Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Gold Nanorod-assistert Optisk Stimulering av nerveceller

Published: April 27, 2015 doi: 10.3791/52566
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biotactical Engineering, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology

Introduction

Nylige studier har vist at den forbigående oppvarming assosiert med absorpsjon av infrarødt lys med vann (bølgelengde> 1400 nm) kan brukes for å indusere aksjonspotensialer i nervevev 1 og intracellulære kalsium transienter i kardiomyocytter 2. Bruken av infrarødt lys har hevet stor interesse for anvendelser i nevrale proteser, på grunn av den potensielle finere romlig oppløsning, mangel på direkte kontakt med vevet, minimering av stimulerings gjenstander, og fjerning av behovet for å genetisk modifisere cellene før stimulering ( som kreves i optogenetics) 1. Til tross for alle disse fordelene, foreslo nylig utviklet termiske modeller som målet vev / celler kan påvirkes av kumulative oppvarming effekter, når flere stimulansesider og / eller høy repetisjon priser er brukt 3,4.

Som svar på disse utfordringene, har forskere anerkjent potensialet for å bruke ytre absorlemmer for nervestimulering for å produsere mer lokalisert oppvarming effekter i vev. Huang et al., Viste dette prinsipp ved hjelp av superparamagnetiske ferritt-nanopartikler til å fjernaktivere de temperaturfølsomme TRPV1 kanaler i HEK 293-celler med en radiofrekvens-magnetfelt 5. Selv om denne teknikken kan muliggjøre dypere penetrasjon (magnetiske felt samhandle relativt svakt med vev), ble reaksjonene bare registrert over perioder av sekunder, i stedet for millisekunders varighet kreves i bionic organene 5. Tilsvarende Farah et al. Demonstrert elektrisk stimulering av rotte kortikale nevroner med sorte mikropartiklene in vitro. De viste celle-nivå presisjon i stimulering ved hjelp pulsvarighetene på rekkefølgen av hundrevis av ps og energier i området μJ, potensielt åpner for raskere repetisjon priser 6.

Bruken av ytre dempere har også blitt anvendt for å induseremorfologiske endringer in vitro. Ciofani et al. Viste en ~ 40% økning i nevronale celleutvekst bruker piezoelektriske bornitrid nanorør opphisset av ultralyd 7. Tilsvarende har endocytose jernoksid nanopartikler i PC12-celler er rapportert å forbedre neurite differensiering på en doseavhengig måte, på grunn av aktivering av celleadhesjonsmolekyler med jernoksyd 8.

Nylig har interessen i ytre dempere å hjelpe nervestimulering også fokusert på bruk av gull nanopartikler (Au NPs). Au NPS har evnen til effektivt å absorbere laserlyset ved plasmonic topp, og for å spre den i det omgivende miljø i form av varme ni. Blant alle de tilgjengelige partikkelformer, beleilig matcher optisk absorpsjon av gull nanorods (Au NRS) det terapeutiske vinduet av biologiske vev (nær infrarød - NIR, bølgelengde mellom 750-1,400 nm) 10. Videre, i den fortsext av nervestimulering, bruk av Au NR'er gir relativt gunstig biokompatibilitet og et stort utvalg av overflatefunksjonalise alternativer 11. Nyere studier har vist at en stimulerende effekt på differensiering kan induseres etter kontinuerlig laser eksponeringer av Au NR'er i NG108-15 nevronale celler 12. Tilsvarende ble det intracellulære kalsium transienter registrert i neuronale celler dyrket med Au NR'er etter laserbestråling modulert med variable frekvenser og pulslengder på 13. Cellemembranen depolarization ble også registrert etter NIR laser belysning av Au NR'er i primærkulturer av spiral ganglion nevroner 14. Den første in vivo søknad med bestrålt Au NR'er har blitt demonstrert nylig. Eom og kollegaer utsatt Au NR'er på sitt plasmonic topp og spilt inn en seks-dobling i amplitude av sammensatte nerve aksjonspotensialer (CNAPs) og en tre-fold nedgang i stimulering terskel i rotte sciatic nervene. Den nodrede respons ble tilskrevet lokale varme effekter som følge av eksitasjon av NR plasmonic topp 15.

I denne artikkelen er det protokoller for å undersøke effekten av laser stimulering i NG108-15 nevronale celler dyrket med Au NR'er spesifisert. Disse metodene gir en enkel, men kraftig, måte å strålebehandling cellepopulasjonene in vitro ved hjelp av standard biologiske teknikker og materialer. Protokollen er basert på en fiber koplet laserdiode (LD) som tillater sikker drift og repeterbare innretting. De Au NR prøvepreparerings og laserbestrålingsmetoder kan videre utvides til forskjellige partikkel former og neuronale cellekulturer, forutsatt at de spesifikke syntese og dyrkningsmetoder er kjent, hhv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Au NR'er Forberedelse

Merk: Au NR'er kan syntetiseres ved en rekke oppskrifter 16, eller kjøpes fra kommersielle leverandører.

  1. Måle den opprinnelige optiske tetthet (OD) av Au NR oppløsningen via UV-vis spektroskopi, ved å registrere absorpsjons- verdier fra 300 nm til 1000 nm med en oppløsning av 0,5-2 nm. Variere volumet av løsningen som skal brukes med den tilgjengelige kyvette.
  2. Evaluere den første NP molar konsentrasjon med en passende teknikk 17 (f.eks UV-Vis-spektroskopi, enkelt partikkel induktivt koplet plasma massespektrometri, transmisjonselektronmikroskopi) eller bruke konsentrasjonsverdier gitt av leverandøren.
  3. Tilbered en 5 ml stamløsning ved å fortynne den opprinnelige Au NR prøven for å oppnå en OD = 1. For best repeterbarhet, holde OD konstant for alle de testede prøver. Flg kommersielle leverandørens protokoll for sammensetningen av fortynnende oppløsningsmiddel. Hvis du er usikkerVed å bruke deionisert vann.
  4. Sentrifuger 1 ml av Au NR løsningen to ganger i 15 min ved 7800 x g for å fjerne eventuelt overskudd av kjemikalier fra oppløsningen. Sentrifugeringssykluser kan variere i styrke og tid (f.eks 20 min på 5600 × g) 18.
  5. Fjern supernatanten og re-suspen NRS i avionisert vann. Som re-suspenderte partikler kan danne aggregater i løsningen, forberede dem daglig for å ha de beste resultatene. Alternativt, lagre i et kjøleskap for ikke lenger enn en uke. Må ikke fryses.
  6. Før bruk i henhold til celledyrkningsbetingelser, sonikere Au NR oppløsningen i 5 minutter og deretter sterilisere med UV-lys i 30 minutter (UV-stråling intensitet som ikke er mindre enn 400 mW ∙ m 2 ved 254 nm).

2. NG108-15 Neuronal cellelinje Kultur og Differensiering

  1. For cellekulturmediet, fremstille 500 ml steril Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) inneholdende 10% (w / v) føtalt kalveserum (FCS), 1% (w / v) L-glutamin, 1%(Vekt / volum) penicillin / streptomycin, og 0,5% (w / v) amfotericin B.
    Note: Kosttilskudd kan bli alikvoteres lagret ved -20 ° C og lagt til media på dagen nødvendig. Cellekulturmedium kan være nedkjølt i en steril tilstand i maksimalt 1 måned.
  2. For celledifferensiering medium, fremstille 50 ml sterilt DMEM inneholdende 1% (w / v) L-glutamin, 1% (vekt / volum) penicillin / streptomycin, og 0,5% (w / v) amfotericin B.
  3. Vokser NG108-15 nevronale celler i 10 ml cellekulturmedium i T75 flasker laget av polystyren i en inkubator med fuktig atmosfære (5% CO2 ved 37 ° C). Normalt frø 1,5-2 x 10 5 celler i hver kolbe å være klar i 3-4 dager. Endre celledyrkingsmedium hver dag.
    Merk: For å hindre genetiske fonner eller variasjon, ikke bruk celler eldre enn passasje 21 for eksperimenter.
  4. Når 70-80% konfluent i kultur, endre medium med varm fersk cellekulturmedium. Mekanisk å løsne cellene ved forsiktig Knocking bunnen av konfluent kolbe. Ikke bruk trypsin.
  5. Sentrifuger cellesuspensjonen i 5 min ved 600 x g og gjensuspen cellepelleten i 2 ml varm celledifferensiering medium.
  6. Seed 2 x 10 4 celler / cm2 i en vevskultur polystyren 96-brønners plate med 200 ul av celledifferensiering medium. Inkuber eksperimentet i 1 dag ved 5% CO 2/37 ° C.
  7. Legg mellom 3,2 × 10 9 -4,2 × 1 0 10 partikler / ml Au NR løsning på dag 2 og ruge det for ytterligere 24 timer. Ikke legg partiklene for kontroll eksperimenter.
    Merk: Som et alternativ kontroll, kan Au NPs med et godt differensiert peak absorpsjonsbølgelengde brukes for sammenligningsformål 14. For en mer konsistent celle atferd, holde celletettheten konstant og ikke endrer vel overflaten før celle seeding.

3. Neurittutvekst Enhancement

  1. Parlaseren med en enkeltmodus optisk fiber (numerisk apertur = 0,13) og avslutte den med en fiberkontakt (FC kontakter er praktisk og lett tilgjengelige). Måle utgangs laser makt med et standard strømmåleren. For å oppnå de mest effektive resultater, møter toppbølgelengden for laseren til plasmonresonans toppen av NRS.
  2. På dag tre etter NR inkubasjon, fikse FC kontakten til brønnen. Strålebehandling prøver og kontroller ved RT i 1 min i kontinuerlig bølge, for forskjellige laser krefter. Tillate kulturen å forløpe i ytterligere 3 dager ved 5% CO 2/37 ° C. Gjenta laserbestråling i minst tre uavhengige målinger.
    Merk: Ulike bestrålingstider og puls frekvenser kan velges, avhengig av programmet.
  3. Karakterisere laser i form av strålediameter og laser irradians (W ∙ cm -2).
    1. For en standard single-modus fiber, bruker NA = n ∙ synd θ,hvor n er brytningsindeksen for mediet i bruk og θ er den halve toppvinkel for konusen av lys som kommer ut av fiberen (se figur 1A). Fra trigonometri, r = tan θ ∙ d, hvor r er radius strålen og d er avstanden mellom fiberen og prøven. FC pluggen passer til diameteren av brønnen, og derfor belyse prøven i en avstand d = 2,70 ± 0,20 mm. Lys kommer ut av fiber i vann (n = 1,33), noe som gir r = tan (sin-1 (NA / n)) ∙ d.
    2. Ved hjelp av den sistnevnte ligning, beregne laserstrålen radius, det tilsvarende stråleområdet og den gjennomsnittlige laserstrålingen (lasereffekt dividert med stråleområdet) på målet (se eksempel grafen på figur 1B). Disse verdier representerer den gjennomsnittlige irradians over belyste området.
    3. Vurdere feil for målingene med den generelle teorien om feilspredning.
      Merk: Avstanden between FC kontakten og prøven kan måles ved fotografier av den eksperimentelle ordningen og etterbehandling av bildet ved hjelp av egnet programvare (f.eks ImageJ).
  4. På dag 5, fjerne celledifferensiering medium fra eksperimentene og rette prøvene med 3,7% (v / v) formaldehyd-oppløsning i 10 minutter, deretter permeabilisere cellene med 0,1% (v / v) Triton X-100 i 20 min.
  5. Tilsett 3% (w / v) bovint serumalbumin (BSA) til prøvene i 60 minutter for å blokkere den ureagerte proteinbindingsseter. Etiketten prøvene for anti-SIII-tubulin over natten (5 ug / ml i PBS supplert med 1% BSA) ved 4 ° C.
  6. Cellene inkuberes i 90 minutter i mørket med et passende sekundært antistoff (f.eks TRITC-konjugert anti-muse-IgG-antistoff) med en konsentrasjon på 0,4 til 2 pg / ml i 1% BSA i PBS. Merke cellekjerner med DAPI (0,1 ug / ml i avionisert vann) i 10 minutter.
    Merk: antistoffkonjugering og konsentrasjon might variere ifølge selskapet protokollen. Vaskeprøver med PBS to ganger i 5 minutter etter hver fargingstrinn.
    Figur 1
  7. Bildeeksempler av epifluorescence eller konfokalmikroskopi bruker minst 20 × objektiv. Velge mikroskopet filtrerer tilsvarende til det sekundære antistoff. Velge en DAPI filter (λ EX = 358 nm; λ EM = 488 nm) for å visualisere cellekjerner.
  8. Analysere bildene ved å vurdere: i) den maksimale neurite lengde (rekord lengden fra spissen av neurite til begynnelsen av cellen kroppen), ii) antall neuritter per nevroncelledød (oppsummere alle de neuritter per celle) og iii) prosentandelen av celler med neuritter (dividere det totale antall av celler som uttrykker SIII-tubulin med det totale antall celler med en positivt farget kjernen) 19.

4. Laser-indusert Intracellulær Ca 2+ Imaging

Fremstille en 20% (w / v) stamløsning av Pluronic F-127 ved å oppløse 2 g av oppløst stoff i 10 ml vannfritt dimetylsulfoksyd (DMSO). Varm oppløsning av Pluronic F-127 ved 40 ° C i ca 20 min for å øke løseligheten. Forberede det på forhånd hvis det er lagret på RT.
  • På dag 3 etter NR inkubasjon fremstille en balansert saltoppløsning (BSS; 135 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1,5 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 5,6 mM glukose og 10 mM HEPES, pH 7,4) og supplert med 5 uM Fluo-4 AM i DMSO og 0,1% (w / v) Pluronic F-127-løsning.
    Merk: BSS-løsning kan fremstilles på forhånd og avkjølt i et maksimum på 1 måned. Tilsett kosttilskudd (Fluo-4 AM og Pluronic F-127) på dagen for forsøket.
  • Fjerne celledifferensiering medium og erstatte den med den supplert BSS løsning. For å oppnå de beste resultatene med en invertert konfokal mikroskop, inkuberes cellene i en mikro-lysbilde godt.
  • Last NG108-15 celler med Fluo-4 AMi 30 minutter i mørke ved 5% CO 2/37 ° C. Etter inkubasjonstiden, vaskes to ganger med BSS prøver for å fjerne eventuelt ekstracellulære ubelastet fluoroforen.
  • Par laser med en enkeltmodus optisk fiber, og spalte spissen ved hjelp av standard teknikker. Observere den resulterende spissen under et optisk mikroskop, for å sikre en høy kvalitet på overflaten (dvs. spissen skal være vinkelrett på fiberaksen og flat ved mikros inspeksjon).
    1. Måle utgangs laser makt med et standard strømmåleren. Sett i lys leverings fiber i en optisk fiberholder og feste den til en micropositioner. Referere til Brown et al. 20 for mer informasjon om optisk fiber forberedelse og posisjonering.
      Forsiktig: Følg de generelle reglene for laser sikkerhet under målingen av laser kraft (f.eks ikke se direkte inn i laserstrålen, slitasje laser vernebriller under håndtering, hindre bortkommen eksponering lys til andre lab-brukere) <./ Li>
  • Koble et oscilloskop til den bærbare laser for å overvåke den optiske modulering. Bruke et binært signal med variable frekvenser (0,5-2 Hz) og pulslengder (20-100 ms). Koble laseren bruker modulasjonssignalet som transistor-transistor logikk (TTL) inngang for mikroskop, etter oppsettet som vises i Paviolo et al. 13.
    1. Plasser celler under et invertert konfokalt mikroskop og plassere lyset leverings fiberen 250 ± 50 um bort fra målcellen i overførings illuminasjonsmodusen. På denne avstand ved å bruke ligningene som er presentert i 3.3.1 for å beregne stråleradius på målet.
  • Bruk en argon-ion laser (488 nm) for å opphisse internalisert Fluo-4 AM fargestoff (λ EX = 494 nm; λ EM = 516 nm) og synkronisert LD for eksitasjon av endocytose NR'er. Utfør avbildning ved RT av prøver og kontroller som bruker minst 40 × objektiv ved å samle tidsserie skannermed 256 × 256 piksler / ramme oppløsning i buss-modus med en frekvens på minst 4 Hz. Utfør et opptak uten LD eksitasjon å identifisere noen argon-ion laser forstyrrelser (baseline støy).
  • Fjerne bakgrunnen fra data ved hjelp av adaptiv vektet straffet minste kvadraters algoritmer 21. Plotte de induserte Ca2 + variasjoner som en funksjon av tid. Analyser forbigående topper i fluorescens intensitet ved hjelp av bilde post-prosessering programvare av terskelverdier på et nivå tre ganger standardavviket for baseline støy (3σ).

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Ved å bruke protokoller 1, 2 og 3 som er beskrevet her, var en stimulerende effekt på differensiering observert i NG108-15 nevronale celler dyrket med Au NPS (Au NRs, poly (styrensulfonat) -belagt Au NR'er og silika-belagt Au NRS) etter laser eksponeringer mellom 1,25 og 7,5 W · cm -2. Konfokale bilder av rhodamineB-merket Au NR'er viste at partiklene ble internalisert fra dag 1 av 12 inkubering. Lokaliseringen ble hovedsakelig observert i cellens cytoplasma, noe som indikerer at den foretrukne mekanisme for opptak var via cellelegemet membranen 12. De viktigste morfologiske endringer som oppdages etter indusere differensiering i NG108-15 nervecellene var arrestasjonen av spredning, uttrykk for SIII-tubulin protein og utvekst av neuritter, som ble analysert i form av maksimal lengde og nummer 22.

    Prøvene dyrket med NRs viste en neurite lengde økning på laser irradikrings nivåer målt her (mellom 1,25 og 7,5 W · cm -2). Kontrollprøver (celler dyrket uten NPS og bestrålt med den samme lasereffekt) viste ingen signifikant endring i lengde. Ved hjelp av en bestrålingsdose på 7,5 W · cm -2, den endelige neurite lengde NG108-15 dyrket med Au NR'er var omtrent 36% høyere (p <0,01) enn den ikke-laser-bestrålte prøver. Denne oppførselen er ikke spesifikt knyttet til overflatekjemi av NRS. Disse verdiene var nesten 20% større enn neuritter utviklet av NG108 -15 alene og utsatt for samme verdi av laser eksponering (p <0,05) 12. Disse resultatene er i tråd med tidligere publiserte studier på PC12 nevronale celler dyrket med piezoelektriske nanorør og bestrålte med ultralyd stråling 7.

    Kontrolleksperimenter uten Au NR'er viste også noen stimulerende effekt av 780 nm lys i form av prosentandel av nevroner med neuritter og antall neurites per neuron. Dette stimulering var mer effektiv ved lavere laser krefter (1,25 W ∙ cm -2) med en påfølgende nedgang på høyeste laser energi (7,5 W ∙ cm -2) 12. En moderat stimulering forårsaket av NPS uten noen laserbestråling (poly (styrensulfonat) -belagt og silika-belagt kun) ble detektert i prosentandelen av neuroner med neuritter 12. Disse resultatene er i samsvar med nylig publiserte observasjoner som gull nanopartikler kan øke neuronal aktivitet in vitro 23,24. Figur 2 viser et eksempel på epifluorescence bilder av differensierte NG108-15 nevronale celler dyrket alene (Figur 2A) eller med Au NRS (figur 2B ) og bestrålt med forskjellige laser krefter (indikert i figuren).

    Potensialet for foto-generert intracellulær Ca 2+ utgivelsen ble vurdert ved hjelp av pulserende NIR lys i samsvar med protokoll 1, 2, og4. Kalsiumioner spille en viktig rolle i ulike cellulære aktiviteter, for eksempel mitose, muskel sammentrekning og neurite forlengelse 25,26. I respons på en stimulus, Ca 2 + øker, oscillerer og minsker, noe som fører til aktivering, modulering eller avslutning av en spesifikk cellefunksjon. Nylig har Ca 2 + transienter også blitt observert som en konsekvens av IR-lasereksponering i kardiomyocytter. I dette arbeidet, den Ca 2+ svar fremkalt etter IR eksponering utstilt lavere amplituder og raskere utvinning ganger enn de spontane Ca 2 + transienter 2. Figur 3 viser et eksempel på NG108-15 nevronale celler lastet med Fluo-4 AM og bilde av med en konfokal mikroskop. Fluo-4 AM ble observert å gå inn i cellemembranen på en ikke-nedbrytende måte, noe som resulterer i en stort sett jevn fordeling av indikator på tvers av cellens cytoplasma. Bare mindre kjernekraft eller cytoplasmic organ farging ble oppdaget. Som tidligere indikertBle NR'er forventet å være lokalisert intracellulært 12. NG108-15 nevronale celler alene eller kultur med Au NR'er og poly (styrensulfonat) belagte-Au NR'er ble utsatt deretter til laser irradianser mellom 0,07 J ∙ cm -2 og 370 J ∙ cm -2, med laserfrekvensen modulert i området av 0,5-2 Hz.

    Figur 4 viser representative eksempler på hvordan amplituden av responsene ble kartlagt som en funksjon av tiden. Amplituden av Ca 2+ respons varierte med strålingseksponering (figur 4A - C) og ble observert til ikke å være gjennomgående utløses av laserpulser (Figur 4c) 13. De mest sannsynlige forklaringer var det forbigående uttømming av intracellulære Ca 2 + butikker tilskrives ufullstendig Ca 2+ lasting to eller annen effektivitet av NR internalisering i nervecellene. Når NR'er ikke ble brukt i culture (kontrollforsøk, figur 4D), ble en stimulerende effekt på 780 nm lys også observert. Men dette produserte lavere fluorescens amplitude topper og lavere sannsynlighet for aktivering (detektert i bare 16% av de analyserte prøver). Totalt sett en 48% sannsynlighet for NR laser-indusert celleaktivering ble oppnådd og til tross for bakgrunns hendelser på grunn av den 780 nm lys, eksponering av NR-behandlede celler viste høyere stimulering effektivitet med lavere laser energi og høyere toppene i respons 13. Faktisk var det kalsium respons funnet å topp på 0,33 J ∙ cm -2 i NR-behandlede celler. Dette ble tilskrevet termisk inhibering 13. Under forsøkene ble det ingen tegn på blebbing eller noen annen form for cellemembran avbrudd oppdaget, noe som er i overensstemmelse med resultatene av Huang et al., Som rapportert cellulær fotodesktruksjon med en forholdsvis høy strømtetthet på 19 W ∙ cm -2 anvendt for fire min 2Ingen spontan aktivitet i NR-behandlede celler ble registrert uten laser eksponering 7..

    Figur 1
    Figur 1: Optisk fiber eksperimentelle oppsettet (A) og gjennomsnittslaser irradianser som en funksjon av lasereffekten for en laserstråle på området er lik til 0,4 mm 2 (B). Bjelke parametre er (a): den halve vinkel av maksimalt lyskjegle som kommer ut av fiberen (θ), bommen radius (r), og avstanden mellom den optiske fiberen og prøven (d).

    Figur 2
    Figur 2: Eksempler på epifluorescence bilder av differensierte NG108-15 nevronale celler dyrket alene (A) eller med Au NRS (B) og bestrålt med forskjellige laser krefter (indikert i figuren). Prøvene var jegncubated for én dag før laserbestråling. Celler ble fiksert og merket for anti-β-III-tubulin (rød) og DAPI (blå) tre dager etter laserbestråling. Skala barer er 100 mikrometer.

    Figur 3
    Figur 3: Eksempel på differensierte NG108-15 nevronale celler lastet med Fluo4-AM Ca 2+ indikator Bildet ble tatt ved hjelp av en invertert konfokal mikroskop med en 40X olje-nedsenking målsetting..

    Figur 4
    Figur 4: Representative eksempler på laser-indusert Ca 2+ variasjoner som funksjon av tid i NG108-15 nevronale celler dyrket i serumfrie forhold i tre dager med (A) poly (styrensulfonat) -Au NRS (B, C) Au NRs, og (D) uten NRS (kontrollprøve). Disse resultatene varoppnådd med laserpulser på 100 msek (A, C, D) og 50 msek (B). De frekvenser som benyttes for forsøkene (stiplede vertikale linjer) var 1 Hz (A - C) og 0,5 Hz (D). De beregnede strålende eksponeringer var 69,4 J ∙ cm -2 (A), ∙ 34,7 J cm -2 (B), 0,37 J ∙ cm -2 (C) og 138,87 J ∙ cm -2 (D). F max / F 0 indikerer maksimal fluorescens økning oppdaget i NG108 -15 nerveceller, fra kalibrering med ionomycin (gjengitt med tillatelse 13).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Protokollene er skissert i denne presentasjonen beskrive hvordan kultur, differensiere og optisk stimulere nevrale celler ved hjelp av ytre dempere. NR karakteristika (f.eks dimensjoner, form, plasmonresonans bølgelengde og overflatekjemi) og laserstimuleringsparametere (slik som bølgelengden, pulslengde, repetisjonsfrekvens, etc.) kan varieres for å passe forskjellige eksperimentelle behov. Virkningene på celle oppførsel kan overvåkes ved hjelp av standard biologiske analyser og materialer. Samlet tilnærmingen gir en enkel, men kraftig, måte å strålebehandling celle populasjoner in vitro og kan utvides til primærceller, vevsprøver og in vivo studier.

    De viktigste krav som Au NR'er må tilfredsstille for å bli brukt for biologiske anvendelser er stabilitet (både kjemisk og fysisk), og biokompatibilitet. Sistnevnte er særlig kritisk, på grunn av tilstedeværelsen av et kationisk overflateaktivt middel (vanligly CTAB) på overflaten av Au. CTAB er kjent for å indusere cytotoksisitet både in vitro og in vivo 28 29, og det er ofte brukt under synteseprosessen for å drive NR-formen formasjonen 30.. Stabilitet og bioforenelighet blir ofte forbedret ved å avsette ytterligere belegg på Au NR overflaten (for eksempel polyetylenglykol, silika) 31. For å vurdere biokompatibilitet, kan forskjellige analyser brukes in vitro (for eksempel levende / døde, MTS, MTT, etc.) mens histologisk analyse blir ofte utført i løpet av vev eksperimenter 7,8,12,15.

    En annen utfordring til ansikt når du arbeider med nanomaterialer er vanskeligheten med riktig bestemme deres molar konsentrasjon. Det enorme utvalget av NPs når det gjelder form, størrelse og kjemiske egenskaper gjør teknikker for tiden tilgjengelig som passer for visse klasser av partikler. For eksempel, standard dynamisk lys scattering metoden forutsetter at NPs har en sfærisk form og scatter lys, isotrope 17. Derfor, bruk av denne metoden til Au NRS resultater i avvik mellom den målte konsentrasjonen og den ekte. Spørsmålet om NP-konsentrasjonen er spesielt problematisk dersom relatert til nano feltet, hvor konsentrasjonen administreres må være nøyaktig kontrollert for å maksimere effektiviteten av prosessen (for eksempel for levering av legemidler applikasjoner) og minimalisere toksisitet av nano 17. I de studiene som presenteres her, optisk tetthet brukes ga gode resultater i form av celle levedyktighet og partikkeltall.

    På grunn av deres iboende dempende egenskaper, er Au NPS ofte brukt i kombinasjon med en laserkilde. Under eksponering, absorpsjon og spredning er de to hovedprosesser som kan oppstå på overflaten av NPS. Dersom laserbølgelengden tilsvarer plasmonresonans bølgelengde, absorpsjon ofteseirer over spredning, spennende conduction elektroner på NP overflaten. Disse danner en elektrongass som beveger seg bort fra sin likevektsposisjon og skaper en resonans koherent svingning kalt den lokaliserte overflate-plasmonresonans (LSPR). Energien blir deretter overført til NP krystallgitteret som varme, som deretter spres raskt inn i det omkringliggende miljøet 32. Siden varme er den viktigste effekten observert etter eksitasjon av NR LSPR, er det tilrådelig å overvåke cellenes levedyktighet etter lasereksponering.

    Det har blitt antatt at de observerte effekter på neurittutvekst og den intracellulære Ca2 + pathway var på grunn av den forbigående oppvarming som følge av magnetisering av LSPR. Denne hypotesen er i samsvar med aktiveringen av den temperaturfølsomme TRPV1 kanal etter eksponering av magnetisk ferritt NPS 5. Denne prosessen er også i overensstemmelse med observasjonene som termisk følsomme TRPV4 kanaler play en viktig rolle i infrarødt nervestimulering 33. På et molekylært nivå, har det nylig blitt vist at TRPV4 er thermo bare etter samspillet av phosphoinositide -4,5 -biphosphate (PIP 2) med kanal 34. Derfor er det mulig at den forbigående oppvarming som oppstår etter NR eksitasjon kunne tjene til å akselerere og / eller fremkalle en åpning av TRPV4 kanaler. Denne hypotesen kan bekreftes ved fremtidige Ca 2+ eksperimenter ved hjelp av Ca 2+ - fritt medium og / eller molekylære kontroller over PIP to uttømming.

    Forskjellige grupper har også vist at små temperaturgradienter over fysiologiske temperaturområdet kan anvendes for å indusere andre responser, slik som neuronal vekst kjegle føring 25 eller depolariserende strømmer i humane embryoniske nyreceller 35. Yong og kollegaer registrert en betydelig økning i elektrisk signal aktivitet i grunnskolen auditiv nevroner kultfigurert med silikon-belagt Au NR'er etter laser bestråling av NRS på LSPR. Den varme som produseres av laser-bestrålte partiklene ble målt ved hjelp av patch-clamp-teknikker 14. Mer nylig, Eom et al., Registrert en økning i amplituden til CNAPs etter lasereksponering på 3,4 x 10 9 Au NR'er ved kontinuerlig perfusjon i nærheten av kappen av nervebunt fra et rottehoftenerve 15.

    Den stimulerende effekt av 780 nm laser diode observert under forsøkene ble ikke bundet til varme som genereres av vannopptak, slik dette er kjent for å være ubetydelig ved 780 nm 36. Tidligere publiserte resultater har også rapportert stimulerende effekt av 780 nm lys på nervevev in vivo 37,38. In vitro studier har vist involvering av reaktive oksygenforbindelser i prosessen 39. Men de detaljerte mekanismer som NIR stimulering påvirker genet transcription og andre cellulære aktiviteter er foreløpig uavklart. Nåværende data antyder samspillet mellom forskjellige effekter i stimulering, inkludert fotonabsorpsjon innenfor kromoforer i mitokondriene (nesten 50% av energien ved 780 nm kan bli absorbert av cytokrom-c-oksydase) 37,39-41, endringer i membranpermeabilitet til kalsium 37 og inhibering av inflammatorisk aktivitet i cellene 37.

    Resultatene som presenteres i dette manuskriptet viser at nanopartikkel dempere holde store løftet for fremtidige anvendelser innen optisk stimulering av nerveceller. Den viktigste fordel ligger i muligheten av NIR lys til å trenge dypt inn i vev (terapeutisk). Disse resultater viser også at nanopartikkel absorbenter kan forsterke og / eller erstatte prosessen med infrarød nervestimulering basert på vannabsorpsjon. For fremtidige anvendelser i nevrale proteser, vil det være av interesse å undersøke forskjellige overflate functionalizationer med kjemisk affinitet for nevronale aksoner, som er de viktigste målene for mange optiske stimuleringsprogrammer.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    Forfatterne ønsker å takke NanoVentures Australia for reise finansiering støtte og professor John Haycock for å ha delvis vert denne forskningen ved Universitetet i Sheffield og Ms Jaimee Mayne for hennes hjelp under filmingen.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Au NR Sigma Aldrich 716812
    NG108-15 Sigma Aldrich 8811230
    DMEM Sigma Aldrich D6546
    FCS Life Technologies 10100147
    L-glutamine Sigma Aldrich G7513
    Penicillin/streptomycin Life Technologies 15140122
    Amphotericin B Life Technologies 15290018
    Formaldehyde Sigma Aldrich F8775
    Triton X-100 BDH T8532
    BSA Sigma Aldrich A2058
    Anti-βIII-tubulin Promega G7121
    TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody Sigma Aldrich T5393
    DAPI Invitrogen D1306
    Fluo-4 AM Invitrogen F14201
    DMSO Sigma Aldrich 472301
    Pluronic F-127 Invitrogen P6867
    UV-Vis spectrometer Varian Medical Systems Inc. Cary 50 Bio
    Mini centrifuge Eppendorf Mini Spin
    Sonic bath Unisonics Australia FPX 10D
    Cell culture incubator Kendro Hera Cell 150
    Cell culture centrifuge Hettich Rotofix 32A
    Laser diode Optotech 780 nm single mode fibre - coupled LD
    Optical fiber Thorlabs 780 HP
    Power meter Coherent Laser Check
    ImageJ http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
    Epifluorescent microscope Axon Instruments ImageX-press 5000A
    μ-slide well Ibidi 80826
    Inverted confocal microscope Carl Zeiss Microscopy Ltd. LSM 510 meta-confocal microscope
    Oscilloscope Tektronix TDS210

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser. Photonics Rev. 5 (1), 68-80 (2011).
    2. Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. J. Physiol. 589 (6), 1295-1306 (2011).
    3. Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 17 (7), 075002-075002 (2012).
    4. Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G., Stoddart, P. R. Modeling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18 (3), 035004 (2013).
    5. Huang, H., Delikanli, S., Zeng, H., Ferkey, D. M., Pralle, A. Remote control of ion channels and neurons through magnetic-field heating of nanoparticles. Nat. Nanotechnol. 5 (8), 602-606 (2010).
    6. Farah, N., et al. Holographically patterned activation using photo-absorber induced neural-thermal stimulation. J. Neural. Eng. 10 (5), (2013).
    7. Ciofani, G., et al. Enhancement of neurite outgrowth in neuronal-like cells following boron nitride nanotube-mediated stimulation. ACS Nano. 4 (10), 6267-6277 (2010).
    8. Kim, J. A., et al. Enhancement of neurite outgrowth in PC12 cells by iron oxide nanoparticles. Biomaterials. 32 (11), 2871-2877 (2011).
    9. Myroshnychenko, V., et al. Modelling the optical response of gold nanoparticles. Chem. Soc. Rev. 37 (9), 1792-1805 (2008).
    10. Choi, W. I., Sahu, A., Kim, Y. H., Tae, G. Photothermal cancer therapy and imaging based on gold nanorods. Ann. Biomed. Eng. 40 (2), 534-546 (2011).
    11. Zhan, Q., Qian, J., Li, X., He, S. A study of mesoporous silica-encapsulated gold nanorods as enhanced light scattering probes for cancer cell imaging. Nanotechnology. 21 (5), 055704 (2010).
    12. Paviolo, C., et al. Laser exposure of gold nanorods can increase neuronal cell outgrowth. Biotechnol. Bioeng. 110 (8), 2277-2291 (2013).
    13. Paviolo, C., Haycock, J. W., Cadusch, P. J., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. Laser exposure of gold nanorods can induce intracellular calcium transients. J. Biophotonics. 7 (10), 761-765 (2014).
    14. Yong, J., et al. Gold-nanorod-assisted near-infrared stimulation of primary auditory neurons. Adv. Healthcare Mater. , (2014).
    15. Eom, K., et al. Enhanced infrared neural stimulation using localized surface plasmon resonance of gold nanorods. Small. , (2014).
    16. Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marzán, L. M., Mulvaney, P. Gold nanorods: Synthesis, characterization and applications. Coordination Chemistry Reviews. (17-18), 1870-1901 (2005).
    17. Shang, J., Gao, X. Nanoparticle counting: towards accurate determination of the molar concentration. Chem. Soc. Rev. 43 (21), 7267-7278 (2014).
    18. Sharma, V., Park, K., Srinivasarao, M. Shape separation of gold nanorods using centrifugation. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (13), 4981-4985 (2009).
    19. Kaewkhaw, R., Scutt, A. M., Haycock, J. W. Anatomical site influences the differentiation of adipose-derived stem cells for schwann-cell phenotype and function. Glia. 59 (5), 734-749 (2011).
    20. Brown, W. G. A., Needham, K., Nayagam, B. A., Stoddart, P. R. Whole cell patch clamp for investigating the mechanisms of infrared neural stimulation. JoVE. (77), (2013).
    21. Cadusch, P. J., Hlaing, M. M., Wade, S. A., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. Improved methods for fluorescence background subtraction from Raman spectra. J. Raman Spectrosc. 44 (11), 1587-1595 (2013).
    22. Daud, M. F. B., Pawar, K. C., Claeyssens, F., Ryan, A. J., Haycock, J. W. An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies. Biomaterials. 33 (25), 5901-5913 (2012).
    23. Jung, S., et al. Intracellular gold nanoparticles increase neuronal excitability and aggravate seizure activity in the mouse brain. PLoS ONE. 9 (3), e91360 (2014).
    24. Salinas, K., Kereselidze, Z., DeLuna, F., Peralta, X., Santamaria, F. Transient extracellular application of gold nanostars increases hippocampal neuronal activity. J. Nanobiotechnology. 12 (1), 31 (2014).
    25. Ebbesen, C. L., Bruus, H. Analysis of laser-induced heating in optical neuronal guidance. J. Neurosci. Meth. 209 (1), 168-177 (2012).
    26. Iwanaga, S., et al. Location-dependent photogeneration of calcium waves in HeLa cells. Cell Biochem. Biophys. 45 (2), 167-176 (2006).
    27. Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Determination of the minimum temperature required for selective photothermal destruction of cancer cells with the use of immunotargeted gold nanoparticles. Photochem. Photobiol. 82 (2), 412-417 (2006).
    28. Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 1 (3), 325-327 (2005).
    29. Isomaa, B., Reuter, J., Djupsund, B. M. The subacute and chronic toxicity of cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), a cationic surfactant, in the rat. Arch. Toxicol. 35 (2), 91-96 (1976).
    30. Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marzán, L., Mulvaney, P. Gold nanorods: synthesis, characterization and applications. Coord. Chem. Rev. 249 (17-18), 1870-1901 (2005).
    31. Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chem. Soc. Rev. 41 (7), 2740-2779 (2012).
    32. Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold nanoparticles. Lasers Med. Sci. 23 (3), 217-228 (2008).
    33. Albert, E. S., et al. TRPV4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. J. Neurophysiol. 107 (12), 3227-3234 (2012).
    34. Garcia-Elias, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate-dependent rearrangement of TRPV4 cytosolic tails enables channel activation by physiological stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9553-9558 (2013).
    35. Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nat. Commun. 3 (736), (2012).
    36. Roggan, A., Friebel, M., Dörschel, K., Hahn, A., Müller, G. Optical properties of circulating human blood in the wavelength range 400-2500 nm. J. Biomed. Opt. 4 (1), 36-46 (1999).
    37. Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers Surg. Med. 36 (3), 171-185 (2005).
    38. Wu, X., et al. 810 nm wavelength light: an effective therapy for transected or contused rat spinal cord. Lasers Surg. Med. 41 (1), 36-41 (2009).
    39. Grossman, N., Schneid, N., Reuveni, H., Halevy, S., Lubart, R. 780 nm low power diode laser irradiation stimulates proliferation of keratinocyte cultures: involvement of reactive oxygen species. Lasers Surg. Med. 22 (4), 212-218 (1998).
    40. Wong-Riley, M. T. T., et al. Photobiomodulation directly benefits primary neurons functionally inactivated by toxins - Role of cytochrome c oxidase. J. Biol. Chem. 280 (6), 4761-4771 (2005).
    41. Beauvoit, B., Kitai, T., Chance, B. Contribution of the mitochondrial compartment to the optical properties pf the rat liver: a theoretical and practical approach. Biophys. J. 67 (6), 2501-2510 (1994).

    Tags

    Nevrovitenskap gullnanostaver ekstern absorber nervestimulering laser eksitasjon optisk stimulering nerveceller,
    Gold Nanorod-assistert Optisk Stimulering av nerveceller
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Paviolo, C., McArthur, S. L.,… More

    Paviolo, C., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells. J. Vis. Exp. (98), e52566, doi:10.3791/52566 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter