Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Ouro nanorod assistida estimulação óptica de Neuronal Cells

Published: April 27, 2015 doi: 10.3791/52566

Introduction

Estudos recentes têm demonstrado que o aquecimento transitória associada com a absorção de luz infravermelha por água (comprimento de onda> 1400 nm) pode ser utilizado para induzir potenciais de acção em tecidos nervosos 1 e transientes de cálcio intracelular em cardiomiócitos 2. A utilização de luz infravermelha tem suscitado grande interesse para aplicações em próteses neurais, devido ao potencial de resolução espacial mais fina, a falta de um contacto directo com o tecido, a minimização de artefactos de estimulação, e remoção da necessidade de modificar geneticamente as células antes da estimulação ( conforme exigido no optogenética) 1. Apesar de todas estas vantagens, os modelos térmicos desenvolvidos recentemente sugerido que os tecidos / células-alvo pode ser afectada por efeitos cumulativos de aquecimento, quando vários sítios de estímulo e / ou elevadas taxas de repetição são utilizados 3,4.

Em resposta a estes desafios, os pesquisadores têm reconhecido o potencial de usar unidade de absorvância extrínsecabros para a estimulação do nervo para produzir efeitos de aquecimento mais localizadas no tecido. Huang et al. Demonstrou esse princípio usando nanopartículas de ferrita superparamagnéticos para ativar remotamente os canais TRPV1 sensíveis à temperatura em células HEK 293 com um campo magnético 5 de rádio-freqüência. Embora esta técnica pode permitir a penetração mais profunda (campos magnéticos relativamente interagem fracamente com o tecido), apenas as respostas foram registadas ao longo de períodos de segundos, em vez de as durações milissegundo necessários em dispositivos biônicos 5. Da mesma forma, Farah et al. Estimulação elétrica demonstrada de neurônios corticais de ratos com micro-partículas negras em vitro. Eles mostraram precisão em nível celular em estimulação usando durações de pulso na ordem de centenas de ms e energias na faixa de μJ, potencialmente permitindo que as taxas de repetência mais rápidos 6.

A utilização de absorventes extrínsecos também foi aplicado para induziralterações morfológicas in vitro. Ciofani et al. Mostrou um aumento de ~ 40% no crescimento de células neuronais usando nanotubos de nitreto de boro piezoelétricos excitados por ultra-som 7. Da mesma forma, nanopartículas de óxido de ferro endocitose nas células PC12 têm sido relatados para aumentar a diferenciação de neurites de uma forma dependente da dose, devido à activação de moléculas de adesão celular, com o óxido de ferro 8.

Recentemente, o interesse em absorvedores extrínsecos para ajudar a estimulação neural também centrou-se na utilização de nanopartículas de ouro (Au NPS). Au NPs têm a capacidade de absorver a luz laser de forma eficiente no pico plasmónico e dissipar para o ambiente circundante em forma de calor 9. Entre todas as formas de partículas disponíveis, a absorção óptica do nanorods ouro (Au NRs) corresponde convenientemente a janela terapêutica de tecidos biológicos (infravermelho próximo - NIR, comprimento de onda entre 750-1,400 nm) 10. Além disso, no context de estimulação neural, o uso de Au NRs proporciona biocompatibilidade relativamente favoráveis ​​e uma grande variedade de opções de funcionalização de superfície 11. Estudos recentes têm mostrado que um efeito estimulador sobre a diferenciação pode ser induzida após exposições a laser contínua de Au NRs NG 108-15 em células neuronais 12. Da mesma forma, os transientes de cálcio intracelular foram registrados em células neuronais cultivadas com Au NRs após a irradiação com laser modulado com freqüências variáveis ​​e pulso comprimentos 13. Despolarização da membrana celular também foi registada após iluminação por laser NIR de Au NRs em culturas primárias de neurónios do gânglio da espiral 14. A primeira aplicação in vivo com irradiado Au NRs foi demonstrado recentemente. Eom e colegas de trabalho expostos Au NRs em seu pico plasmonic e registrou um aumento de seis vezes na amplitude do potencial de ação do nervo composto (CNaPS) e uma diminuição de três vezes no limiar de estimulação no nervo ciático de ratos. O enresposta hanced foi atribuído a efeitos de aquecimento local que resultam da excitação do pico plasmónico NR 15.

No presente trabalho, protocolos para investigar os efeitos da estimulação do laser em NG108-15 células neuronais cultivadas com Au NRs são especificados. Esses métodos fornecem um simples, mas poderoso, caminho para irradiar populações de células in vitro utilizando técnicas de biologia padrão e materiais. O protocolo baseia-se em um diodo laser acoplada a fibra (LD) que permite um funcionamento seguro e repetitivo alinhamento. As Au NR preparação de amostras e métodos de irradiação a laser pode ser alargada a diferentes formas de partículas e culturas de células neuronais, proporcionando que os protocolos de síntese e de cultura específicos são conhecidos, respectivamente.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Au NRs Preparação

Nota: Au NRs pode ser sintetizado por uma série de receitas 16, ou adquiridos de fornecedores comerciais.

  1. Medir a densidade óptica inicial (OD) da solução de Au NR via espectroscopia de UV-Vis, por um registo dos valores de absorção de 300 nm a 1000 nm, com uma resolução de 0,5-2 nm. Fazer variar o volume da solução a ser usado com a cuvete disponível.
  2. Avaliar a concentração molar inicial NP com uma técnica de 17 adequada (por exemplo, UV-Vis, única partícula espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado, microscopia eletrônica de transmissão) ou usar os valores de concentração fornecidos pelo fornecedor.
  3. Prepara-se uma solução estoque de 5 ml por diluição da amostra inicial de Au NR para atingir uma DO = 1. Para a melhor repetibilidade, manter constante o OD para todas as amostras testadas. Seguir o protocolo do vendedor comercial para a composição do solvente de diluição. Se não tiver certeza, Use água deionizada.
  4. Centrifugar 1 ml da solução de Au NR duas vezes durante 15 min a 7800 xg para remover qualquer excesso de produto químico a partir da solução. Ciclos de centrifugação podem variar em vigor e tempo (por exemplo, 20 min a 5.600 x g) 18.
  5. Remover o sobrenadante e re-suspender as NRs em água deionizada. Como partículas re-suspensão pode formar agregados em solução, prepará-los diariamente para ter os melhores resultados. Alternativamente, armazenar em um frigorífico para não mais do que uma semana. Não congelar.
  6. Antes de utilizar, sob condições de cultura de células, sonicar a solução Au NR durante 5 min e, em seguida esterilizar com luz UV durante 30 minutos (intensidade da radiação UV não menos do que 400 mW ∙ m -2 a 254 nm).

2. NG108-15 celular neuronal Linha Cultura e Diferenciação

  1. Para o meio de cultura de células, preparar 500 ml de meio estéril de Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) contendo 10% (w / v) de soro fetal de vitelo (FCS), 1% (w / v) de L-glutamina, 1%(W / v) de penicilina / estreptomicina e 0,5% (w / v) de anfotericina B.
    Nota: Os suplementos podem ser aliquotado, armazenado a -20 ° C e adicionado ao meio no dia necessária. Meio de cultura celular pode ser refrigerado numa condição estéril durante um período máximo de 1 mês.
  2. Para o meio de diferenciação celular, preparar 50 ml de DMEM estéril contendo 1% (w / v) de L-glutamina, 1% (w / v) de penicilina / estreptomicina e 0,5% (w / v) de anfotericina B.
  3. Cresça NG108-15 células neuronais em 10 ml de meio de cultura de células em frascos T75 em poliestireno numa incubadora com uma atmosfera humidificada (5% de CO2 a 37 ° C). Normalmente, sementes 1,5-2 × 10 5 células em cada frasco para estar pronto em 3-4 dias. Mudar meio de cultura celular a cada dois dias.
    Nota: Para evitar desvios genéticos ou variação, não use as células mais velhas do que a passagem de 21 para experimentos.
  4. Quando 70-80% confluentes em cultura, mudar o meio com meio de cultura de células frescas quente. Mecanicamente separar as células por suavemente KNOCrei o fundo do frasco confluente. Não use tripsina.
  5. Centrifugar a suspensão de células durante 5 min a 600 xg e re-suspender o sedimento celular em 2 ml de meio de diferenciação da célula quente.
  6. Semente 2 × 10 4 células / cm2 em uma cultura de tecidos de poliestireno placa de 96 poços com 200 ul de meio de diferenciação celular. Incubar a experiência durante 1 dia a 5% de CO 2/37 ° C.
  7. Adicionar entre 3,2 × 10 × 1 -4,2 9 0 10 partículas / ml de solução Au NR no dia 2 e incubar por 24 horas adicionais. Não adicione as partículas para os experimentos de controle.
    Observação: Como um controlo alternativo, Au PN com um pico de absorção de comprimento de onda bem diferenciado pode ser utilizado para fins de comparação 14. Para um comportamento celular mais consistente, manter a densidade de células constante e não modificar a superfície bem antes da semeadura de células.

3. Aperfeiçoamento crescimento de neurites

  1. Casalo laser com uma fibra óptica monomodo (abertura numérica = 0,13) e terminá-lo com um conector de fibra (FC conectores são convenientes e comumente disponíveis). Medir a potência do laser de saída com um medidor de potência padrão. Para obter os resultados mais eficazes, corresponder ao comprimento de onda de pico do laser para o pico de ressonância de plasmon de NRs.
  2. No dia 3 após a incubação NR, fixar o conector FC para o bem. Irradiar as amostras e os controlos em TA durante 1 min em onda contínua, para diferentes potências de laser. Permitir que a cultura prosseguir durante mais 3 dias em 5% de CO 2/37 ° C. Repetir a irradiação com laser durante um mínimo de 3 medições independentes.
    Nota: Diferentes tempos de irradiação e frequências de pulsação pode ser seleccionado, dependendo da aplicação.
  3. Caracterizar o laser em termos de diâmetro do feixe e irradiação laser (W ∙ cm -2).
    1. Para uma fibra monomodo padrão, use NA = n ∙ sin θ,onde n é o índice de refracção do meio em utilização e θ é a metade do ângulo do cone da luz que sai da fibra (ver Figura 1A). De trigonometria, r = tan θd, em que r é o raio do feixe e d é a distância entre a fibra e a amostra. O conector FC coincide com o diâmetro do poço, por conseguinte, iluminando a amostra a uma distância d = 2,70 ± 0,20 mm. Luz sai da fibra em água (n = 1,33), dando r = tan (sin-1 (NA / n))d.
    2. Usando esta última equação, calcular o raio do feixe laser, o feixe de área correspondente e a irradiação a laser média (potência do laser dividida pela área do feixe) para o alvo (ver o gráfico de exemplo na Figura 1B). Estes valores representam a irradiância média sobre a área iluminada.
    3. Avaliar os erros para as medições com a teoria geral da propagação de erros.
      Nota: A distância bntre o conector FC e a amostra pode ser medida por fotografias do arranjo experimental e de pós-processamento da imagem utilizando software apropriado (por exemplo ImageJ).
  4. No dia 5, remover o meio de diferenciação de células a partir das experiências e fixar as amostras com 3,7% (v / v) de solução de formaldeído, durante 10 min, em seguida, permeabilizar as células com 0,1% (v / v) de Triton X-100 durante 20 min.
  5. Adicionar 3% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA) para as amostras durante 60 minutos para bloquear os locais de ligação da proteína que não reagiu. Rotular as amostras durante a noite para anti-βIII-tubulina (5 ug / ml em PBS suplementado com 1% de BSA) a 4 ° C.
  6. Incubar as células durante 90 min no escuro com um anticorpo secundário apropriado (anticorpo de ratinho anti-TRITC por exemplo conjugado de IgG) utilizando uma concentração de 0,4-2 ug / ml em 1% de BSA em PBS. Rotular os núcleos celulares com DAPI (0,1 ug / ml em água desionizada) durante 10 min.
    Nota: conjugação de anticorpos e mig concentraçãoht variar de acordo com o protocolo da empresa. Lavar as amostras duas vezes com PBS durante 5 min após cada etapa de coloração.
    Figura 1
  7. Amostras de imagem por epifluorescência ou microscopia confocal, utilizando pelo menos um 20 × objetivo. Escolha do microscópio filtra em conformidade com o anticorpo secundário. Selecione um filtro de DAPI (λ EX = 358 nm; λ EM = 488 nm) para visualizar os núcleos celulares.
  8. Analisar as imagens por avaliar: i) o comprimento de neurites máximo (ficha o comprimento da ponta da neurites para o início do corpo celular), ii) o número de neurites por célula neuronal (resumir todas as neurites por célula) e iii) a percentagem de células com neurites (dividindo o número total de células que expressam βIII-tubulina pelo número total de células com um núcleo corou positivamente) 19.

4. laser-induzida intracelular de Ca2 + de imagem

Prepara-se uma a 20% (w / v) de solução de estoque de Pluronic F-127 por dissolução de 2 g de soluto em 10 ml de dimetilsulfóxido anidro (DMSO). Aquece-se a solução de Pluronic F-127 a 40 ° C durante cerca de 20 min para aumentar a solubilidade. Prepare com antecedência se armazenado à temperatura ambiente.
  • No dia 3 seguinte NR incubação, preparar uma solução de sal equilibrada (BSS; NaCl 135 mM, KCl 4,5 mM, CaCl 2 1,5 mM, MgCl 2 0,5 mM, glicose 5,6 mM, e 10 mM de HEPES, pH 7,4) e complementado com 5 ? M de Fluo-4 AM durante DMSO e 0,1% (w / v) de Pluronic F-127 solução.
    Nota: solução de BSS pode ser preparado antecipadamente e refrigerados durante um período máximo de 1 mês. Adicione os suplementos (Fluo-04:00 e Pluronic F-127) no dia do experimento.
  • Remova o meio de diferenciação celular e substituí-lo com a solução de BSS suplementado. Para obter os melhores resultados com um microscópio confocal invertido, incubar as células em um micro-poços da lâmina.
  • Carga NG108-15 células com Fluo-04:00durante 30 min no escuro a 5% de CO 2/37 ° C. Após o tempo de incubação, as amostras lavar duas vezes com BSS para remover qualquer fluoróforo descarregado extracelular.
  • Pares a laser com uma fibra óptica de modo simples e clivar a ponta, utilizando técnicas convencionais. Observar a ponta resultante sob um microscópio óptico, para assegurar uma superfície de alta qualidade (ou seja, a ponta deve ser perpendicular ao eixo da fibra e plana sobre a inspecção microscopia).
    1. Medir a potência do laser de saída com um medidor de potência padrão. Insira o fibra entrega a luz em um suporte de fibra óptica e afixá-lo a um microposicionador. Consulte Brown et al. 20 para obter mais detalhes sobre a preparação de fibra óptica e de posicionamento.
      Atenção: Siga as regras gerais de segurança do laser durante a medição da potência do laser (por exemplo, não olhe diretamente para o feixe de laser, usar óculos de segurança a laser durante o manuseio, evitar a exposição a luz difusa para outros usuários de laboratório) <./ Li>
  • Ligue um osciloscópio para o laser portátil para monitorar a modulação óptica. Use um sinal binário com freqüências variáveis ​​(0,5-2 Hz) e comprimentos de pulso (20-100 ms). Ligue o laser utilizando o sinal de modulação como a lógica transistor-transistor (TTL) de entrada para o microscópio, após a configuração mostrada na Paviolo et al. 13.
    1. Colocar as células sob um microscópio confocal invertido e posicionar a fibra de entrega de luz 250 ± 50 mm de distância a partir da célula alvo em modo de iluminação de transmissão. A esta distância, utilizar as equações apresentadas em 3.3.1 para calcular o raio do feixe para o alvo.
  • Usar um laser de árgon-ião (488 nm) para excitar o corante Fluo-4 AM internalizado (λ EX = 494 nm; λ EM = 516 nm) e o LD sincronizado para a excitação de NRs endocitose. Realize a imagem de TR de amostras e controles usando pelo menos um objectivo de 40 ×, recolhendo scans de séries temporaiscom 256 × 256 pixels / resolução de quadro no modo de ida e volta, com uma frequência de pelo menos 4 Hz. Realizar uma gravação sem qualquer excitação LD para identificar qualquer interferência com laser de argônio-ion (ruído da linha de base).
  • Retire o fundo a partir dos dados utilizando adaptativa ponderados penalizados mínimos quadrados algoritmos 21. Traçar as variações induzidas Ca2 + como uma função do tempo. Analisar os picos transientes na intensidade de fluorescência, utilizando software de imagem pós-processamento por thresholding a um nível de três vezes o desvio padrão do ruído de linha de base (3σ).
  • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Usando protocolos 1, 2 e 3 descritos aqui, um efeito estimulador sobre a diferenciação foi observada em células NG108-15 neuronais cultivadas com Au PN (Au NRs, poli (estirenossulfonato) -Revestido Au NRs e revestido de silica Au NRs) após o laser exposições entre 1,25 e 7,5 W · cm -2. Imagens confocal de rhodamineB marcado Au NRs demonstrado que as partículas foram internalizadas desde o dia 1 de incubação de 12. A localização foi predominantemente observada no citoplasma da célula, indicando que o mecanismo preferido de absorção através da membrana foi corpo da célula 12. As principais alterações morfológicas detectadas após a indução de diferenciação em células neuronais NG108-15 foram a prisão de proliferação, a expressão da proteína βIII-tubulina eo crescimento de neurites, que foram analisados ​​em termos de comprimento máximo e número 22.

    As amostras cultivadas com NRs mostrou um aumento de comprimento de neurites na irradi a laserAnce níveis medidos aqui (entre 1,25 e 7,5 W · cm -2). As amostras de controlo (células cultivadas sem PN e irradiados com a mesma potência do laser) não mostrou nenhuma mudança significativa no comprimento. Utilizando uma dose de irradiação de 7,5 W · cm -2, o comprimento de neurites final NG 108-15 cultivadas com Au NRs era aproximadamente 36% maior (p <0,01) do que as amostras-não-irradiados de laser. Este comportamento não era especificamente ligada à química de superfície das NRs. Estes valores eram quase 20% maior do que as desenvolvidas pelo neurites NG108 -15 sozinho e expostos para o mesmo valor de exposição ao laser (p <0,05) 12. Estes resultados estão em linha com estudos previamente publicados no PC12 células neuronais cultivadas com nanotubos piezoelétricos e irradiados com radiação ultra-som 7.

    As experiências de controlo sem Au NRs também mostrou alguns efeitos estimulantes da luz 780 nm, em termos de porcentagem de neurônios com neurites e número de neurites por neurônio. Esta estimulação foi mais eficaz na poderes de laser mais baixas (1,25 W ∙ cm -2), com uma conseqüente diminuição no mais alto de energia laser (7,5 W ∙ cm -2) 12. Uma estimulação moderada causada por PN sem qualquer irradiação com laser (poli (estirenossulfonato) e -Revestido apenas revestido de silica) foi detectado na percentagem de neurónios com neurites 12. Estes resultados estão em linha com as observações recentemente publicados que as nanopartículas de ouro podem aumentar a atividade neuronal in vitro 23,24. A Figura 2 mostra um exemplo de imagens de epifluorescência de células neuronais diferenciadas NG108-15 cultivadas isoladamente (Figura 2A), ou com a UA NRs (Figura 2B ) e irradiada com diferentes potências de laser (indicadas na figura).

    O potencial para gerados por foto intracelular Ca 2+ liberação foi avaliada usando a luz pulsada NIR de acordo com protocolos nºs 1, 2 e4. Os íons de cálcio desempenham um papel importante em diversas atividades celulares, como a mitose, contração muscular e extensão de neurite 25,26. Em resposta a um estímulo, Ca 2+ aumenta, oscila e diminui, levando à ativação, a modulação ou término de uma função celular específica. Recentemente, Ca 2 + transientes também têm sido observadas como consequência da exposição ao laser IR em cardiomiócitos. Nesse trabalho, as respostas do Ca 2+ evocadas após a exposição IR exibiu amplitudes mais baixas e tempos de recuperação mais rápidos do que os espontâneos Ca 2 + transientes 2. A Figura 3 mostra um exemplo de NG108-15 células neuronais carregadas com Fluo-04:00 e fotografada com um microscópio confocal. Fluo-4 AM também foi observada com a membrana celular de uma forma não destrutiva, o que resulta numa distribuição geralmente uniforme do indicador através do citoplasma da célula. Apenas pequenas manchas organela nuclear ou citoplasmática foi detectado. Como indicado anteriormente, Eram esperados NRs para ser localizado intracelularmente 12. NG108-15 células neuronais sozinho ou cultivadas com Au NRs e poli (estirenosulfonato) -Revestido-au NRs foram expostos posteriormente para irradiâncias de laser entre 0,07 J ∙ cm -2 e 370 J ∙ cm -2, com a frequência do laser modulada na faixa 0,5-2 Hz.

    Figura 4 mostra exemplos representativos de como a amplitude das respostas foi mapeado em função do tempo. A amplitude da resposta de Ca2 + variou com a exposição radiante (Figura 4A - C) e não foi observada a ser consistentemente desencadeado pelos impulsos de laser (Figura 4C) 13. As explicações mais prováveis ​​são a depleção transiente de Ca 2+ intracelular lojas atribuídos a incompleto de Ca 2+ ou de carregamento 2 a diferente eficiência de internalização NR nas células neuronais. Quando NRs não foram utilizados na culture (experimentos de controle, Figura 4D), também foi observado um efeito estimulador da luz 780 nm. No entanto, este produzido menores picos de amplitude de fluorescência e menor probabilidade de ativação (detectado em apenas 16% das amostras analisadas). Em geral, uma probabilidade de 48% de NR induzida por laser a activação das células foi conseguida e, apesar dos eventos de fundo devido à luz de 780 nm, a exposição de células tratadas com NR demonstrou maior eficiência estimulação com menor energia do laser e picos mais elevados de resposta 13. De facto, a resposta de cálcio foi encontrada para um máximo de 0,33 cm J ∙ -2 nas células tratadas com NR. Isto foi atribuído à inibição térmica 13. Durante as experiências, sem evidência de formação de bolhas ou qualquer outra forma de ruptura da membrana celular foi detectado, o que é consistente com os resultados de Huang et ai. Relataram que a fotodestruição celular com uma densidade de energia relativamente elevada de 19 W ∙ cm -2 aplicado para 4 2 min7. Nenhuma actividade espontânea nas células tratadas com NR foi gravada sem exposição ao laser.

    Figura 1
    Figura 1: Fibra óptica experimental configuração (A) e irradiâncias médios de laser como uma função da potência do laser de feixe de laser de área é igual a 0,4 mm 2 (B). Parâmetros do feixe são (A): o semi-ângulo do cone máxima de luz de saída da fibra (θ), o feixe de raio (r) e a distância entre a fibra óptica e a amostra (d).

    Figura 2
    Figura 2: Exemplos de imagens de epifluorescência de células neuronais diferenciadas NG108-15, cultivadas isoladamente (A) ou com Au NRs (B) e irradiada com diferentes potências de laser (indicadas na figura). As amostras foram incubated por um dia antes da irradiação laser. As células foram fixadas e rotulado para anti-β-tubulina III (vermelho) e DAPI (azul), três dias após a irradiação com laser. As barras de escala são de 100 um.

    Figura 3
    Figura 3: Exemplo de diferenciadas NG108-15 células neuronais carregados com indicador Fluo4-AM Ca 2+ A imagem foi tirada usando um microscópio confocal invertido com um objetivo de imersão em óleo de 40X..

    Figura 4
    Figura 4: Exemplos representativos de induzida por laser de Ca 2+ variações em função do tempo em células NG108-15 neuronais em cultura em condições isentas de soro, durante três dias, com (A) poli (estirenossulfonato) NRs -AU (B, C) Au NRs, e (D), sem NRs (amostra de controlo). Estes resultados eramobtido com pulsos de laser de 100 mseg (A, C, D) e 50 (B) mseg. As frequências utilizadas para as experiências (linhas verticais tracejadas) foram de 1 Hz (A - C) e 0,5 Hz (D). As exposições foram calculados radiantes 69,4 J cm-2(A), 34,7 J cm-2(B), 0,37 J ∙ cm -2 (C) e 138,87 J ∙ cm -2 (D). F max / F 0 indica o aumento máximo de fluorescência detectada em NG108 -15 células neuronais, a partir da calibração com ionomicina (reproduzido com permissão 13).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Os protocolos descritos nesta apresentação descrevem como cultura, diferenciar e opticamente estimular as células neuronais usando absorventes extrínsecos. As características NR (por exemplo, dimensões, forma, comprimento de onda de ressonância de plasmon de superfície e química) e os parâmetros de estimulação do laser (comprimento de onda, tais como, duração dos impulsos, taxa de repetição, etc.) pode ser variada para corresponder a diferentes necessidades experimentais. Os efeitos sobre o comportamento de células pode ser monitorizada utilizando ensaios biológicos padrão e materiais. No geral, a abordagem fornece uma maneira simples, mas poderosa, caminho para irradiar populações de células in vitro e poderia ser alargado a pilhas, amostras de tecidos e estudos in vivo.

    Os principais requisitos que precisam de Au NRs para satisfazer a ser utilizado para aplicações biológicas são a estabilidade (tanto química como física) e biocompatibilidade. O último é particularmente crítica, devido à presença de um agente tensioactivo catiónico (comumly CTAB) sobre a superfície do Au. CTAB é conhecido por induzir a citotoxicidade in vitro e in vivo 28, 29 e que é comumente utilizado durante o processo de síntese para conduzir a formação de NR-forma 30. Estabilidade e biocompatibilidade são muitas vezes melhoradas pela deposição de revestimentos adicionais sobre a superfície Au NR (por exemplo, polietileno glicol, sílica) 31. Para avaliar a biocompatibilidade, diferentes ensaios podem ser utilizados in vitro (por exemplo, ao vivo / morto, MTS, MTT, etc.) enquanto que a análise histológica é muitas vezes realizada no decurso de experiências de tecidos 7,8,12,15.

    Outro desafio a enfrentar quando se trabalha com nanomateriais é a dificuldade de determinar corretamente a sua concentração molar. A enorme variedade de NPs em termos de forma, tamanho e propriedades químicas faz com que as técnicas disponíveis no momento adequado para apenas algumas classes de partículas. Por exemplo, o scatt luz dinâmica padrãoderando método assume que o NPS tem uma forma esférica e dispersão de luz isotropically 17. Portanto, a aplicação deste método para resultados Au NRs em discrepâncias entre a concentração medida eo real. O problema da concentração de NP é particularmente problemático se relacionada com o campo da nanomedicina, onde a concentração administrada tem de ser controlado com precisão, a fim de maximizar a eficácia do processo (por exemplo, para aplicações de entrega de drogas) e minimizar a toxicidade dos nanomateriais 17. Nos estudos apresentados, a densidade óptica utilizada deu bons resultados em termos de viabilidade celular e número de partículas.

    Devido às suas propriedades intrínsecas de absorção, Au NPs são muitas vezes utilizados em combinação com uma fonte de laser. Durante a exposição, a absorção e a dispersão são os dois processos principais, que podem ocorrer na superfície das nanopartículas. Se o comprimento de onda do laser coincide com o comprimento de onda de ressonância de plasmon de, muitas vezes, absorçãoprevalece sobre a dispersão, excitando os elétrons de condução na superfície da NP. Estes formam um gás de electrões que se afasta da sua posição de equilíbrio e cria uma oscilação ressonante coerente chamado a ressonância de plasmon de superfície localizada (LECC). A energia é então transferida para a estrutura de cristal como NP calor, o qual é em seguida rapidamente dissipado para o ambiente circundante 32. Desde que o calor é o principal efeito observado após a excitação da NR LECC, é aconselhável para monitorar a viabilidade celular após exposição ao laser.

    Há a hipótese de que os efeitos observados no desenvolvimento de neurite eo intracelular de Ca2 + via eram devido ao aquecimento transitória decorrente da excitação do LECC. Esta hipótese está em linha com a activação do canal de TRPV1 sensível à temperatura, após a exposição magnética de NPs de ferrite 5. Esse processo também é consistente com as observações que os canais TRPV4 termicamente sensíveis play um papel importante na estimulação do nervo infravermelho 33. Ao nível molecular, foi demonstrado recentemente que TRPV4 é termossensível apenas após a interacção de -4,5 -biphosphate fosfoinositida (PIP 2), com o canal 34. Portanto, é possível que o aquecimento transiente resultante após NR excitação poderia servir para acelerar e / ou induzir a abertura dos canais de TRPV4. Esta hipótese pode ser confirmada por futuras Ca2 + experimentos usando Ca 2+ - livre médio e / ou controles moleculares sobre o esgotamento PIP 2.

    Grupos diferentes também têm demonstrado que os pequenos gradientes de temperatura ao longo do intervalo de temperatura fisiológica pode ser utilizado para induzir outras respostas, tais como o cone de crescimento neuronal guiamento 25 ou correntes despolarizantes em células embrionárias de rim humano 35. Yong e colegas de trabalho registou um aumento significativo na atividade sinal elétrico em auditivo primário neurônios cultured com revestido de sílica Au NRs após a irradiação com laser das NRs no LECC. O aquecimento produzido pelas partículas irradiadas com laser foi medido utilizando técnicas de patch-clamp 14. Mais recentemente, Eom et al. Registaram um aumento na amplitude de CNaPS após exposição a laser de 3,4 x 10 9 Au NRs quando continuamente borrifadas na vizinhança da bainha do feixe de nervos de um nervo ciático de rato 15.

    O efeito estimulador do diodo de laser 780 nm observada durante as experiências não foi ligada ao calor gerado pela absorção de água, como isso é conhecido como sendo desprezível a 780 nm 36. Resultados previamente publicados também relataram efeitos estimulantes de 780 nm de luz sobre o tecido neuronal in vivo 37,38. Estudos in vitro têm demonstrado o envolvimento de espécies reativas de oxigênio no processo 39. No entanto, os mecanismos de execução pelo estímulo NIR afeta transcrições genen e outras atividades celulares Atualmente não resolvida. Os dados actuais sugerem a interacção dos diferentes efeitos na estimulação, incluindo a absorção de fotões dentro de cromóforos na mitocôndria (quase 50% da energia a 780 nm pode ser absorvida pelo citocromo c oxidase) 37,39-41, alterações na permeabilidade da membrana ao cálcio 37 e a inibição da actividade inflamatória nas células 37.

    Os resultados apresentados neste manuscrito demonstrar que absorvedores de nanopartículas são uma grande promessa para futuras aplicações em estimulação óptica de células neuronais. A principal vantagem reside na capacidade de NIR luz penetre profundamente nos tecidos (janela terapêutica). Estes resultados mostram também que os absorventes de nanopartículas pode melhorar e / ou substituir o processo de estimulação neural por infravermelhos com base em absorção de água. Para futuras aplicações em próteses neurais, seria de interesse investigar diferente functionalizat superfícieíons com afinidade química com a axônios neuronais, que são os principais alvos para muitas aplicações de estimulação óptica.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Acknowledgments

    Os autores gostariam de agradecer NanoVentures Austrália por apoio de financiamento de viagens e Prof. John Haycock por ter sido sede parcialmente esta pesquisa da Universidade de Sheffield e Ms. Jaimee Mayne por sua ajuda durante as filmagens.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Au NR Sigma Aldrich 716812
    NG108-15 Sigma Aldrich 8811230
    DMEM Sigma Aldrich D6546
    FCS Life Technologies 10100147
    L-glutamine Sigma Aldrich G7513
    Penicillin/streptomycin Life Technologies 15140122
    Amphotericin B Life Technologies 15290018
    Formaldehyde Sigma Aldrich F8775
    Triton X-100 BDH T8532
    BSA Sigma Aldrich A2058
    Anti-βIII-tubulin Promega G7121
    TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody Sigma Aldrich T5393
    DAPI Invitrogen D1306
    Fluo-4 AM Invitrogen F14201
    DMSO Sigma Aldrich 472301
    Pluronic F-127 Invitrogen P6867
    UV-Vis spectrometer Varian Medical Systems Inc. Cary 50 Bio
    Mini centrifuge Eppendorf Mini Spin
    Sonic bath Unisonics Australia FPX 10D
    Cell culture incubator Kendro Hera Cell 150
    Cell culture centrifuge Hettich Rotofix 32A
    Laser diode Optotech 780 nm single mode fibre - coupled LD
    Optical fiber Thorlabs 780 HP
    Power meter Coherent Laser Check
    ImageJ http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
    Epifluorescent microscope Axon Instruments ImageX-press 5000A
    μ-slide well Ibidi 80826
    Inverted confocal microscope Carl Zeiss Microscopy Ltd. LSM 510 meta-confocal microscope
    Oscilloscope Tektronix TDS210

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser. Photonics Rev. 5 (1), 68-80 (2011).
    2. Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. J. Physiol. 589 (6), 1295-1306 (2011).
    3. Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 17 (7), 075002-075002 (2012).
    4. Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G., Stoddart, P. R. Modeling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18 (3), 035004 (2013).
    5. Huang, H., Delikanli, S., Zeng, H., Ferkey, D. M., Pralle, A. Remote control of ion channels and neurons through magnetic-field heating of nanoparticles. Nat. Nanotechnol. 5 (8), 602-606 (2010).
    6. Farah, N., et al. Holographically patterned activation using photo-absorber induced neural-thermal stimulation. J. Neural. Eng. 10 (5), (2013).
    7. Ciofani, G., et al. Enhancement of neurite outgrowth in neuronal-like cells following boron nitride nanotube-mediated stimulation. ACS Nano. 4 (10), 6267-6277 (2010).
    8. Kim, J. A., et al. Enhancement of neurite outgrowth in PC12 cells by iron oxide nanoparticles. Biomaterials. 32 (11), 2871-2877 (2011).
    9. Myroshnychenko, V., et al. Modelling the optical response of gold nanoparticles. Chem. Soc. Rev. 37 (9), 1792-1805 (2008).
    10. Choi, W. I., Sahu, A., Kim, Y. H., Tae, G. Photothermal cancer therapy and imaging based on gold nanorods. Ann. Biomed. Eng. 40 (2), 534-546 (2011).
    11. Zhan, Q., Qian, J., Li, X., He, S. A study of mesoporous silica-encapsulated gold nanorods as enhanced light scattering probes for cancer cell imaging. Nanotechnology. 21 (5), 055704 (2010).
    12. Paviolo, C., et al. Laser exposure of gold nanorods can increase neuronal cell outgrowth. Biotechnol. Bioeng. 110 (8), 2277-2291 (2013).
    13. Paviolo, C., Haycock, J. W., Cadusch, P. J., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. Laser exposure of gold nanorods can induce intracellular calcium transients. J. Biophotonics. 7 (10), 761-765 (2014).
    14. Yong, J., et al. Gold-nanorod-assisted near-infrared stimulation of primary auditory neurons. Adv. Healthcare Mater. , (2014).
    15. Eom, K., et al. Enhanced infrared neural stimulation using localized surface plasmon resonance of gold nanorods. Small. , (2014).
    16. Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marzán, L. M., Mulvaney, P. Gold nanorods: Synthesis, characterization and applications. Coordination Chemistry Reviews. (17-18), 1870-1901 (2005).
    17. Shang, J., Gao, X. Nanoparticle counting: towards accurate determination of the molar concentration. Chem. Soc. Rev. 43 (21), 7267-7278 (2014).
    18. Sharma, V., Park, K., Srinivasarao, M. Shape separation of gold nanorods using centrifugation. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (13), 4981-4985 (2009).
    19. Kaewkhaw, R., Scutt, A. M., Haycock, J. W. Anatomical site influences the differentiation of adipose-derived stem cells for schwann-cell phenotype and function. Glia. 59 (5), 734-749 (2011).
    20. Brown, W. G. A., Needham, K., Nayagam, B. A., Stoddart, P. R. Whole cell patch clamp for investigating the mechanisms of infrared neural stimulation. JoVE. (77), (2013).
    21. Cadusch, P. J., Hlaing, M. M., Wade, S. A., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. Improved methods for fluorescence background subtraction from Raman spectra. J. Raman Spectrosc. 44 (11), 1587-1595 (2013).
    22. Daud, M. F. B., Pawar, K. C., Claeyssens, F., Ryan, A. J., Haycock, J. W. An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies. Biomaterials. 33 (25), 5901-5913 (2012).
    23. Jung, S., et al. Intracellular gold nanoparticles increase neuronal excitability and aggravate seizure activity in the mouse brain. PLoS ONE. 9 (3), e91360 (2014).
    24. Salinas, K., Kereselidze, Z., DeLuna, F., Peralta, X., Santamaria, F. Transient extracellular application of gold nanostars increases hippocampal neuronal activity. J. Nanobiotechnology. 12 (1), 31 (2014).
    25. Ebbesen, C. L., Bruus, H. Analysis of laser-induced heating in optical neuronal guidance. J. Neurosci. Meth. 209 (1), 168-177 (2012).
    26. Iwanaga, S., et al. Location-dependent photogeneration of calcium waves in HeLa cells. Cell Biochem. Biophys. 45 (2), 167-176 (2006).
    27. Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Determination of the minimum temperature required for selective photothermal destruction of cancer cells with the use of immunotargeted gold nanoparticles. Photochem. Photobiol. 82 (2), 412-417 (2006).
    28. Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 1 (3), 325-327 (2005).
    29. Isomaa, B., Reuter, J., Djupsund, B. M. The subacute and chronic toxicity of cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), a cationic surfactant, in the rat. Arch. Toxicol. 35 (2), 91-96 (1976).
    30. Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marzán, L., Mulvaney, P. Gold nanorods: synthesis, characterization and applications. Coord. Chem. Rev. 249 (17-18), 1870-1901 (2005).
    31. Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chem. Soc. Rev. 41 (7), 2740-2779 (2012).
    32. Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold nanoparticles. Lasers Med. Sci. 23 (3), 217-228 (2008).
    33. Albert, E. S., et al. TRPV4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. J. Neurophysiol. 107 (12), 3227-3234 (2012).
    34. Garcia-Elias, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate-dependent rearrangement of TRPV4 cytosolic tails enables channel activation by physiological stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9553-9558 (2013).
    35. Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nat. Commun. 3 (736), (2012).
    36. Roggan, A., Friebel, M., Dörschel, K., Hahn, A., Müller, G. Optical properties of circulating human blood in the wavelength range 400-2500 nm. J. Biomed. Opt. 4 (1), 36-46 (1999).
    37. Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers Surg. Med. 36 (3), 171-185 (2005).
    38. Wu, X., et al. 810 nm wavelength light: an effective therapy for transected or contused rat spinal cord. Lasers Surg. Med. 41 (1), 36-41 (2009).
    39. Grossman, N., Schneid, N., Reuveni, H., Halevy, S., Lubart, R. 780 nm low power diode laser irradiation stimulates proliferation of keratinocyte cultures: involvement of reactive oxygen species. Lasers Surg. Med. 22 (4), 212-218 (1998).
    40. Wong-Riley, M. T. T., et al. Photobiomodulation directly benefits primary neurons functionally inactivated by toxins - Role of cytochrome c oxidase. J. Biol. Chem. 280 (6), 4761-4771 (2005).
    41. Beauvoit, B., Kitai, T., Chance, B. Contribution of the mitochondrial compartment to the optical properties pf the rat liver: a theoretical and practical approach. Biophys. J. 67 (6), 2501-2510 (1994).

    Tags

    Neuroscience Edição 98 ouro nanorods absorvedor externo estimulação neural excitação laser óptico estimulação células neuronais,
    Ouro nanorod assistida estimulação óptica de Neuronal Cells
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Paviolo, C., McArthur, S. L.,More

    Paviolo, C., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells. J. Vis. Exp. (98), e52566, doi:10.3791/52566 (2015).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter