग कर (जैसे TRITC संयुग्मित विरोधी माउस आईजीजी एंटीबॉडी) एक उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ अंधेरे में 90 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते हैं। 10 मिनट के लिए DAPI (0.1 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर में de-ionized पानी) के साथ सेल नाभिक लेबल।
    नोट: एंटीबॉडी विकार और एकाग्रता मिगहिंदुस्तान टाइम्स कंपनी प्रोटोकॉल के अनुसार बदलती हैं। दो बार प्रत्येक धुंधला चरण के बाद 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ धो नमूने हैं।
    चित्र 1
  7. कम से कम एक 20 × उद्देश्य का उपयोग epifluorescence या confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा छवि नमूने हैं। माइक्रोस्कोप माध्यमिक एंटीबॉडी को तदनुसार फिल्टर चुनें। एक DAPI फिल्टर का चयन करें (λ पूर्व = 358 एनएम, λ ईएम 488 एनएम =) सेल नाभिक कल्पना करने के लिए।
  8. आकलन करके चित्रों का विश्लेषण: मैं) अधिकतम neurite लंबाई (रिकार्ड सेल शरीर की शुरुआत करने के neurite की नोक से लंबाई), द्वितीय) neuronal सेल प्रति neurites की संख्या () सेल प्रति neurites की सभी को योग और iii) neurites के साथ कोशिकाओं का प्रतिशत (एक सकारात्मक दाग नाभिक के साथ कोशिकाओं की कुल संख्या) 19 से βIII ट्यूबिलिन व्यक्त कोशिकाओं की कुल संख्या से विभाजित।

4. Intracellular सीए 2 + इमेजिंग लेजर प्रेरित

Pluronic एफ-127 के शेयर समाधान (w / v) निर्जल डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) के 10 मिलीलीटर में घुला हुआ पदार्थ के 2 जी भंग करके एक 20% की तैयारी। विलेयता में वृद्धि करने के बारे में 20 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर Pluronic एफ-127 के समाधान हीट। आरटी पर संग्रहीत अगर यह पहले से तैयार करें।
  • एनआर ऊष्मायन के बाद 3 दिन, एक संतुलित नमक समाधान तैयार (बीएसएस, 135 मिमी NaCl, 4.5 मिमी KCl, 1.5 मिमी 2 CaCl, 0.5 मिमी 2 MgCl, 5.6 मिमी ग्लूकोज, और 10 मिमी HEPES, पीएच 7.4) और 5 के साथ यह पूरक DMSO में Fluo-04:00 और 0.1% की माइक्रोन (w / v) Pluronic एफ-127 के समाधान के।
    नोट: बीएसएस समाधान अग्रिम में तैयार किया और एक महीने की एक अधिकतम के लिए प्रशीतित किया जा सकता है। प्रयोग के दिन की खुराक (Fluo-4 बजे और Pluronic एफ-127) जोड़ें।
  • सेल भेदभाव मध्यम निकालें और पूरक बीएसएस समाधान के साथ बदलें। एक औंधा confocal खुर्दबीन के साथ सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए, अच्छी तरह से एक माइक्रो स्लाइड में कोशिकाओं को सेते हैं।
  • Fluo-04:00 के साथ लोड NG108-15 कोशिकाओं5% सीओ 2/37 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए। ऊष्मायन समय के बाद, किसी भी बाह्य उतार फ्लोरोफोरे दूर करने के लिए बीएसएस के साथ दो बार के नमूने धो लें।
  • जोड़े को एक एकल मोड ऑप्टिकल फाइबर के साथ लेजर और मानक तकनीक का उपयोग कर टिप फोड़ना। (टिप माइक्रोस्कोपी निरीक्षण पर फाइबर अक्ष को सीधा और सपाट होना चाहिए यानी) एक उच्च गुणवत्ता की सतह सुनिश्चित करने के लिए, एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के अंतर्गत जिसके परिणामस्वरूप टिप को ध्यान से देखें।
    1. एक मानक बिजली मीटर के साथ उत्पादन लेजर शक्ति को मापने। एक ऑप्टिकल फाइबर धारक में प्रकाश वितरण फाइबर डालें और एक micropositioner के लिए यह प्रत्यय। ब्राउन एट अल का संदर्भ लें। 20 ऑप्टिकल फाइबर तैयार करने और स्थिति के बारे में अधिक जानकारी के लिए।
      सावधानी: (उदाहरण के लिए लेजर बीम में सीधे मत देखो से निपटने के दौरान लेजर सुरक्षा चश्मे पहनते हैं, अन्य लैब उपयोगकर्ताओं को आवारा प्रकाश प्रदर्शन को रोकने) लेजर बिजली की माप के दौरान लेजर सुरक्षा के लिए सामान्य नियमों का पालन करें <।/ ली>
  • ऑप्टिकल मॉडुलन नजर रखने के लिए पोर्टेबल लेजर के लिए एक आस्टसीलस्कप कनेक्ट करें। चर आवृत्तियों (0.5-2 हर्ट्ज) और नाड़ी लंबाई (20-100 मिसे) के साथ एक द्विआधारी संकेत का प्रयोग करें। Paviolo एट अल। 13 में दिखाया गया सेटअप के बाद, माइक्रोस्कोप के लिए ट्रांजिस्टर-ट्रांजिस्टर तर्क (टीटीएल) के रूप में मॉडुलन संकेत का उपयोग लेजर इनपुट कनेक्ट।
    1. एक औंधा confocal खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं प्लेस और दूर संचरण रोशनी मोड में लक्ष्य सेल से प्रकाश वितरण फाइबर 250 ± 50 माइक्रोन की स्थिति। इस दूरी में, लक्ष्य पर किरण त्रिज्या गणना करने के लिए 3.3.1 में प्रस्तुत समीकरणों का उपयोग करें।
  • भाँति Fluo-04:00 डाई उत्तेजित करने के लिए एक आर्गन आयन लेजर (488 एनएम) का उपयोग करें (λ पूर्व = 494 एनएम, λ ईएम 516 एनएम =) और endocytosed एनआरएस की उत्तेजना के लिए सिंक्रनाइज़ एलडी। समय श्रृंखला स्कैन इकट्ठा करके कम से कम एक 40 × उद्देश्य का उपयोग नमूने और नियंत्रण के आरटी पर इमेजिंग प्रदर्शन256 256 × पिक्सल / कम से कम 4 हर्ट्ज की एक आवृत्ति के साथ गोल यात्रा मोड में फ्रेम संकल्प के साथ। किसी भी आर्गन आयन लेजर हस्तक्षेप (आधारभूत शोर) की पहचान करने के लिए किसी भी एलडी उत्तेजना के बिना एक रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करते हैं।
  • Adaptively भारित सज़ा कम से कम वर्गों एल्गोरिदम 21 का उपयोग कर डेटा से पृष्ठभूमि निकालें। समय के एक समारोह के रूप में प्रेरित सीए 2 + विविधताओं प्लॉट। एक स्तर पर आधारभूत शोर (3σ) की तीन बार मानक विचलन thresholding द्वारा छवि पोस्ट प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रतिदीप्ति तीव्रता में क्षणिक चोटियों का विश्लेषण करें।

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    Representative Results

    यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल 1, 2, और 3 का उपयोग करके, भेदभाव पर एक उत्तेजक प्रभाव एयू एनपीएस के साथ सुसंस्कृत NG108-15 neuronal कोशिकाओं में मनाया गया लेजर के बाद (एयू एनआरएस, पाली (styrenesulfonate) एयू एनआरएस और सिलिका लेपित एयू एनआरएस लिपटे) 1.25 और 7.5 डब्ल्यू के बीच जोखिम · सेमी -2। RhodamineB लेबल एयू एनआरएस के Confocal छवियों कणों ऊष्मायन 12 के दिन एक से भली भाँति गया है कि प्रदर्शन किया। स्थानीयकरण मुख्य रूप से तेज की पसंदीदा तंत्र सेल शरीर झिल्ली 12 के माध्यम से किया गया था यह दर्शाता है कि सेल कोशिका द्रव्य में मनाया गया। NG108-15 neuronal कोशिकाओं में भेदभाव उत्प्रेरण के बाद पता चला मुख्य morphological परिवर्तन प्रसार की गिरफ्तारी, βIII ट्यूबिलिन प्रोटीन की अभिव्यक्ति और अधिकतम लंबाई और संख्या 22 के संदर्भ में विश्लेषण किया गया है, जो neurites की परिणाम थे।

    एनआरएस साथ सुसंस्कृत नमूने लेजर irradi पर एक neurite लंबाई में वृद्धि देखी गईयहाँ मापा मंजूरी स्तर (1.25 और 7.5 डब्ल्यू के बीच · सेमी -2)। नियंत्रण के नमूने (एनपीएस के बिना सभ्य और एक ही लेजर शक्ति के साथ विकिरणित कोशिकाओं) की लंबाई में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखाया। 7.5 डब्ल्यू · सेमी -2, एयू एनआरएस साथ सुसंस्कृत NG108-15 के अंतिम neurite लंबाई की एक विकिरण खुराक का उपयोग गैर लेजर विकिरणित नमूनों की तुलना में मोटे तौर पर 36% अधिक (पी <0.01) था। यह व्यवहार विशेष रूप से एनआरएस की सतह के रसायन शास्त्र से जुड़ा हुआ नहीं था। इन मूल्यों को अकेले -15 NG108 द्वारा विकसित की है और लेजर जोखिम (पी <0.05) 12 का एक ही मूल्य के संपर्क में neurites की तुलना में लगभग 20% अधिक थे। इन परिणामों के अल्ट्रासाउंड विकिरण 7 के साथ पीजोइलेक्ट्रिक नैनोट्यूब के साथ सुसंस्कृत और विकिरणित PC12 neuronal कोशिकाओं पर पहले प्रकाशित अध्ययन के साथ लाइन में हैं।

    एयू एनआरएस बिना नियंत्रण प्रयोगों भी पूर्वोत्तर के neurites और संख्या के साथ न्यूरॉन्स के प्रतिशत के मामले में 780 एनएम प्रकाश की कुछ उत्तेजक प्रभाव दिखायान्यूरॉन प्रति urites। इस उत्तेजना कम लेजर शक्तियों (1.25 डब्ल्यू ∙ सेमी -2) उच्चतम लेजर ऊर्जा पर बाद में एक कमी के साथ (7.5 डब्ल्यू ∙ सेमी -2) 12 पर और अधिक प्रभावी था। किसी भी लेजर विकिरण के बिना एनपीएस की वजह से एक उदारवादी उत्तेजना (पाली (styrenesulfonate) लिपटे और सिलिका लेपित केवल) neurites के 12 के साथ न्यूरॉन्स के प्रतिशत में खोजा गया था। इन परिणामों के सोने के नैनोकणों विट्रो 23,24 में neuronal गतिविधि में वृद्धि कर सकते हैं कि हाल ही में प्रकाशित टिप्पणियों के साथ लाइन में हैं। चित्रा 2 अकेले सुसंस्कृत विभेदित NG108-15 neuronal कोशिकाओं (2A चित्रा) या एयू एनआरएस के साथ की epifluorescence छवियों का एक उदाहरण (चित्रा 2B से पता चलता है ) और आकृति में संकेत अलग लेजर शक्तियों () के साथ विकिरणित।

    फोटो जनित इंट्रासेल्युलर सीए 2 + रिहाई के लिए संभावित प्रोटोकॉल 1, 2 के अनुसार स्पंदित NIR के प्रकाश का उपयोग मूल्यांकन किया गया था, और4. कैल्शियम आयनों ऐसे पिंजरे का बँटवारा, मांसपेशियों में संकुचन और neurite विस्तार 25,26 के रूप में विभिन्न सेलुलर गतिविधियों, में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। एक उत्तेजना के जवाब में, सीए 2 + बढ़ जाती है, एक विशेष सेल समारोह की सक्रियता, मॉडुलन या समाप्ति के लिए अग्रणी झूल रहे हैं और कम हो जाती है। हाल ही में, सीए 2 + यात्रियों को भी cardiomyocytes में आईआर लेजर निवेश का एक परिणाम के रूप में मनाया गया है। आईआर जोखिम कम आयाम और सहज सीए 2 + यात्रियों दो से अधिक तेजी से वसूली बार प्रदर्शित होने के बाद उस काम में, सीए 2 + प्रतिक्रियाओं पैदा की। तीन एक साथ Fluo-04:00 से भरी हुई है और imaged NG108-15 neuronal कोशिकाओं का एक उदाहरण से पता चलता है confocal खुर्दबीन। Fluo-04:00 सेल कोशिका द्रव्य भर में सूचक की एक आम तौर पर समान वितरण, जिसके परिणामस्वरूप एक गैर विघटनकारी ढंग से कोशिका झिल्ली दर्ज करने के लिए मनाया गया। केवल मामूली परमाणु या साइटोप्लास्मिक organelle धुंधला का पता चला था। पहले संकेत के रूप में, एनआरएस intracellularly 12 स्थित होने की उम्मीद कर रहे थे। जम्मू सेमी ∙ 0.07 के बीच NG108-15 अकेले neuronal कोशिकाओं या एयू एनआरएस और पाली (styrenesulfonate) के साथ सुसंस्कृत लिपटे-औ एनआरएस लेजर irradiances करने के लिए उसके बाद खुल गए थे -2 और 370 जम्मू रेंज में संग्राहक लेजर आवृत्ति के साथ, मुख्यमंत्री -2 ∙ 0.5-2 हर्ट्ज की।

    चित्रा 4 प्रतिक्रियाओं के आयाम समय के एक समारोह के रूप में मैप किया गया था कैसे की प्रतिनिधि उदाहरण दिखाता है। उज्ज्वल जोखिम (चित्रा -4 ए - सी) के साथ विविध सीए 2 + प्रतिक्रिया के आयाम और नहीं मनाया गया लगातार लेजर दालों (चित्रा 4C) 13 से चालू होने की। सबसे अधिक संभावना स्पष्टीकरण अधूरा सीए 2 + लोड हो रहा है दो या neuronal कोशिकाओं में एनआर internalization के विभिन्न दक्षता के लिए जिम्मेदार ठहराया intracellular Ca 2 दुकानों के क्षणिक कमी थे। एनआरएस संस्कृतियों में इस्तेमाल नहीं किया गया जबई (नियंत्रण प्रयोगों, चित्रा 4D), 780 एनएम प्रकाश की एक उत्तेजक प्रभाव भी मनाया गया। बहरहाल, यह कम प्रतिदीप्ति आयाम चोटियों और (विश्लेषण किया नमूनों की केवल 16% में पाया) सक्रियण के निचले संभावना का उत्पादन किया। कुल मिलाकर, एन.आर. लेजर प्रेरित सेल सक्रियण की एक 48% संभावना हासिल की थी और कारण 780 एनएम प्रकाश में पृष्ठभूमि की घटनाओं के बावजूद, एन.आर. इलाज कोशिकाओं का जोखिम कम लेजर ऊर्जा और प्रतिक्रिया 13 की ऊंची चोटियों के साथ उच्च उत्तेजना दक्षता का प्रदर्शन किया। वास्तव में, कैल्शियम प्रतिक्रिया 0.33 जम्मू ∙ सेमी -2 एन.आर. इलाज कोशिकाओं में कम से शिखर पर पाया गया था। इस थर्मल निषेध 13 के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था। प्रयोगों के दौरान, blebbing या कोशिका झिल्ली विघटन के किसी अन्य रूप का कोई सबूत नहीं है 19 डब्ल्यू ∙ सेमी की एक अपेक्षाकृत उच्च ऊर्जा घनत्व के साथ सेलुलर photodestruction ने बताया कि की हुआंग एट अल। परिणामों के साथ संगत है, जो पता चला था -2 4 के लिए आवेदन न्यूनतम 27। एनआर इलाज कोशिकाओं में कोई सहज गतिविधि लेजर जोखिम के बिना दर्ज की गई थी।

    चित्र 1
    चित्रा 1: क्षेत्र के एक लेजर बीम के लिए लेजर शक्ति के एक समारोह के रूप में ऑप्टिकल फाइबर प्रयोगात्मक स्थापना (ए) और औसत लेजर irradiances 0.4 मिमी 2 (बी) के बराबर होती है। बीम मानकों हैं (ए): फाइबर (θ), किरण त्रिज्या (R) और ऑप्टिकल फाइबर और नमूना (डी) के बीच की दूरी बाहर निकलने प्रकाश की अधिकतम शंकु के आधे कोण।

    चित्र 2
    चित्रा 2: अकेले (ए) सुसंस्कृत विभेदित NG108-15 neuronal कोशिकाओं का या एयू एनआरएस (बी) के साथ epifluorescence छवियों के उदाहरण और (चित्रा में संकेत दिया) अलग अलग लेजर शक्तियों के साथ विकिरणित। नमूने मैं थेलेजर विकिरण से पहले एक दिन के लिए ncubated। कोशिकाओं तय की और तीन दिनों के लेजर विकिरण के बाद विरोधी β-III ट्यूबिलिन (लाल) और DAPI (नीला) के लिए चिह्नित किया गया। स्केल सलाखों 100 माइक्रोन हैं।

    चित्र तीन
    चित्रा 3: Fluo4-पूर्वाह्न सीए 2 + सूचक के साथ भरी हुई विभेदित NG108-15 neuronal कोशिकाओं का उदाहरण छवि एक 40x तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ एक औंधा confocal खुर्दबीन का उपयोग कर लिया गया था।।

    चित्रा 4
    चित्रा 4: के साथ तीन दिनों के लिए सीरम मुक्त परिस्थितियों में सुसंस्कृत NG108-15 neuronal कोशिकाओं में समय के एक समारोह के रूप में लेजर प्रेरित सीए 2 + विविधताओं के प्रतिनिधि उदाहरण (ए) पाली (styrenesulfonate) -Au एनआरएस, (बी, सी) एयू एनआरएस, और एनआरएस (नियंत्रण नमूना) के बिना (डी)। इन परिणामों के थे100 मिसे (ए, सी, डी) और 50 मिसे (बी) के लेजर दालों के साथ प्राप्त की। और 0.5 हर्ट्ज (डी) - प्रयोगों (धराशायी खड़ी रेखा) के लिए इस्तेमाल आवृत्तियों 1 हर्ट्ज (सी ए) थे। गणना उज्ज्वल जोखिम सेमी -2 (ए), 34.7 जम्मू ∙ जम्मू ∙ 69.4 थे सेमी -2 (बी), 0.37 जम्मू ∙ सेमी -2 (सी) और 138.87 जम्मू ∙ सेमी -2 (डी)। एफ अधिकतम / एफ 0 ionomycin साथ अंशांकन से NG108 -15 neuronal कोशिकाओं में पाया अधिकतम प्रतिदीप्ति वृद्धि हुई है, (अनुमति 13 के साथ reproduced) इंगित करता है।

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    Discussion

    इस प्रस्तुति में उल्लिखित प्रोटोकॉल संस्कृति के लिए, अंतर और ऑप्टिकली बाह्य अवशोषक का उपयोग कर neuronal कोशिकाओं को उत्तेजित वर्णन कैसे। एनआर विशेषताओं (जैसे आयाम, आकार, plasmon अनुनाद तरंगदैर्ध्य और सतह के रसायन शास्त्र) और (जैसे आदि तरंगदैर्ध्य, नाड़ी की लंबाई, पुनरावृत्ति दर, के रूप में) लेजर उत्तेजना मापदंडों विभिन्न प्रयोगात्मक आवश्यकताओं मैच के लिए अलग किया जा सकता है। सेल व्यवहार पर प्रभाव मानक जैविक assays और सामग्री का उपयोग पर नजर रखी जा सकती है। समग्र दृष्टिकोण इन विट्रो में सेल आबादी चमकाना करने के लिए एक सरल, अभी तक शक्तिशाली, जिस तरह से प्रदान करता है और प्राथमिक कोशिकाओं, ऊतकों के नमूनों के लिए और vivo अध्ययन में बढ़ाया जा सकता है।

    एयू एनआरएस जैविक अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए संतुष्ट करने की जरूरत है कि मुख्य आवश्यकताओं स्थिरता (रासायनिक और भौतिक दोनों) और biocompatibility के हैं। उत्तरार्द्ध (कारण एक cationic surfactant की उपस्थिति के लिए, आम विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैAu के सतह पर है ly CTAB)। CTAB विट्रो 28 में और vivo 29 में दोनों cytotoxicity प्रेरित करने के लिए जाना जाता है और यह आमतौर पर एनआर आकार गठन 30 ड्राइव करने के संश्लेषण की प्रक्रिया के दौरान प्रयोग किया जाता है। स्थिरता और biocompatibility अक्सर एयू एन.आर. सतह पर अतिरिक्त कोटिंग्स (जैसे पॉलीथीन ग्लाइकोल, सिलिका) 31 जमा करके सुधार कर रहे हैं। ऊतकीय विश्लेषण अक्सर ऊतक प्रयोगों 7,8,12,15 के दौरान किया जाता है, जबकि biocompatibility के आकलन करने के लिए, विभिन्न assays के लिए इन विट्रो में (जैसे लाइव / मृत, एमटीएस, MTT, आदि) का इस्तेमाल किया जा सकता है।

    Nanomaterials के साथ काम करने को सही ढंग से उनकी दाढ़ एकाग्रता का निर्धारण करने की कठिनाई है, जब एक और चुनौती का सामना करने के लिए। आकार, आकार, और रासायनिक गुणों के संदर्भ में एनपीएस की विशाल विविधता के कणों के केवल कुछ वर्गों के लिए उपयुक्त तकनीक वर्तमान में उपलब्ध बनाता है। उदाहरण के लिए, मानक गतिशील प्रकाश scattविधि ering एनपीएस एक गोलाकार आकृति और बिखराव प्रकाश isotropically 17 है कि मानता है। इसलिए, मापा एकाग्रता और असली के बीच फ़र्क में एयू एनआरएस परिणाम के लिए इस विधि का आवेदन। प्रशासित एकाग्रता ठीक (दवा वितरण अनुप्रयोगों के लिए उदाहरण के लिए) प्रक्रिया की प्रभावकारिता को अधिकतम और nanomaterials 17 की विषाक्तता को कम करने के क्रम में नियंत्रित करने की जरूरत है, जहां nanomedicine के क्षेत्र से संबंधित अगर एनपी एकाग्रता का मुद्दा विशेष रूप से समस्याग्रस्त है। यहां बताया अध्ययनों में, इस्तेमाल किया ऑप्टिकल घनत्व सेल व्यवहार्यता और कण संख्या के मामले में अच्छे परिणाम दे दी है।

    कारण उनके आंतरिक गुण अवशोषण करने के लिए, एयू एनपीएस अक्सर एक लेजर स्रोत के साथ संयोजन में उपयोग किया जाता है। प्रदर्शन के दौरान, अवशोषण और बिखरने एनपीएस की सतह पर होने की संभावना दो मुख्य प्रक्रियाओं हैं। अक्सर लेजर तरंगदैर्ध्य plasmon अनुनाद तरंगदैर्ध्य से मेल खाता है, अवशोषणएनपी सतह पर रोमांचक चालन इलेक्ट्रॉनों, बिखरने से अधिक की तस है। ये अपने संतुलन की स्थिति से दूर ले जाता है और एक गुंजयमान सुसंगत दोलन स्थानीय सतह plasmon अनुनाद (LSPR) कहा जाता है कि बनाता है एक इलेक्ट्रॉन गैस के रूप में। ऊर्जा तो उसके बाद आसपास के वातावरण में 32 में तेजी छितराया हुआ है, जो गर्मी के रूप में एनपी जाली क्रिस्टल, को सौंप दिया है। गर्मी एन.आर. LSPR की उत्तेजना के बाद मनाया मुख्य प्रभाव है, यह लेजर प्रदर्शन के बाद सेल व्यवहार्यता पर नजर रखने की सलाह दी जाती है।

    यह neurite परिणाम और intracellular सीए 2 + मार्ग पर मनाया प्रभाव LSPR की उत्तेजना से उत्पन्न होने वाले क्षणिक हीटिंग की वजह से किया गया है कि धारणा रही है। इस परिकल्पना फेराइट एनपीएस 5 के चुंबकीय प्रदर्शन के बाद तापमान के प्रति संवेदनशील TRPV1 चैनल के सक्रियण के साथ कतार में है। इस प्रक्रिया को भी टिप्पणियों कि thermally संवेदनशील TRPV4 चैनलों पीएलए के साथ संगत हैY अवरक्त तंत्रिका उत्तेजना 33 में एक महत्वपूर्ण भूमिका है। एक आणविक स्तर पर, यह है कि हाल ही TRPV4 ही चैनल 34 के साथ phosphoinositide -4,5 -biphosphate की बातचीत (रंज 2) के बाद thermosensitive है दिखाया गया है। इसलिए, यह एन.आर. उत्तेजना के बाद उत्पन्न होने वाली क्षणिक हीटिंग में तेजी लाने के लिए सेवा और / या TRPV4 चैनलों के उद्घाटन के लिए प्रेरित कर सकता है कि संभव है। इस परिकल्पना सीए 2 + का उपयोग करके भविष्य सीए 2 + प्रयोगों से इसकी पुष्टि की जा सकती है - रंज 2 कमी से अधिक मुक्त मध्यम और / या आणविक नियंत्रित करता है।

    विभिन्न समूहों को भी शारीरिक तापमान सीमा से अधिक छोटे से तापमान ढ़ाल ऐसी न्यूरोनल विकास शंकु 25 मार्गदर्शक या मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं 35 में धाराओं depolarizing के रूप में अन्य प्रतिक्रियाओं, प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रदर्शन किया है। योंग और सहकर्मियों प्राथमिक श्रवण न्यूरॉन्स पंथ में बिजली के संकेत गतिविधि में उल्लेखनीय वृद्धि दर्ज की गईLSPR में एनआरएस के लेजर विकिरण के बाद सिलिका लेपित एयू एनआरएस साथ ured। लेजर-किरणित कणों द्वारा उत्पादित हीटिंग पैच दबाना तकनीक 14 का उपयोग कर मापा गया था। लगातार एक चूहे sciatic तंत्रिका 15 के तंत्रिका बंडल के म्यान के आसपास के क्षेत्र में perfused जब हाल ही में, EOM एट अल। 3.4 × 10 9 एयू एनआरएस के लेजर प्रदर्शन के बाद CNAPs के आयाम में वृद्धि दर्ज की गई।

    इस 780 एनएम 36 में नगण्य होने के लिए जाना जाता है के रूप में प्रयोगों के दौरान मनाया 780 एनएम लेजर डायोड के उत्तेजक प्रभाव, जल अवशोषण द्वारा उत्पन्न गर्मी से जुड़ा हुआ नहीं था। इससे पहले प्रकाशित परिणाम भी विवो 37,38 में neuronal ऊतक पर 780 एनएम प्रकाश की उत्तेजक प्रभाव की सूचना है। इन विट्रो अध्ययन प्रक्रिया 39 में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की भागीदारी का प्रदर्शन किया है। हालांकि, विस्तृत तंत्र है जिसके द्वारा NIR से उत्तेजना जीन transcriptio को प्रभावित करता हैn और अन्य सेलुलर गतिविधियों वर्तमान में अनसुलझे हैं। वर्तमान डेटा माइटोकॉन्ड्रिया में chromophores भीतर फोटोन अवशोषण सहित उत्तेजना में अलग अलग प्रभाव के परस्पर क्रिया से पता चलता है, 37,39-41 (780 एनएम पर ऊर्जा का लगभग 50% साइटोक्रोम ग ओक्सीडेस द्वारा अवशोषित किया जा सकता है) कैल्शियम के लिए झिल्ली पारगम्यता में परिवर्तन कोशिकाओं 37 में भड़काऊ गतिविधि के 37 और निषेध।

    इस पांडुलिपि में प्रस्तुत परिणाम nanoparticle अवशोषक neuronal कोशिकाओं के ऑप्टिकल उत्तेजना में भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए महान वादा पकड़ कि प्रदर्शित करता है। मुख्य लाभ के ऊतकों में (चिकित्सीय विंडो) गहरे पैठ NIR से प्रकाश की क्षमता में निहित है। इन परिणामों से भी nanoparticle अवशोषक बढ़ाने और / या जल अवशोषण पर आधारित अवरक्त तंत्रिका उत्तेजना की प्रक्रिया की जगह ले सकता है दिखाते हैं। तंत्रिका कृत्रिम अंग में भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए, यह अलग सतह functionalizat जांच करने के लिए ब्याज की हो जाएगाकई ऑप्टिकल उत्तेजना अनुप्रयोगों के लिए मुख्य लक्ष्य कर रहे हैं जो न्यूरोनल एक्सोन, के लिए रासायनिक आत्मीयता के साथ आयनों।

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    Acknowledgments

    लेखकों आंशिक रूप से शूटिंग के दौरान उसकी मदद के लिए शेफील्ड और सुश्री Jaimee मायने विश्वविद्यालय में इस शोध की मेजबानी होने के लिए यात्रा के वित्त पोषण के समर्थन के लिए NanoVentures ऑस्ट्रेलिया और प्रो जॉन घास की गांजी स्वीकार करना चाहते हैं।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Au NR Sigma Aldrich 716812
    NG108-15 Sigma Aldrich 8811230
    DMEM Sigma Aldrich D6546
    FCS Life Technologies 10100147
    L-glutamine Sigma Aldrich G7513
    Penicillin/streptomycin Life Technologies 15140122
    Amphotericin B Life Technologies 15290018
    Formaldehyde Sigma Aldrich F8775
    Triton X-100 BDH T8532
    BSA Sigma Aldrich A2058
    Anti-βIII-tubulin Promega G7121
    TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody Sigma Aldrich T5393
    DAPI Invitrogen D1306
    Fluo-4 AM Invitrogen F14201
    DMSO Sigma Aldrich 472301
    Pluronic F-127 Invitrogen P6867
    UV-Vis spectrometer Varian Medical Systems Inc. Cary 50 Bio
    Mini centrifuge Eppendorf Mini Spin
    Sonic bath Unisonics Australia FPX 10D
    Cell culture incubator Kendro Hera Cell 150
    Cell culture centrifuge Hettich Rotofix 32A
    Laser diode Optotech 780 nm single mode fibre - coupled LD
    Optical fiber Thorlabs 780 HP
    Power meter Coherent Laser Check
    ImageJ http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
    Epifluorescent microscope Axon Instruments ImageX-press 5000A
    μ-slide well Ibidi 80826
    Inverted confocal microscope Carl Zeiss Microscopy Ltd. LSM 510 meta-confocal microscope
    Oscilloscope Tektronix TDS210

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    References

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    तंत्रिका विज्ञान अंक 98 सोना nanorods बाहरी अवशोषक तंत्रिका उत्तेजना लेजर उत्तेजना ऑप्टिकल उत्तेजना neuronal कोशिकाओं,
    गोल्ड neuronal कोशिकाओं की ऑप्टिकल उत्तेजना nanorod की सहायता
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    Paviolo, C., McArthur, S. L.,… More

    Paviolo, C., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells. J. Vis. Exp. (98), e52566, doi:10.3791/52566 (2015).

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