Introduction
Недавние исследования показали, что переходный нагрева связан с поглощением инфракрасного света водой (длина волны> 1400 нм) могут быть использованы, чтобы вызвать потенциалы действия в нервной ткани 1 и внутриклеточных переходных кальция в кардиомиоцитах 2. Использование инфракрасного света поднял большой интерес для применения в нейронных протезов, из-за потенциального тонкой пространственным разрешением, отсутствие прямого контакта с тканью, минимизации стимуляции артефактов и снятия необходимости генетически модифицировать клетки до стимуляции ( в соответствии с требованиями Оптогенетика) 1. Несмотря на все эти преимущества, недавно разработанные тепловые модели предположил, что ткани-мишени / клетки могут быть затронуты кумулятивных эффектов отопления, когда несколько сайтов стимулирования и / или высокие темпы повторения используются 3,4.
В ответ на эти вызовы, исследователи признали потенциал для использования внешнюю всасываниеБерс для стимуляции нерва, чтобы произвести больше локализованные эффекты нагревания в ткани. Хуанг и др. Показали, этот принцип с помощью наночастиц суперферромагнитных ферритовые удаленно активировать термодатчик каналы TRPV1 в НЕК 293 клеток с радио-частоты магнитного поля 5. Хотя этот способ может обеспечить более глубокое проникновение (магнитные поля взаимодействуют с относительно слабо ткани), ответы были записаны только в течение периодов секунд, а не миллисекунды длительности требуемых в бионическими устройств 5. Аналогичным образом, Фара др. Показали, электрическое стимулирование крысы корковых нейронов с черными микрочастиц в пробирке. Они показали точность клеточного уровня в стимулировании использования длительности импульса порядка сотен микросекунд и энергий в диапазоне мкДж, что потенциально позволяет более высокую скорость повторения 6.
Использование внешних поглотителей применяется также для индукцииморфологические изменения в пробирке. Ciofani и др. Показали увеличение нейрональной вырост клеток ~ 40% при использовании пьезоэлектрических нитрида бора нанотрубок, возбуждаемых ультразвуком 7. Аналогичным образом, эндоцитоз наночастиц оксида железа в клетках PC12, как сообщалось, повысить нейритов дифференциацию в зависимости от дозы, в результате активации молекул клеточной адгезии с оксидом железа 8.
В последнее время интерес к внешних амортизаторов, чтобы помочь нервного возбуждения также была сосредоточена на использовании наночастиц золота (Au NPS). Au наночастицы обладают способностью эффективно поглощать лазерное излучение в плазмонного пика и рассеивать его в окружающую среду в виде тепла 9. Среди всех доступных форм частиц, оптического поглощения золотых наностержней (Au непальских) удобно соответствует терапевтическое окно биологических тканей (ближней инфракрасной - NIR, длина волны между 750-1,400 нм) 10. Кроме того, в продолжениедоб нервного возбуждения, использование Au NRS обеспечивает относительно благоприятные биосовместимость и широкий спектр вариантов функционализации поверхности 11. Недавние исследования показали, что стимулирующее действие на дифференциацию могут быть вызваны после непрерывного лазерного воздействия АС NRS в NG108-15 нервных клеток 12. Кроме того, внутриклеточные переходные кальция были зарегистрированы в нервных клетках, культивируемых с Au NRS После лазерного облучения модулированной с переменными частотами и длительности импульса 13. Клеточная мембрана деполяризации был также записан после NIR лазерной подсветкой Au ЯРБ в первичных культурах спиральных ганглиев 14. Первый в естественных условиях применения с облученным Au ЯРБ было продемонстрировано совсем недавно. Eom и коллеги подвергли Au ЯРБ на их плазмонного пика и записал шестикратное увеличение амплитуды действий соединение нервных потенциалов (CNAPs) и в три раза снижение порога стимуляции у крыс седалищного нерва. АнУсиленной ответ был приписан к локальным эффектам отопления в результате возбуждения NR плазмонного пика 15.
В настоящей работе, протоколы для исследования эффектов лазерной стимуляции в NG108-15 нервных клеток, культивируемых с Au NRS указаны. Эти методы обеспечивают простой, но мощный, способ облучать клеточных популяций в пробирке с использованием стандартных биологических методов и материалов. Протокол основан на волокна, в сочетании лазерного диода (LD), что позволяет безопасную работу и повторяемость результатов. АС NR пробоподготовки и лазерные методы облучения может быть продлен до различных форм частиц и культур нейрональных клеток, при условии, что конкретные протоколы синтеза и культура, как известно, соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Au непальских Подготовка
Примечание: Au непальских могут быть синтезированы с помощью количество рецептов 16, или приобрести у коммерческих поставщиков.
- Измерить начальную оптическую плотность (ОП) раствора Au NR помощью UV-VIS-спектроскопии, путем записи значения поглощения от 300 нм до 1000 нм с разрешающей способностью 0,5-2 нм. Варьировать объем раствора для использования с имеющейся кювете.
- Оценка начальной NP молярную концентрацию с помощью подходящего способа 17 (например, UV-VIS-спектроскопии, одна частица с индуктивно-связанной плазмы массы спектрометрия, просвечивающей электронной микроскопии) или использовать значения концентрации, предоставленные производителем.
- Подготовка исходного раствора 5 мл разбавлением исходного образца Au NR достичь OD = 1. Для лучшей воспроизводимостью, поддержания постоянной OD для всех испытанных образцов. Следуйте протокол коммерческого поставщика для составления разбавления растворителем. Если вы не уверены, Использовать деионизированную воду.
- Центрифуга 1 мл раствора Au NR дважды в течение 15 мин при 7800 х г дл удалени избытка химическую из раствора. Циклы центрифугирования может варьироваться в силу и времени (например, 20 мин при 5600 × г) 18.
- Удалить супернатанты и повторно приостанавливать НСП в деионизированной воде. Как повторно взвешенных частиц может образовывать агрегаты в растворе, подготовить их ежедневно, чтобы иметь лучшие результаты. Кроме того, магазин в холодильнике не дольше, чем за 1 неделю. Не замораживать.
- Перед использованием в условиях культивирования клеток, разрушать ультразвуком раствора Au NR течение 5 мин, а затем стерилизуют ультрафиолетовым светом в течение 30 мин (интенсивность УФ-излучения не менее 400 мВт ∙ м -2 при 254 нм).
2. NG108-15 нейронов клеточной линии культуры и дифференциация
- Для клеточной культуральной среде, приготовления 500 мл модифицированной Дульбекко среде стерильного Дульбекко (DMEM), содержащей 10% (вес / объем) фетальной сыворотки теленка (FCS), 1% (вес / объем) L-глутамина, 1%(Вес / объем) пенициллина / стрептомицина и 0,5% (вес / объем) амфотерицин В.
Примечание: добавки могут быть аликвоты, хранили при -20 ° С и добавляют в средствах массовой информации в день требуется. Среда для культивирования клеток можно хранить в холодильнике в стерильном состоянии в течение максимум 1 месяц. - Для дифференцировки клеток среды, с получением 50 мл стерильного DMEM, содержащей 1% (вес / объем) L-глутамина, 1% (вес / объем) пенициллина / стрептомицина и 0,5% (вес / объем) амфотерицин В.
- Выращивают NG108-15 нервных клеток в 10 мл среды культуры клеток в колбах Т75 из полистирола в инкубаторе с влажной атмосфере (5% CO 2 при 37 ° С). Как правило, семена 1,5-2 × 10 5 клеток в каждую колбу, чтобы быть готовым в 3-4 дней. Изменение клеточную культуральную среду каждые два дня.
Примечание: Для предотвращения генетических отклонений по или изменение, не используйте клеток старше прохождения 21 для экспериментов. - Когда 70-80% сливной в культуре, изменить среду с теплой пресной среде для культивирования клеток. Механически отделить клетки мягко KNOCкороль в нижней части сливной колбу. Не используйте трипсина.
- Центрифуга клеточной суспензии в течение 5 мин при 600 х г и повторно приостанавливать осадок клеток в 2 мл теплой среды клеточной дифференцировки.
- Семена 2 × 10 4 клеток / см 2 в луночный планшет с 200 мкл клеточной дифференцировки среде тканевой культуры полистирола 96. Выдержите эксперимент на 1 день 5% CO 2/37 ° C.
- Добавить между 3,2 × 10 9 -4,2 × 1 0 10 частиц / мл раствора Au NR в день 2 и инкубировать ее для дополнительной 24 ч. Не добавляйте частиц для контрольных экспериментах.
Примечание: В качестве альтернативного управления, Au наночастицы с хорошо дифференцированной пиковой длине волны поглощения могут быть использованы для сравнения 14. Для более последовательное поведение клеток, держите плотность клеток постоянна и не изменять поверхность задолго до посева клеток.
3. нейритов Повышение
- Паралазер с одномодового оптического волокна (числовая апертура = 0,13) и прекратить его с разъемом волокна (FC разъемы удобны и обычно доступны). Измерьте выходной мощности лазера со стандартным измерителем мощности. Для получения наиболее эффективных результатов, соответствует пиковой длиной волны лазера до плазмонного резонансного пика НСП.
- На 3-й день после NR инкубационного закрепления разъема FC на хорошо. Облучают образцы и контроли при комнатной температуре в течение 1 мин в непрерывном волны для различных лазерных полномочий. Дайте культуры проводили в течение 3 дополнительных дней при 5% CO 2/37 ° C. Повторите лазерное облучение в течение как минимум 3 независимых измерений.
Примечание: Различные времена облучения и частоты модуляции может быть выбрана в зависимости от применения. - Охарактеризуйте лазер по диаметру пучка и лазерного излучения (W ∙ см -2).
- Для стандартного многомодового волокна одного, используйте NA = N ∙ грех θ,где п-показатель преломления среды в использовании и θ представляет собой половину угла конуса света, выходящего из волокна (см фиг.1А). Из тригонометрии, г = загар θ ∙ г, где г радиус пучка и D является расстояние между волокном и образцом. Разъем FC соответствует диаметру хорошо, поэтому освещения образца на расстоянии D = 2,70 ± 0,20 мм. Свет выходит из волокна в воде (п = 1,33), что дает г = Тан (грех-1 (Na / N)) ∙ D.
- Используя последнее уравнение, вычислить радиус лазерного луча, соответствующей области пучка и средний лазерный освещенности (мощность лазера делится на области пучка) на цель (см Пример графика на рисунке 1b). Эти значения представляют собой среднее освещенности на освещенной области.
- Оценка ошибки для измерений с общей теории распространения ошибки.
Примечание: расстояние Вetween соединитель FC, и образец может быть измерена с помощью фотографий экспериментальной установки и пост-обработки изображения с использованием соответствующего программного обеспечения (например, ImageJ).
- В 5-й день, удалить дифференциации клеток среду из экспериментов и исправить образцы с 3,7% (объем / объем) раствора формальдегида в течение 10 мин, затем клетки проницаемыми с 0,1% (объем / объем) Triton X-100 в течение 20 мин.
- Добавить 3% (вес / объем) бычьим сывороточным альбумином (БСА) в образцах в течение 60 мин, чтобы блокировать непрореагировавшего белка сайты связывания. Добавьте образцы для анти-βIII-тубулина в течение ночи (5 мкг / мл в PBS с добавлением 1% BSA) при 4 ° С.
- Инкубируйте клетки в течение 90 мин в темноте с соответствующим вторичным антителом (например TRITC-конъюгированный против мышиного IgG антитела) с использованием концентрации 0,4-2 мкг / мл в 1% BSA в PBS. Этикетка клеточные ядра с DAPI (0,1 мкг / мл в деионизированной воды) в течение 10 мин.
Примечание: антитело сопряжение и концентрации МиГHT изменяются в соответствии с протоколом фирмы. Образцы для мойки с PBS в два раза в течение 5 мин после каждого этапа окрашивания.
- Образцы изображений по эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии с использованием по меньшей мере, 20 × цель. Выбор микроскопа фильтры соответственно с вторичным антителом. Выберите DAPI фильтр (λ ех = 358 нм; λ EM = 488 нм) для визуализации клеточных ядер.
- Анализ изображения путем оценки: I) максимальной длины нейритов (регистрационный длина от кончика нейритов в начале тела клетки), II) количество нейритов в нейронной клетки (суммировать все нейритов на клетку) и в) процент клеток с нейритов (разделить общее количество клеток, экспрессирующих βIII-тубулина на общее количество клеток с положительно окрашенного ядра) 19.
4. Лазерно-индуцированное внутриклеточного Са 2+ визуализации
Примечание: раствор ПБС могут быть получены заранее и в холодильнике в течение максимум 1 месяц. Добавить добавки (Fluo-4 утра и Pluronic F-127) на день эксперимента.
- Измерьте выходной мощности лазера со стандартным измерителем мощности. Вставьте света поставки волокна в оптическом волоконного держателя и прикрепить его к микроподвижки. Обратитесь к Brown и др. 20 для более подробной информации по оптическому подготовки волокна и позиционирования.
Внимание: соблюдать общие правила для лазерной безопасности во время измерения мощности лазерного излучения (например, не смотрите прямо на лазерный луч, носить очки лазерной безопасности во время обслуживания, предотвращения постороннего воздействия света на других пользователей Lab) <./ Li>
- Поместите клетки под перевернутой конфокальной микроскопии и положение светового доставки волокно 250 ± 50 мкм от клетки-мишени в режиме освещения передачи. В таком расстоянии, с помощью уравнений, представленных в 3.3.1, чтобы вычислить радиус луча на мишени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При использовании протоколов 1, 2 и 3, описанные здесь, стимулирующее действие на дифференциацию наблюдалось в NG108-15 нейрональных клеток, культивируемых с Au наночастиц (Au непальских, поли (стиролсульфонат) -покрытие Au NRS и диоксид кремния, покрытые Au NRS) после того, как лазер воздействия между 1,25 и 7,5 Вт · см -2. Конфокальные изображения rhodamineB-меченого Au NRS показали, что частицы интернализуется с 1-й день инкубации 12. Локализация преимущественно наблюдается в цитоплазме клеток, что указывает на предпочтительный механизм поглощения был через мембраны клеток тела 12. Основные морфологические изменения, обнаруженные после индукции дифференциации в NG108-15 нервных клеток были арест пролиферации, выражение βIII-тубулина белка и следствием невриты, которые были проанализированы с точки зрения максимальной длины и количества 22.
Образцы культивируют с NRS показал аксонов увеличение длины на лазерной irradiУровни ANCE измеренные здесь (между 1,25 и 7,5 Вт · см -2). Контрольные образцы (клетки, культивируемые без наночастиц и облучают с одной и той же мощности лазера) не показали значительное изменение в длине. Использование дозу облучения 7,5 Вт · см -2, окончательная длина аксонов из NG108-15 культивировали с Au НСП примерно на 36% выше (р <0,01), чем не-лазерного воздействия образцов. Такое поведение не было конкретно увязаны с поверхностной химии НСП. Эти значения были почти на 20% больше, чем невриты, разработанных NG108 -15 одиночку и подвергаются тем же значением лазерного воздействия (р <0,05) 12. Эти результаты находятся в соответствии с ранее опубликованных исследований по РС12 нервных клеток, культивируемых с пьезоэлектрическими нанотрубок и обрабатывают ультразвуком с излучением 7.
Контрольные эксперименты без Au NRS также показали некоторые стимулирующее действие на 780 нм света в процентном отношении нейронов с нейритов и количество пеurites на нейрон. Эта стимуляция была более эффективной при низких мощности лазера (1,25 Вт ∙ см -2) с последующим снижением на самом высоком лазерной энергии (7,5 Вт ∙ см -2) 12. Умеренное раздражение, вызванное НП без лазерного облучения (поли (стиролсульфонат) -покрытие и диоксид кремния, покрытые только) был обнаружен в процентах от нейронов с нейритов 12. Эти результаты находятся в соответствии с недавно опубликованным наблюдений, что золотые наночастицы могут увеличить активность нейронов в пробирке 23,24. Рисунок 2 показывает пример эпифлуоресцентной изображений дифференцированных NG108-15 нервных клеток, культивируемых в одиночку (Рисунок 2А) или с Au NRS (рис 2B ) и облучают с различными мощности лазера (показано на рисунке).
Потенциал для фото-генерируется внутриклеточного Ca 2+ выпуска оценивали с помощью импульсного NIR свет в соответствии с протоколами 1, 2, и4. Ионы кальция играют важную роль в различных клеточных деятельности, таких как митоза, сокращение мышц и расширение аксонов 25,26. В ответ на раздражитель, Са 2+ возрастает, осциллирует и уменьшается, что приводит к активации, модуляции или прекращения конкретной функции клеток. В последнее время, Са 2+ наблюдались также в результате лазерного воздействия ИК в кардиомиоцитах. В этой работе, ответы Са 2+ вызывало после ИК экспозиции выставлены низкие амплитуды и сокращение времени восстановления, чем в спонтанных Ca 2+ 2. Рисунок 3 показывает пример NG108-15 нервных клеток, нагруженных Fluo-4 утра и полученную с конфокальной микроскопии. Fluo-4 утра наблюдалось ввести через клеточную мембрану в не разрушительным образом, в результате чего, как правило равномерного распределения показателя через клеточную цитоплазму. Лишь незначительные окрашивания ядерной или цитоплазматической органеллы обнаружено не было. Как было указано ранее, Должны были непальских быть расположены внутри клеток 12. NG108-15 одни нервные клетки или культивированный с Au ЯРБ и поли (стиролсульфонат) -покрытие-Au непальских подвергались впоследствии лазерных уровнем излучения от 0,07 J ∙ см -2 и 370 J ∙ см -2, с лазерным частотной модуляцией в диапазоне 0,5-2 Гц.
На рисунке 4 показаны репрезентативные примеры того, как амплитуда откликов был картирован как функцию времени. Амплитуда Ca 2+ ответ варьировалась с энергетической экспозиции (фиг.4А - С) и не наблюдалось, чтобы быть последовательно вызваны лазерных импульсов (фиг.4С) 13. Наиболее вероятные объяснения были переходные истощение внутриклеточных Са 2+ магазинах отнести к неполной Ca 2+ нагрузку 2 или различной эффективности NR интернализации в нервных клетках. Когда непальских не были использованы в КУЛЬТУРАе (контрольные эксперименты, рис 4D), также наблюдалось стимулирующее действие на 780 нм светом. Тем не менее, это произвело более низкие пики амплитуды флуоресценции и меньшую вероятность активации (определяется только в 16% проанализированных образцов). В целом, 48% вероятность NR активации лазерно-индуцированной клеточной была достигнута, и, несмотря на фоновых событий в связи с 780-нм светом, экспозиция NR-обработанных клеток показали, высокую эффективность стимуляции нижней лазерной энергии и высоких пиков ответ 13. В самом деле, в ответ кальция было обнаружено пика при 0,33 Дж ∙ см -2 в NR-обработанных клеток. Это было связано с термической торможения 13. В ходе экспериментов, никаких свидетельств блеббинга или любой другой форме разрушения клеточной мембраны не было обнаружено, что согласуется с результатами Huang и соавт. Сообщили, что клеточный фотодеструкция с относительно высокой плотностью мощности 19 Вт ∙ см -2 применяться для 4 2 мин7. Нет спонтанной активности NR-обработанных клеток не была записана без лазерного воздействия.
Рисунок 1: Оптическое волокно экспериментальной установки (А) и средние лазерные облучённости в зависимости от мощности лазера для лазерного луча площади составляет 0,4 мм 2 (B). Параметры пучка (): половина угла максимальной конуса света, выходящего волокна (θ), радиус пучка (R) и расстояние между оптическим волокном и образцом (г).
Рисунок 2: Примеры эпифлуоресцентной изображений дифференцированных NG108-15 нервных клеток, культивируемых в одиночку () или с Au NRS (б) и облучали с различными мощности лазера (показано на рисунке). Образцы Incubated за один день до лазерного облучения. Клетки фиксировали и маркируется при анти-β-III тубулина (красный) и DAPI (синий) через три дня после лазерного облучения. Масштабные линейки 100 мкм.
Рисунок 3: Пример дифференцированных NG108-15 нервных клеток, нагруженных Fluo4-AM Ca 2+ индикатора снимок был сделан с использованием инвертированного конфокальной микроскопии с 40X нефти погружения цели..
Рисунок 4: Представительные примеры лазерно-индуцированных изменений Са2 + в зависимости от времени в NG108-15 нейрональных клеток, культивированных в бессывороточной условиях в течение трех дней с (А) поли (стиролсульфонат) Аи непальских, (В, С) Au непальских и (г), не NRS (контрольного образца). Эти результаты былиполучены с лазерными импульсами 100 мсек (A, C, D) и 50 мс (B). Частоты, используемые для экспериментов (пунктирные вертикальные линии) были 1 Гц (- C) и 0,5 Гц (D). Рассчитанные излучающие облучения были 69,4 J ∙ см -2 (), 34,7 J ∙ см -2 (B), 0,37 J ∙ см -2 (C) и 138,87 J ∙ см -2 (D). F макс / F 0 указывает на максимальное увеличение флуоресценции обнаружена в NG108 -15 нервных клеток, от калибровки иономицином (Воспроизводится с разрешения 13).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протоколы, изложенные в настоящей презентации описывается, как культуры, дифференцировать и оптически стимулировать нервные клетки с помощью примесные амортизаторы. В NR характеристики (например, размеры, форма, плазмонного резонанса длина волны и поверхностной химии) и параметры лазерной стимуляции (например, длины волны, длительности импульса, частоты повторения, и т.д.) могут быть изменены, чтобы соответствовать различным экспериментальным требованиям. Влияние на поведение клеток можно контролировать при помощи стандартных биологических анализов и материалы. В целом подход обеспечивает простой, но мощный, способ облучать клеточных популяций в пробирке и может быть продлен до первичных элементов, образцов тканей и в естественных условиях исследования.
Основные требования, что Au непальских необходимо удовлетворить, чтобы быть использованы для биологических применений являются стабильность (как химических, так и физических) и биосовместимость. Последнее особенно важно, из-за присутствия катионного поверхностно-активного вещества (общийлы СТАВ) на поверхности Au. СТАВ, как известно, вызывают цитотоксичность как в пробирке 28, а в естественных условиях 29 и широко используется в процессе синтеза для приведения в действие схему NR-формы 30. Стабильность и биосовместимость часто улучшена путем нанесения дополнительных покрытий на поверхности Au NR (например, полиэтиленгликоль, диоксид кремния) 31. Для оценки биологической совместимости, различные анализы могут быть использованы в пробирке (например, живой / мертвый, МТС, МТТ, и т.д.), а гистологическое исследование часто выполняется в ходе экспериментов ткани 7,8,12,15.
Еще одной проблемой сталкиваются при работе с наноматериалов трудность правильно определить их молярную концентрацию. Огромное разнообразие парков с точки зрения формы, размера и химических свойств делает методы в настоящее время доступна подходит только для некоторых классов частиц. Например, стандарт динамический свет СКАТТметод тч предполагает, что наночастицы имеют сферическую форму и рассеивают свет изотропно 17. Таким образом, применение этого метода к результатам Au ЯРБ в расхождениях между измеряемой концентрации и реального. Вопрос о концентрации НП особенно проблематичным, если относится к области нано, где концентрация вводить должна быть точно контролировать, чтобы максимизировать эффективность процесса (например, для применения доставки лекарств) и свести к минимуму токсичность наноматериалов 17. В исследованиях сообщалось здесь, оптическую плотность использовали дали хорошие результаты в плане жизнеспособности клеток и числа частиц.
Из-за их собственных свойств поглощения, Au НЧ часто используются в комбинации с источником лазерного. Во время экспозиции, поглощения и рассеяния являются два основных процесса может произойти на поверхности НПС. Если длина волны лазера соответствует плазмонного резонанса волны, поглощение частопреобладает над рассеянием, захватывающие электроны проводимости на поверхности НЧ. Они образуют электронный газ, который отходит от своего равновесного положения и создает резонансного когерентного колебания называют локализованное поверхностного плазмонного резонанса (LSPR). Затем энергия передается кристаллической решетке в виде тепла НП, который затем быстро рассеивается в окружающую среду 32. Поскольку тепло основной эффект наблюдается после возбуждения NR LSPR, желательно следить за жизнеспособность клеток после лазерного воздействия.
Было высказано предположение, что наблюдаемые эффекты на рост аксонов и внутриклеточного Ca 2+ пути были связаны с переходным отопления, вытекающие из возбуждения LSPR. Эта гипотеза в соответствии с активацией термочувствительной TRPV1 канала после воздействия магнитного ферритовых наночастиц 5. Этот процесс также согласуется с наблюдениями, что термически чувствительных TRPV4 каналы плау важную роль в инфракрасном нерва 33. На молекулярном уровне, недавно было показано, что TRPV4 является термочувствительным только после взаимодействия фосфоинозитид -4,5 -biphosphate (PIP 2) с каналом 34. Таким образом, вполне возможно, что переходный нагрева, возникающие при возбуждении NR может служить для ускорения и / или индуцируют открытие TRPV4 каналов. Эта гипотеза может быть подтверждена будущих экспериментов Ca 2+ с помощью Ca 2+ - без средних и / или молекулярные контроль за истощения PIP 2.
Различные группы также показали, что небольшие температурные градиенты более физиологическом диапазоне температур может быть использован, чтобы вызвать другие ответы, такие как конус роста нейронов направления 25 или деполяризации токи в эмбриональных клеток почек человека 35. Юн и коллеги зафиксировано значительное увеличение электрической активности сигнала в первичной слуховой нейронов культаряться с диоксидом кремния с покрытием Au NRS после лазерного облучения НСП на LSPR. Отопление, образуемых частицами лазерного воздействия измеряли с использованием методов патч-зажим 14. Совсем недавно МНВ др. Отмечено увеличение амплитуды CNAPs после лазерного облучения 3,4 × 10 9 Au NRS при непрерывной перфузии в непосредственной близости от оболочки нервного пучка крыс седалищного нерва 15.
Стимулирующий эффект на 780 нм лазерный диод, наблюдаемой в ходе экспериментов не было связано с тепло от поглощения воды, так как это, как известно, можно пренебречь при 780 нм 36. Ранее опубликованные результаты также сообщил, стимулирующее действие 780 нм свет на нервной ткани в естественных условиях 37,38. Исследования в пробирке показали участие активных форм кислорода в процессе 39. Однако подробные механизмы, посредством которых БИК стимуляции влияет ген transcriptioп и другие клеточные деятельность в настоящее время не решен. Текущие данные свидетельствует о взаимосвязи различных эффектов в стимуляции, в том числе поглощения фотонов в хромофоров в митохондриях (почти 50% энергии на 780 нм может быть поглощена цитохром с-оксидазы) 37,39-41, изменения в проницаемости мембран для кальция 37 и ингибирование воспалительной активности в клетках 37.
Результаты, представленные в этой рукописи показывают, что наночастицы поглотители открывают огромные перспективы для будущих применений в оптической стимуляции нервных клеток. Основное преимущество заключается в способности БИК света проникать глубоко в ткани (терапевтическое окно). Эти результаты также показывают, что наночастицы могут улучшить поглотители и / или заменить процесс инфракрасного нейронной стимуляции на основе поглощения воды. Для будущих применений в нервных протезов, было бы интересно исследовать различные поверхности functionalizatионы с химическим сродством к аксонов, которые являются основными мишенями для многих приложений оптических стимуляции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность NanoVentures Австралии за финансовую поддержку Путешествия и профессор Джон копны за то, что частично состоялся эти исследования в Университете Шеффилда и г-жа Джейми Майн за помощь во время съемок.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Au NR | Sigma Aldrich | 716812 | |
| NG108-15 | Sigma Aldrich | 8811230 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6546 | |
| FCS | Life Technologies | 10100147 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290018 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Triton X-100 | BDH | T8532 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2058 | |
| Anti-βIII-tubulin | Promega | G7121 | |
| TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody | Sigma Aldrich | T5393 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 472301 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| UV-Vis spectrometer | Varian Medical Systems Inc. | Cary 50 Bio | |
| Mini centrifuge | Eppendorf | Mini Spin | |
| Sonic bath | Unisonics Australia | FPX 10D | |
| Cell culture incubator | Kendro | Hera Cell 150 | |
| Cell culture centrifuge | Hettich | Rotofix 32A | |
| Laser diode | Optotech | 780 nm single mode fibre - coupled LD | |
| Optical fiber | Thorlabs | 780 HP | |
| Power meter | Coherent | Laser Check | |
| ImageJ | http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html | ||
| Epifluorescent microscope | Axon Instruments | ImageX-press 5000A | |
| μ-slide well | Ibidi | 80826 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy Ltd. | LSM 510 meta-confocal microscope | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS210 |
References
- Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser. Photonics Rev. 5 (1), 68-80 (2011).
- Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. J. Physiol. 589 (6), 1295-1306 (2011).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 17 (7), 075002-075002 (2012).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G., Stoddart, P. R. Modeling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18 (3), 035004 (2013).
- Huang, H., Delikanli, S., Zeng, H., Ferkey, D. M., Pralle, A. Remote control of ion channels and neurons through magnetic-field heating of nanoparticles. Nat. Nanotechnol. 5 (8), 602-606 (2010).
- Farah, N., et al. Holographically patterned activation using photo-absorber induced neural-thermal stimulation. J. Neural. Eng. 10 (5), (2013).
- Ciofani, G., et al. Enhancement of neurite outgrowth in neuronal-like cells following boron nitride nanotube-mediated stimulation. ACS Nano. 4 (10), 6267-6277 (2010).
- Kim, J. A., et al. Enhancement of neurite outgrowth in PC12 cells by iron oxide nanoparticles. Biomaterials. 32 (11), 2871-2877 (2011).
- Myroshnychenko, V., et al. Modelling the optical response of gold nanoparticles. Chem. Soc. Rev. 37 (9), 1792-1805 (2008).
- Choi, W. I., Sahu, A., Kim, Y. H., Tae, G. Photothermal cancer therapy and imaging based on gold nanorods. Ann. Biomed. Eng. 40 (2), 534-546 (2011).
- Zhan, Q., Qian, J., Li, X., He, S. A study of mesoporous silica-encapsulated gold nanorods as enhanced light scattering probes for cancer cell imaging. Nanotechnology. 21 (5), 055704 (2010).
- Paviolo, C., et al. Laser exposure of gold nanorods can increase neuronal cell outgrowth. Biotechnol. Bioeng. 110 (8), 2277-2291 (2013).
- Paviolo, C., Haycock, J. W., Cadusch, P. J., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. Laser exposure of gold nanorods can induce intracellular calcium transients. J. Biophotonics. 7 (10), 761-765 (2014).
- Yong, J., et al. Gold-nanorod-assisted near-infrared stimulation of primary auditory neurons. Adv. Healthcare Mater. , (2014).
- Eom, K., et al. Enhanced infrared neural stimulation using localized surface plasmon resonance of gold nanorods. Small. , (2014).
- Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marzán, L. M., Mulvaney, P. Gold nanorods: Synthesis, characterization and applications. Coordination Chemistry Reviews. (17-18), 1870-1901 (2005).
- Shang, J., Gao, X. Nanoparticle counting: towards accurate determination of the molar concentration. Chem. Soc. Rev. 43 (21), 7267-7278 (2014).
- Sharma, V., Park, K., Srinivasarao, M. Shape separation of gold nanorods using centrifugation. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (13), 4981-4985 (2009).
- Kaewkhaw, R., Scutt, A. M., Haycock, J. W. Anatomical site influences the differentiation of adipose-derived stem cells for schwann-cell phenotype and function. Glia. 59 (5), 734-749 (2011).
- Brown, W. G. A., Needham, K., Nayagam, B. A., Stoddart, P. R. Whole cell patch clamp for investigating the mechanisms of infrared neural stimulation. JoVE. (77), (2013).
- Cadusch, P. J., Hlaing, M. M., Wade, S. A., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. Improved methods for fluorescence background subtraction from Raman spectra. J. Raman Spectrosc. 44 (11), 1587-1595 (2013).
- Daud, M. F. B., Pawar, K. C., Claeyssens, F., Ryan, A. J., Haycock, J. W. An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies. Biomaterials. 33 (25), 5901-5913 (2012).
- Jung, S., et al. Intracellular gold nanoparticles increase neuronal excitability and aggravate seizure activity in the mouse brain. PLoS ONE. 9 (3), e91360 (2014).
- Salinas, K., Kereselidze, Z., DeLuna, F., Peralta, X., Santamaria, F. Transient extracellular application of gold nanostars increases hippocampal neuronal activity. J. Nanobiotechnology. 12 (1), 31 (2014).
- Ebbesen, C. L., Bruus, H. Analysis of laser-induced heating in optical neuronal guidance. J. Neurosci. Meth. 209 (1), 168-177 (2012).
- Iwanaga, S., et al. Location-dependent photogeneration of calcium waves in HeLa cells. Cell Biochem. Biophys. 45 (2), 167-176 (2006).
- Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Determination of the minimum temperature required for selective photothermal destruction of cancer cells with the use of immunotargeted gold nanoparticles. Photochem. Photobiol. 82 (2), 412-417 (2006).
- Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 1 (3), 325-327 (2005).
- Isomaa, B., Reuter, J., Djupsund, B. M. The subacute and chronic toxicity of cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), a cationic surfactant, in the rat. Arch. Toxicol. 35 (2), 91-96 (1976).
- Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marzán, L., Mulvaney, P. Gold nanorods: synthesis, characterization and applications. Coord. Chem. Rev. 249 (17-18), 1870-1901 (2005).
- Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chem. Soc. Rev. 41 (7), 2740-2779 (2012).
- Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold nanoparticles. Lasers Med. Sci. 23 (3), 217-228 (2008).
- Albert, E. S., et al. TRPV4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. J. Neurophysiol. 107 (12), 3227-3234 (2012).
- Garcia-Elias, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate-dependent rearrangement of TRPV4 cytosolic tails enables channel activation by physiological stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9553-9558 (2013).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nat. Commun. 3 (736), (2012).
- Roggan, A., Friebel, M., Dörschel, K., Hahn, A., Müller, G. Optical properties of circulating human blood in the wavelength range 400-2500 nm. J. Biomed. Opt. 4 (1), 36-46 (1999).
- Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers Surg. Med. 36 (3), 171-185 (2005).
- Wu, X., et al. 810 nm wavelength light: an effective therapy for transected or contused rat spinal cord. Lasers Surg. Med. 41 (1), 36-41 (2009).
- Grossman, N., Schneid, N., Reuveni, H., Halevy, S., Lubart, R. 780 nm low power diode laser irradiation stimulates proliferation of keratinocyte cultures: involvement of reactive oxygen species. Lasers Surg. Med. 22 (4), 212-218 (1998).
- Wong-Riley, M. T. T., et al. Photobiomodulation directly benefits primary neurons functionally inactivated by toxins - Role of cytochrome c oxidase. J. Biol. Chem. 280 (6), 4761-4771 (2005).
- Beauvoit, B., Kitai, T., Chance, B. Contribution of the mitochondrial compartment to the optical properties pf the rat liver: a theoretical and practical approach. Biophys. J. 67 (6), 2501-2510 (1994).
