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Developmental Biology

ट्यूमर रोगजनन में उम्मीदवार सहकारी जीन की कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण के लिए मोज़ेक Zebrafish transgenesis

Published: March 31, 2015 doi: 10.3791/52567
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 1,3
1Department of Molecular Pharmacology & Experimental Therapeutics, Mayo Clinic College of Medicine, Center for Individualized Medicine, 2Tufts University School of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic

Introduction

कैंसर समय के साथ वैकृत म्यूटेशन, विलोपन और गुणसूत्र लाभ के संचय के द्वारा चिह्नित प्रगतिशील रोगों हैं। ये आनुवंशिक असामान्यताएं ऐसे हाइपोक्सिया के रूप में प्रतिक्रियाओं तनाव की cytoskeleton की कोशिका चक्र, कोशिका मृत्यु, ऊर्जावान चयापचय और विधानसभा से लेकर कई सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, tumorigenesis जैविक प्रक्रियाओं की एक स्पेक्ट्रम भर में कई आनुवंशिक aberrations के सामूहिक कार्यों को दर्शाता है। पूरे जीनोम अनुक्रमण, exome अनुक्रमण, लक्षित अनुक्रमण, गहरी अनुक्रमण और जीनोम चौड़ा संघ अध्ययन सहित हाल एकीकृत जीनोमिक अनुसंधान के प्रयासों, ट्यूमर 1-4 की अनिवार्य रूप से सभी प्रकार के उपन्यास आनुवंशिक परिवर्तन की बढ़ती संख्या की पहचान की है। कई उदाहरणों में, आनुवंशिक घावों रोग रोगजनन में उनके सहयोग, सुझाव एक nonrandom ढंग 5-8 में एक साथ होते हैं। एफ जिसके परिणामस्वरूप aberrantly व्यक्त जीनों के बड़े सरणी के oncogenic भूमिकाओं विदारकइन जीनोमिक घावों ROM नयी चिकित्सकीय रणनीति वसीयत करने के लिए और इन एजेंटों को ट्यूमर कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं को समझने के लिए आवश्यक है, लेकिन इस उच्च throughput कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण के संचालन में के लिए बहुत मजबूत पशु मॉडल प्रणाली की आवश्यकता होती है, एक चुनौतीपूर्ण काम साबित हुई है विवो।

स्तनधारी, विशेष रूप से कृन्तकों, कैंसर जीव विज्ञान में इष्ट मॉडल हैं हालांकि, zebrafish काफी ध्यान आकर्षित करने के लिए शुरू हो गया है। teleost zebrafish (दारियो rerio) 1960 के दशक के बाद से विकास अध्ययन के लिए एक मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल किया गया है और पहली बार 1982 9-11 में ट्यूमर रोगजनन के अध्ययन के लिए लागू किया गया था। रखरखाव, छोटे शरीर के आकार, और उच्च उपजाऊपन की आसानी zebrafish असामान्य और रोग phenotypes के 10 प्रदान कि म्यूटेशन की पहचान करने के लिए बड़े पैमाने पर आगे आनुवंशिक स्क्रीन के लिए एक मजबूत मॉडल बनाते हैं। zebrafish भ्रूण के ऑप्टिकल पारदर्शिता के रूप में, इस कैंसर मॉडल के व्यापक उपयोग का समर्थन एक और महत्वपूर्ण विशेषता हैयह वास्तविक समय 9 में कृन्तकों 12 में अपेक्षाकृत कठिन है कि एक आवेदन ट्यूमर के विकास का पता लगाने के लिए ही किया जा सकता vivo इमेजिंग में अनुमति देता है। Zebrafish संदर्भ जीनोम (Zv9) की हाल ही में तुलनात्मक जीनोमिक्स विश्लेषण, 71% 82% मैन (OMIM) डाटाबेस 13 में ऑनलाइन मेंडेलियाई विरासत में रोग से जुड़े जीन के साथ सहसंबद्ध होते हैं, जिनमें से मानव orthologues, होने के साथ 26,206 प्रोटीन कोडिंग जीन का पता चला 14। नतीजतन, zebrafish neuroblastoma 8 सहित मानव कैंसर के विविध प्रकार के मॉडल के लिए इस्तेमाल किया गया है, टी सेल तीव्र लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया (टी सभी) 15,16, मेलेनोमा 17,18, इविंग सारकोमा 19, rhabdomyosarcoma 20,21, अग्नाशय कार्सिनोमा 22 हेपैटोसेलुलर कार्सिनोमा 23 और माइलॉयड 24,25 malignancies, और xenotransplantation के लिए एक कैंसर मॉडल 11,26 अध्ययन के रूप में चयनित किया गया है।

एक स्थिर ट्रांसजेनिकzebrafish में दृष्टिकोण आमतौर पर लाभ के समारोह सामान्य विकास या रोग रोगजनन 27,28 में जीन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस तरह के एक मॉडल (चित्रा 1 ए) को विकसित करने के लिए, एक एक सेल जंगली प्रकार भ्रूण में एक ऊतक विशेष प्रमोटर द्वारा संचालित ब्याज की जीन से युक्त एक डीएनए का निर्माण injects। इंजेक्शन भ्रूण यौन परिपक्वता तक पहुँचने जब तीन चार महीने के इंजेक्शन के बाद, वे संस्थापक मछली के रूप में उन्हें लाइसेंस जो उनके germline में निर्माण डीएनए के एकीकरण दिखा लोगों के लिए स्क्रीन करने के लिए जंगली प्रकार मछली के साथ outcrossed कर रहे हैं। ऐसे प्रतिलिपि संख्या और transgene की एकीकरण साइट के रूप में कई कारकों, स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों में transgene की अभिव्यक्ति प्रभावित करते हैं। इस प्रकार, एक ट्रांसजेनिक ट्यूमर मॉडल विकसित करने के लिए, एक एकल ओंकोजीन overexpressing कई स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों पहले उत्पन्न होता है और ट्यूमर प्रेरण का कारण हो सकता है कि एक स्तर पर transgene व्यक्त लाइन के लिए जांच की जानी है। हालांकि, अगर एक उम्मीदवार ओ की overexpressionncogene रोगाणु कोशिकाओं को विषाक्त है, यह सीधे transgene 29 overexpressing द्वारा एक स्थिर ट्रांसजेनिक लाइन उत्पन्न करने के लिए मुश्किल है। इसलिए, इस दृष्टिकोण एक उपयुक्त कैंसर मॉडल उत्पन्न करने के लिए विफलता का एक उच्च जोखिम के साथ, समय लेने वाली हो सकती है।

यहाँ, हम vivo में कार्यात्मक जीनोमिक अध्ययन के लिए पारंपरिक स्थिर transgenesis से अधिक अद्वितीय लाभ प्रदान करता है कि मोज़ेक क्षणिक transgenesis (चित्रा 1 बी) के आधार पर एक वैकल्पिक रणनीति वर्णन। इस दृष्टिकोण में, एक या एक से अधिक transgene निर्माणों ट्रांसजेनिक या जंगली प्रकार भ्रूण की एक सेल चरण में इंजेक्ट किया जाता है। ट्रांसजीन युक्त इंजेक्शन के डीएनए निर्माणों व्यक्ति मछली 30 में कई सेल आबादी के भीतर मिश्रित जीनोटाइप में जिसके परिणामस्वरूप, तो mosaically और बेतरतीब ढंग से प्राथमिक इंजेक्ट मछली में एकीकृत कर रहे हैं। इसके अलावा, कई डीएनए के coinjection एक सेल भ्रूण में constructs सह-एकीकरण के लिए यादृच्छिक स्थलों पर एक ही सेल में, टीआरए के लिए एक की अनुमति के लिए सुरागtransgenes की अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं सीई और मोज़ेक जानवरों 31 में रोग रोगजनन के दौरान विभिन्न जीनों की बातचीत का पता लगाएं। सिद्धांत के सबूत के रूप में, हम क्षणिक जंगली प्रकार मछली और MYCN overexpressing ट्रांसजेनिक मछली में डोपामाइन बीटा hydroxylase (डी βh) प्रमोटर के नियंत्रण के तहत परिधीय सहानुभूति तंत्रिका तंत्र (PSNS) में mCherry रिपोर्टर जीन के साथ mutationally सक्रिय ALK (F1174L) overexpressed। एक रिसेप्टर tyrosine kinase encodes जो ALK, उच्च जोखिम neuroblastoma 5-7,32,33 में सबसे अधिक बार उत्परिवर्तित जीन है। ALK सबसे लगातार और प्रबल दैहिक को सक्रिय करने के म्यूटेशन से एक के रूप में (F1174L), में प्रतिनिधित्व पर- है MYCN- उच्च जोखिम neuroblastoma रोगियों प्रवर्धित और स्थिर ट्रांसजेनिक चूहों और ट्रांसजेनिक zebrafish मॉडल 8,34,35 दोनों में neuroblastoma tumorigenesis में तेजी लाने के MYCN overexpression के साथ synergizes। मोज़ेक तकMYCN ट्रांसजेनिक मछली में mCherry साथ ALK (F1174L) के क्षणिक overexpression, हम मोज़ेक transgenesis रणनीति के लिए तेजी से और कुशलता से इस्तेमाल किया जा सकता है, सुझाव है कि ALK (F1174L) और MYCN दोनों overexpressing स्थिर ट्रांसजेनिक मछली में मनाया ट्यूमर शुरुआत के त्वरण recapitulated vivo में ट्यूमर दीक्षा में कई ओंकोजीन के रिश्तेदार योगदान का आकलन करें।

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Protocol

नोट: सभी zebrafish अध्ययन और पशुओं के रखरखाव के मेयो क्लीनिक संस्थान IACUC को मंजूरी दी प्रोटोकॉल # A41213 के साथ समझौते में किया गया था।

Transgenesis के लिए 1. डीएनए constructs

  1. एक डीएनए टेम्पलेट के रूप में (BACPAC संसाधन केंद्र (BPRC) से) CH211-270H11 बीएसी क्लोन का उपयोग कर एक 5.2-केबी डोपामाइन बीटा hydroxylase (डी βh) प्रमोटर क्षेत्र 8 बढ़ाना। 2 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस (94 डिग्री सेल्सियस, 15 सेकंड, 50 डिग्री सेल्सियस के 10 चक्र 30 सेकंड, 68 °: लंबे समय से डीएनए टेम्पलेट्स के लंबे और सटीक पीसीआर प्रवर्धन के लिए एक पीसीआर प्रणाली उपयुक्त और पीसीआर के लिए निम्नलिखित चक्र कार्यक्रमों का प्रयोग करें (94 डिग्री सेल्सियस, 15 सेकंड, 53 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड, 68 डिग्री सेल्सियस, 8 मिनट), 68 डिग्री सेल्सियस, 4 मिनट (आगे प्राइमर 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 'के 30 चक्रों के बाद सी, 8 मिनट), और रिवर्स प्राइमर 5'- GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 ')।
  2. डी βh -pDONRP4-P1R प्रविष्टि clo के बनाएँपूर्वोत्तर के आठ ऐसे एकाधिक प्रवेश द्वार के रूप में वाणिज्यिक पुनः संयोजक क्लोनिंग प्रणाली का उपयोग करते हुए। शुद्ध dβh पीसीआर उत्पाद (172 एनजी / μl), 1 μl (150 एनजी / μl) pDONRP4-P1R दाता वेक्टर के एक μl मिक्स (अन्य प्रवेश द्वार वैक्टर डॉ ची-बिन चिएन, विश्वविद्यालय से उदार उपहार हैं एक साथ के साथ। यूटा) , ते बफर (8.0 पीएच) बी.पी. clonase एंजाइम मिश्रण के 2 μl साथ के 4 μl, 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं और फिर एक शॉट top10 सक्षम ई बदलना कोलाई निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार।
  3. उत्पन्न डी βh: EGFP-MYCN ट्रांसजेनिक 1.2 चरण में उल्लेख 8 का उपयोग कर पुनः संयोजक क्लोनिंग प्रणाली का निर्माण। प्रत्येक प्रविष्टि के क्लोन के एक μl एक 5.2-केबी dβh प्रमोटर (dβh -pDONR पी 4-P1R निर्माण), EGFP के एक बंद कोडोन (PME-EGFP के निर्माण) की कमी सहित (150 एनजी / μl), और मानव MYCN सीडीएनए मिश्रण (एक उदार उपहार डॉ Hogarty से पेन्सिलवेनिया के बच्चों के अस्पताल में, MYCN-pDONRP2R-पी 3 का निर्माण), 1 μl मैं-SCEI मान्यता साइटों (डॉ सी Grabher, कार्लज़ूए प्रौद्योगिकी संस्थान, कार्लज़ूए, जर्मनी) से एक उदार उपहार, ते बफर के 4 μl युक्त संशोधित गंतव्य वेक्टर के (150 एनजी / μl) ( एलआर Clonase एंजाइम मिश्रण के 2 μl के साथ 8.0 पीएच), 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं और फिर परिणत रासायनिक सक्षम ई करने के लिए कोलाई जैसे एक शॉट शीर्ष 10 और निर्माता प्रोटोकॉल का पालन करें।
  4. Mitf बनाओ: mitf ट्रांसजेनिक PNP-mitf वेक्टर पचाने द्वारा 8 निर्माण चना और साली प्रतिबंध एंजाइमों के साथ दो घंटे के लिए आरटी पर, और जारी 2.65-केबी subcloning द्वारा (डॉ डी Raible, विश्वविद्यालय से एक उदार उपहार वाशिंगटन।) mitf प्रमोटर और flanking मैं-SCEI मान्यता साइटों से युक्त एक संशोधित pBluescript वेक्टर के चना और MluI साइटों में zebrafish mitf जीन की कोडिंग अनुक्रम में शामिल है कि डीएनए टुकड़ा (डॉ हुई फे से एक उदार उपहारएनजी, बोस्टन विश्वविद्यालय), निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार टी -4 डीएनए ligase का उपयोग कर।
    नोट: स्थिर MYCN -expressing लाइनों पैदा करने की क्षमता में वृद्धि करने के लिए, डी βh: EGFP-MYCN और mitf:। Mitf डीएनए निर्माणों एक सेल चरण सीप भ्रूण में coinjected रहे हैं सीप एक तंत्रिका कमी उत्परिवर्ती मछली का एक प्रकार designates शिखा व्युत्पन्न विकास 36 के दौरान melanophore। इस प्रकार, इंजेक्शन भ्रूण में वर्णक कोशिकाओं की उपस्थिति mitf के एकीकरण से पता चलता है: mitf डीएनए जीनोम में निर्माण करती है। यह दो या तीन coinjected डीएनए निर्माणों मछली जीनोम 31 में cointegrated जा सकता है कि प्रदर्शन किया गया है। EGFP-MYCN transgene और MYCN स्थिर ट्रांसजेनिक लाइन की आसान पहचान के लिए: इस प्रकार, mitf अभिव्यक्ति की वजह से रंजकता एक dβh के एकीकरण के लिए मार्कर के रूप में सेवा कर सकते हैं।
  5. EGFP-MYCN और mitf: डी βh मिक्स mitf डीएनएमैं-SCEI एंजाइम की एक μl और बफर के 0.75 μl के साथ एक 15 μl प्रतिक्रिया की कुल मात्रा में: 1 के अनुपात में एक 3 पर निर्माणों। प्रतिक्रिया में डीएनए की कुल राशि 750 एनजी से अधिक नहीं है कि सुनिश्चित करें।
  6. 4 घंटा या हे / N के लिए आरटी पर मैं-SCEI पाचन बाहर ले। दूसरे दिन, मैं-SceI- DNAs microinjection के लिए तैयार हैं या भविष्य में इंजेक्शन के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता पच। इसके एंजाइम दक्षता बनाए रखने के लिए छोटे aliquots में -80 डिग्री सेल्सियस पर मैं-SCEI एंजाइम स्टोर।
  7. डॉ सी Grabher से (एक उदार उपहार एक pENTRY1A वेक्टर के EcoRI और चना साइटों में PCDNA3 वेक्टर से मानव ALKF1174L और जंगली प्रकार ALK जीन (दाना-फार्बर कैंसर संस्थान में डॉ जॉर्ज से एक उदार उपहार) 7 Subclone, कार्लज़ूए प्रौद्योगिकी संस्थान, कार्लज़ूए, जर्मनी) निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार टी -4 डीएनए ligase का उपयोग कर।
  8. डी βh उत्पन्न: ALKF1174L </ उन्हें> या dβh: प्रोटोकॉल 1.2 में वर्णित के रूप में पुनः संयोजक प्रणाली का उपयोग कर ALKWT ट्रांसजेनिक निर्माणों। संक्षेप में, तीन प्रविष्टि क्लोन गठबंधन, dβh -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (या ALKWT -pENTRY1A) और p3E-Pólya, मैं-SCEI मान्यता साइटों (डॉ सी Grabher, कार्लज़ूए से एक उदार उपहार युक्त संशोधित गंतव्य वेक्टर में प्रौद्योगिकी संस्थान, कार्लज़ूए, जर्मनी), निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार, एलआर Clonase एंजाइम मिश्रण का उपयोग।
  9. मिक्स डी βh: ALKF1174L (या dβh: ALKWT) और dβh: mCherry डीएनए 3 में constructs: 1 के अनुपात और प्रोटोकॉल 1.5-1.6 में वर्णित के रूप में मैं-SCEI एंजाइम के साथ उन्हें linearize।

2. Microinjection

  1. सभी इंजेक्शन 37 के लिए 1.0 मिमी व्यास के साथ कांच micropipettes का प्रयोग करें। इंजेक्शन से पहले एक धार के साथ कांच micropipettes की नोक बंद तोड़ने। सुई से इंजेक्शन की मात्रा जांचनाखनिज तेल की एक बूंद में एच 2 ओ आईएनजी। जिसके परिणामस्वरूप बूंदों के व्यास मापने के लिए और इंजेक्शन की मात्रा एक सेल चरण भ्रूण की कुल सेल की मात्रा का 10% से कम है कि यह सुनिश्चित करने के लिए microinjector (दबाव या दबाव नाड़ी की अवधि) समायोजित करें।
  2. डीएनए युक्त इंजेक्शन समाधान के 5 μl में ताजा मैं-SCEI एंजाइम (5 यूनिट / μl) के एक अतिरिक्त 0.5 μl जोड़ें इंजेक्शन transgenesis 38 की दक्षता बढ़ाने के लिए सही से पहले निर्माण करती है। एक सेल चरण भ्रूण के cytoplasm में linearized डीएनए निर्माणों की 50-80 पीजी इंजेक्षन। इंजेक्शन की सफलता सुनिश्चित करने के लिए, दृश्य के लिए 0.25% फिनोल लाल के साथ नमूना मिश्रण। कोशिकाओं इंजेक्शन के बाद लाल बारी, यह microinjection के सफल है इंगित करता है। ट्रांसजेनिक मछली पैदा करने के लिए एक उच्च सफलता दर सुनिश्चित करने के लिए, हम आम तौर पर के रूप में कई के रूप में 500 भ्रूण इंजेक्षन।
  3. EGFP-MYC: stably MYCN व्यक्त ट्रांसजेनिक मछली उत्पन्न करने के लिए, linearized डी βh coinjectएन और mitf: mitf डीएनए निर्माणों (3: 1 अनुपात) एक सेल मंच पर रंजकता उत्परिवर्ती सीप zebrafish के भ्रूण में। Mitf की अभिव्यक्ति मछली जीनोम में ट्रांसजेनिक निर्माणों के एकीकरण के लिए एक पत्रकार के रूप में कार्य करता है।
  4. Dβh साथ: ALK F1174L (ALKWT या dβh:): जंगली प्रकार या MYCN ट्रांसजेनिक भ्रूण में ALK की पच्चीकारी overexpression के लिए, linearized डी βh सह इंजेक्षन एक सेल में: mCherry डीएनए (1 अनुपात 3 पर) constructs जंगली प्रकार अटल बिहारी मछली के साथ ट्रांसजेनिक मछली: एफ 1 विषमयुग्मजी टीजी (EGFP-MYCN dβh) के प्रजनन से उत्पन्न भ्रूण। इस प्रकार, वंश के आधे MCYN के लिए ट्रांसजेनिक हैं और आधा जंगली प्रकार के होते हैं।

स्थिर या मोज़ेक ट्रांसजेनिक मछली के लिए 3. स्क्रीन

  1. Tricaine (0.02%) एक के साथ मुख्य रूप से इंजेक्शन सीप भ्रूण anesthetize, स्थिर MYCN -expressing लाइनों की पहचान की दक्षता बढ़ाने के लिएटी दिनों रंजकता के लिए postfertilization और स्क्रीन के 3-5। जर्म कोशिकाओं में EGFP MYCN transgene: डी βh जो ले संस्थापक मछली, के लिए आगे जांच के लिए यौन परिपक्वता के लिए उन्हें नए सिरे से अंडे पानी के साथ एक नया पेट्री डिश के लिए रंजकता के साथ भ्रूण स्थानांतरण और बढ़ा।
  2. EGFP-MYCN, आगे जीनोटाइपिंग के लिए 1-2 दिनों के बाद निषेचन में EGFP पॉजिटिव भ्रूण के लिए जंगली प्रकार अटल बिहारी मछली और स्क्रीन के साथ outcross पिगमेंटड F0 वयस्क मछली की germline ट्रांसमिशन के साथ संस्थापक की पहचान करने के लिए। एक पीसीआर ट्यूब में एक भी EGFP पॉजिटिव एफ 1 भ्रूण प्लेस और सभी तरल हटा दें। 4x lysis बफर के 12.5 μl, 35 μl एच 2 हे और 2.5 μl proteinase कश्मीर एकल भ्रूण के लिए (10 मिलीग्राम / एमएल) शामिल है जो gDNA निष्कर्षण बफर के 50 μl जोड़ें। , 4x lysis बफर के 50 मिलीलीटर बनाने के लिए लालकृष्ण proteinase निष्क्रिय करने के लिए 98ºC पर ऊष्मायन के 10 मिनट के द्वारा पीछा 55 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 घंटे के लिए प्रतिक्रिया, सेते 1M Tris के 500 μl जोड़ने (पीएच 8.4), 2.5 मिलीलीटर 1M की KCl टीएच 2 ओ ओ 47 मिलीलीटर नोट: F0 MYCN स्थिर ट्रांसजेनिक मछली जंगली प्रकार अटल बिहारी मछली के साथ पैदा कर रहे हैं के बाद, वंश के सभी पिगमेंटड हैं। इस प्रकार, रंजकता MYCN- सकारात्मक मछली की पहचान के लिए मार्कर के रूप में काम नहीं कर सकते। MYCN ट्रांसजेनिक मछली में रहते हुए, EGFP-MYCN संलयन प्रोटीन इस तरह के और मज्जा मज्जा के रूप में बेहतर ग्रीवा ganglia और सहानुभूति श्रृंखला के अनुक्रमिक कमानी नाड़ीग्रन्थि और गैर PSNS डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की सहानुभूति न्यूरॉन्स, सहित PSNS में व्यक्त किया जाता है कपाल गैन्ग्लिया 8। इस प्रकार, EGFP के अभिव्यक्ति MYCN स्थिर ट्रांसजेनिक भ्रूण की पहचान के लिए एक मार्कर के रूप में सेवा कर सकते हैं।
  3. , टेम्पलेट के रूप में पिगमेंट F1 के भ्रूण से निकाले gDNA के 2 μl का प्रयोग करें MYCN प्राइमरों -test एफ 1: 5'-CTG सीटीटी भूमिकाः एएसी भूमिकाः CTG टीजी-3 '; MYCN -R3: 5'-AGG कैट CGT टीटीजी AGG एटीसी एजी -3 ', और निम्न कार्यक्रम बुद्धिएच जी सी युक्त पीसीआर सिस्टम: 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के एक चक्र, 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 25 चक्र, 30 सेकंड के लिए 58 डिग्री सेल्सियस, और 3 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस। आम तौर पर हम पिगमेंटड भ्रूण में एकीकृत MYCN transgene की उपस्थिति, mitf और MYCN overexpressing अधिक से अधिक 6 संस्थापक मछली इस विधि द्वारा की पहचान की गई पुष्टि करने के लिए एक एकल संभोग से 14-16 पिगमेंटड भ्रूण जीनोटाइप।
  4. EGFP पॉजिटिव F1 के भ्रूण के शेष के ऊपर उठाएँ। फिन क्लिप आगे मछली में MYCN transgene की एकीकरण की पुष्टि करने के लिए ऊपर प्रोटोकॉल का उपयोग उम्र के 2-3 महीने में उन्हें जीनोटाइप और। एफ 1 MYCN जंगली प्रकार अटल बिहारी मछली के साथ स्थिर ट्रांसजेनिक मछली नस्ल। ALK F1174L (या dβh: ALKWT) dβh साथ: linearized डी βh सह इंजेक्षन प्रोटोकोल 2.4 में वर्णित के रूप में mCherry डीएनए एक सेल भ्रूण में निर्माण करती है।
  5. क्रमबद्ध प्रयोग में भ्रूण -expressing MYCN एक त्रिविम स्त्राव का उपयोग कर प्रोटोकोल 2.4 में वर्णितescence माइक्रोस्कोप और दिनों PSNS में EGFP MYCN की अभिव्यक्ति के लिए postfertilization 1-3 पर मुख्य रूप से इंजेक्शन भ्रूण स्क्रीन। फिर, दिनों postfertilization के 2-5 दौरान, tricaine (0.02%) के साथ भ्रूण anesthetize और एक त्रिविम प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग PSNS में mCherry की अभिव्यक्ति के आधार पर फिर से उन MYCN- सकारात्मक या नकारात्मक भ्रूण तरह। mCherry की अभिव्यक्ति मोज़ेक प्राथमिक इंजेक्ट जानवरों के ऊतकों में ALK के coexpression के लिए एक मार्कर के रूप में कार्य करता है।
    नोट: ALK F1174L और dβh: mCherry, dβh: ALKWT और dβh: mCherry, या dβh जंगली प्रकार मछली के साथ MYCN स्थिर ट्रांसजेनिक मछली के प्रजनन से उत्पन्न ~ 600 संतानों डी βh सहित linearized डीएनए निर्माणों के साथ समूह प्रति इंजेक्शन थे : mCherry अकेले, क्रमशः। MCherry के मोज़ेक अभिव्यक्ति मुख्य रूप से इंजेक्शन मछली का 70-90% में मनाया जा सकता है। एक से डेढ़ एक- करने के लिएइंजेक्शन के मछली के तीसरे ट्यूमर घड़ी के लिए लार्वा मंच के माध्यम से बच गया।
  6. MCherry + MYCN + और ​​mCherry + MYCN के सभी उठाएँ - zebrafish किताब 39 से मानक प्रोटोकॉल के अनुसार भ्रूण और 5 सप्ताह postfertilization में शुरुआत ट्यूमर शुरुआत की निगरानी।

मोज़ेक ट्रांसजेनिक मछली में 4. ट्यूमर घड़ी

  1. ट्यूमर शुरू होने के सबूत के लिए 5 हफ्तों postfertilization पर शुरू हर 2 सप्ताह mCherry- सकारात्मक मुख्य रूप से इंजेक्शन मछली मॉनिटर।
  2. MCherry की उपस्थिति के लिए tricaine (0.02%) और स्क्रीन के साथ मछली anesthetize - और EGFP के एक डिजिटल दृष्टि डी एस-U1 के कैमरे से लैस है Nikon SMZ-1500 त्रिविम प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे PSNS में ट्यूमर -expressing।
  3. ट्यूमर ALK transgene व्यक्त कर रहे हैं कि क्या इस बात की पुष्टि करने के लिए, mCherry- और ALK जीनोटाइपिंग पीसीआर के लिए EGFP पॉजिटिव जनता को अलग।
  4. पीसीआर का प्रयोग, जीनोमिक डीएनए बढ़ानाALK P7: 5'-AGG सीसीए GGT जीटीसी सीजीजी AAT जीसी 3 'और ALK P18: 5'-टीजीटी सीटीटी कैग GCT GAT GTT जीसी 3' और निम्न पीसीआर प्रतिक्रिया: एक चक्र निम्नलिखित प्राइमरों के साथ विकसित ट्यूमर से निकाला 5 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस के, के 30 चक्र (30 सेकंड के लिए 30 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस, 55 डिग्री सेल्सियस, और 60 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस)। फिर, अनुक्रम ALK P7 प्राइमर के साथ पीसीआर उत्पाद आगे mCherry पॉजिटिव ट्यूमर में उत्परिवर्ती या जंगली प्रकार ALK के अस्तित्व की पुष्टि करने के लिए।

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Representative Results

Mutationally सक्रिय ALK F1174L या जंगली प्रकार ALK की overexpression neuroblastoma प्रेरण में MYCN के साथ सहयोग कर सकता है कि क्या जांच करने के लिए, हम MYCN overexpressing ट्रांसजेनिक मछली की PSNS में डी βh प्रमोटर के नियंत्रण में सक्रिय मानव ALK या जंगली प्रकार मानव ALK या तो overexpressed। ALKF1174L या dβh - - निम्नलिखित निर्माणों, dβh की या तो ALKWT, dβh साथ coinjected थे - mCherry एक सेल जंगली प्रकार या MYCN ट्रांसजेनिक भ्रूण (2A चित्रा) 8 में। mCherry की अभिव्यक्ति मोज़ेक प्राथमिक इंजेक्ट जानवरों के ऊतकों में ALK के coexpression के लिए एक मार्कर के रूप में कार्य किया। उम्मीद की जीनोटाइप के सभी इंजेक्ट मछली में प्रतिनिधित्व कर रहे थे: सक्रिय ALKF1174L और mCherry की पच्चीकारी coexpression के साथ (1) MYCN -expressing मछली ALK और mCherry की पच्चीकारी coexpression, नामित MYCN साथ (2) MYCN -expressing मछली; (3) mCherry के मोज़ेक अभिव्यक्ति के साथ मछली -expressing MYCN, MYCN नामित; मोज़ेक mCherry; मोज़ेक ALKmut; सक्रिय ALKF1174L और mCherry, नामित गुम्मट की पच्चीकारी coexpression के साथ (4) जंगली प्रकार की मछली; और WT नामित जंगली प्रकार ALK और mCherry, की पच्चीकारी coexpression के साथ (5) जंगली प्रकार की मछली, मोज़ेक ALKWT। एक ट्यूमर घड़ी तो 492 इंजेक्शन के जानवरों की कुल पर 5 हफ्तों postfertilization (WPF) से हर 2 सप्ताह प्रदर्शन किया था।

आठ + GFP / mCherry + ट्यूमर MYCN -expressing मछली में 9 WPF द्वारा, interrenal ग्रंथि में मानव अधिवृक्क ग्रंथि बराबर पैदा हुई coinjected साथ डी βh - ALKF1174 एल और dβh - mCherry (आंकड़े 2 बी और 3)। ये ट्यूमर histolo थेgically, मानव neuroblastoma को immunohistochemically, और ultrastructurally तुलनीय (डेटा संदर्भ 8 में पाया जा सकता है)। Dβh साथ (= आंकड़े -2 सी और 3, पृ .002) mCherry या इंजेक्शन - - ALKWT और dβh - इसके विपरीत, कोई ट्यूमर MYCN -expressing dβh साथ coinjected मछली में उम्र की 9 सप्ताह से मनाया गया mCherry अकेले (आंकड़े 2 डी और 3, पी = .007)। ट्यूमर दोनों MYCN में पड़ी, मोज़ेक ALKWT और MYCN, उम्र के 12 सप्ताह के बाद प्रेरण की एक ही दर के साथ मोज़ेक mCherry मछली। इसके अलावा, neuroblastomas निगरानी के 15 हफ्तों के दौरान जंगली प्रकार ALK और mCherry या ALKF1174L और mCherry ट्रांसजीन के साथ या तो coinjected किसी भी जंगली प्रकार की मछली में नहीं पाया गया। साथ में ले ली, इन निष्कर्षों mutationally सक्रिय ALK की पच्चीकारी overexpression MYCN -induced ट्यूमर ओ accelerates बताते हैं किNset, चाहे व्यक्ति मोज़ेक पशुओं में एकीकरण साइट है, और dβh प्रमोटर द्वारा संचालित स्तरों पर जंगली प्रकार ALK की कि overexpression के इस मॉडल प्रणाली में neuroblastoma प्रेरित करने के लिए MYCN overexpression के साथ सहयोग करने के लिए प्रकट नहीं होता है।

चित्र 1
चित्रा 1: पारंपरिक स्थिर और tumorigenesis के उम्मीदवार ओंकोजीन की सहकारी योगदान के अध्ययन में मोज़ेक क्षणिक zebrafish ट्रांसजेनिक रणनीतियों के योजनाबद्ध रूपरेखा (ए) स्थिर ट्रांसजेनिक रणनीति।। Linearized ट्रांसजेनिक डीएनए का निर्माण युक्त उम्मीदवार ओंकोजीन transgene यादृच्छिक जीनोमिक loci में मछली जीनोम में एकीकृत किया जा सकता है, जहां एक सेल चरण जंगली प्रकार या सीप उत्परिवर्ती zebrafish भ्रूण में इंजेक्ट किया जाता है। रोगाणु कोशिकाओं में transgene की एकता GENERATIO के लिए आवश्यक हैस्थिर ट्रांसजेनिक लाइन के एन। मुख्य रूप से इंजेक्शन भ्रूण transgene germline ट्रांसमिशन के साथ संस्थापक मछली के लिए स्क्रीन करने के लिए जंगली प्रकार या सीप उत्परिवर्ती मछली के साथ outcrossed किया जाएगा जो यौन परिपक्वता (मछली के F0 पीढ़ी), तक पहुँचने के लिए 3 से 4 महीने लगेंगे। संस्थापक मछली की परिणामी वंश, एफ 1 पीढ़ी में कहा कि उनके जीनोम में transgene की विषमयुग्मजी एलील ले। Tumorigenesis में इस तरह के जीन के रूप में दो उम्मीदवार ओंकोजीन, 'ए' और जीन 'बी', के सहयोगी प्रभाव का आकलन करने के लिए, हम यौगिक ट्रांसजीन ले जाने के वंश का केवल एक चौथाई के साथ, इन ट्रांसजीन overexpressing दो स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों की F1 संतान पैदा की। क्योंकि स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनों पैदा करने में अपेक्षाकृत कम क्षमता का, इस दृष्टिकोण उच्च throughput कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण के लिए संभव नहीं है। (बी) मोज़ेक क्षणिक ट्रांसजेनिक रणनीति। स्थिर transgenesis के लिए इसी प्रकार, linearized ट्रांसजेनिक डीएनए सह उम्मीदवार जीन से युक्त nstructs एक सेल चरण जंगली प्रकार भ्रूण में इंजेक्ट किया जा सकता है। Transgene जर्म कोशिकाओं के जीनोम में एकीकृत होने की जरूरत नहीं है, क्योंकि बहुत समय और प्रयास संस्थापक मछली की पहचान करने की प्रक्रिया में बचाया जा सकता है। उम्मीदवार ओंकोजीन की एक overexpressing ट्रांसजेनिक मछली लाइन (हमारे मामले में, MYCN ट्रांसजेनिक मछली विकसित किए गए) उपलब्ध है, तो वैकल्पिक रूप से, अन्य उम्मीदवार जीन से युक्त linearized ट्रांसजेनिक डीएनए निर्माणों में अपने सहयोग का अध्ययन करने के लिए एक सेल चरण ट्रांसजेनिक भ्रूण में इंजेक्ट किया जा सकता है tumorigenesis। Coinjected है और मुख्य रूप से इंजेक्शन मछली 31 में coexpressed किया जा सकता है तीन transgene निर्माणों अप करने के लिए; इस प्रकार, tumorigenesis में उम्मीदवार ओंकोजीन की बातचीत मुख्य रूप से इंजेक्शन मछली में मूल्यांकन किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 2:। सक्रिय ALK के मोज़ेक अभिव्यक्ति MYCN की शुरुआत एल्सेविअर (संदर्भ 3466510609819) से अनुमति के साथ Neuroblastoma 8 संशोधित आंकड़ा -induced accelerates। मोज़ेक transgenesis के निर्माण के लिए (ए) दृष्टिकोण। (बीएफ) मुख्य रूप से इंजेक्शन भ्रूण की दो दिन पुरानी लार्वा। विलय प्रतिदीप्ति brightfield छवियों (ऊपरी पैनल) में कपाल गैन्ग्लिया (तटरक्षक, तीर) सहित डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स में स्थिर EGFP अभिव्यक्ति के पार्श्व दृश्य,। कपाल गैन्ग्लिया (तटरक्षक, तीर), मज्जा मज्जा (एमओ, तीर) में मोज़ेक mCherry अभिव्यक्ति (कम पैनल) के पार्श्व विचार। कुछ अस्थानिक mCherry अभिव्यक्ति गैर PSNS और गैर डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स में मनाया जाता है। (जी - कश्मीर) 7 सप्ताह पुराने मुख्य रूप से इंजेक्शन मछली।(बी, जी) MYCN -expressing मछली coinjected साथ डी βh - ALKF1174L और dβh - mCherry constructs (MYCN; मोज़ेक ALKmut)। EGFP - और mCherry -positive ट्यूमर 7 सप्ताह (जी में सफेद खाली तीर) पर पड़ी। (सी, एच) dβh साथ coinjected मछली -expressing MYCN - ALKWT और dβh - mCherry (MYCN; मोज़ेक ALKWT) निर्माण करती है। (डी, मैं) dβh इंजेक्शन के साथ मछली -expressing MYCN - mCherry अकेले (MYCN; मोज़ेक mCherry) का निर्माण किया। (ई, जे) जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) dβh साथ coinjected मछली - ALKF1174L और dβh - mCherry (गुम्मट, मोज़ेक ALKmut) निर्माण करती है। ALKWT और dβh - - dβh साथ coinjected (एफ, कश्मीर) जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) मछली mCherRY निर्माणों (गुम्मट, मोज़ेक ALKWT)। MCherry या dβh - - Neuroblastomas dβh-ALKWT और dβh साथ coinjected मछली -expressing MYCN में नहीं मनाया गया अकेले 7 WPF में mCherry, या MYCN transgene के वारिस नहीं था और या तो ALKWT जीन या इंजेक्शन के साथ कर रहे थे कि भाई बहन में से किसी में ALKF1174L जीन। स्केल सलाखों, 100 बी में माइक्रोन - एफ और जी में 1 मिमी - कश्मीर। एक डिजिटल दृष्टि डी एस-U1 कैमरा और एक Leica डीएफसी 345FX डिजिटल कैमरे से लैस एक Leica MZ10F त्रिविम प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी से लैस एक Nikon SMZ-1500 त्रिविम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप छवियों संसाधित और एडोब फ़ोटोशॉप के साथ संकलित किया गया अधिग्रहण फ्लोरोसेंट images.The कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया गया और Illustrator CS3 (एडोब) सॉफ्टवेयर। कृपया यहाँ क्लिक करें एक बड़ा संस्करण देखने के लिएइस आंकड़े की।

चित्र तीन
चित्रा 3: डीएनए constructs के साथ मोज़ाइक Coinjected रूप MYCN ट्रांसजेनिक मछली में Neuroblastoma की शुरुआत या जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) मछली। । एल्सेविअर (संदर्भ 3466510609819) से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित डी βh - ALKF1174 एल और dβh - mCherry (मोज़ेक ALKmut); dβh - ALKWT और dβh - mCherry (मोज़ेक ALKWT); या dβh - mCherry (मोज़ेक mCherry) अकेले 8। dβh साथ coinjected MYCN लाइन में और है कि - ALKWT, (मोज़ेक ALKmut MYCN) mCherr वाई - ALKF1174 एल और dβh - dβh साथ coinjected MYCN -expressing मछली में 9 WPF द्वारा ट्यूमर शुरुआत के बीच का अंतर dβh - mCherry (MYCN; मोज़ेक ALKWT) या dβh - mCherry अकेले (MYCN; मोज़ेक mCherry) दो पूंछ फिशर सटीक परीक्षण द्वारा क्रमश: पी = 0.002 और पी = .007, पर महत्वपूर्ण है।

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Discussion

इस प्रतिनिधि अध्ययन में, हम इन जीनों स्पष्ट रूप से यौगिक स्थिर ट्रांसजेनिक मछली coexpressing में हमारे पिछले खोजने के साथ संगत neuroblastoma की शुरुआत में तेजी लाने के लिए सहयोग दिखाने के लिए कि ट्रांसजेनिक मछली -expressing MYCN में mCherry रिपोर्टर जीन के साथ क्षणिक coinjection और सक्रिय ALK के coexpression इस्तेमाल किया दोनों ALK और MYCN 8 सक्रिय। इस मोज़ेक ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण पारंपरिक पद्धति पर कई अलग फायदे के पास। सबसे महत्वपूर्ण है, यह इस तरह आम तौर पर ALK स्थिर -expressing के प्रजनन और पहचान में शामिल अत्यधिक समय और श्रम को नष्ट करने के रूप में स्थिर ट्रांसजेनिक जानवरों, के लिए आवश्यकता के बिना मुख्य रूप से इंजेक्शन पशुओं में उम्मीदवार ओंकोजीन (F0 पीढ़ी) coexpressing के प्रभाव का तेजी से परीक्षा में सक्षम बनाता है ट्रांसजेनिक मछली। हम भी साथ या अधिक MYCN बिना, जंगली प्रकार ALK की overexpression के प्रभाव की जांचट्यूमर दीक्षा पर अभिव्यक्ति,। परिणाम हमारे मछली मॉडल में जंगली प्रकार ALK के क्षणिक overexpression की परवाह किए बिना MYCN ओंकोजीन की स्थिति की, neuroblastoma tumorigenesis आरंभ करने के लिए पर्याप्त नहीं है कि दिखा। यह जंगली प्रकार की मछली में दोनों सक्रिय ALK और MYCN के क्षणिक coexpression मुख्य रूप से इंजेक्शन मछली में tumorigenesis के पहले शुरू होने के लिए प्रेरित कर सकता है कि क्या भविष्य में परीक्षण करने के लिए दिलचस्प होगा। इस अध्ययन से अधिक ईमानदारी से दोनों जीनों का दैहिक परिवर्तन उच्च जोखिम neuroblastoma रोगियों 5 के एक सबसेट में सह-घटित जिसमें वास्तविक बीमारी संदर्भ, नकल होगा।

मोज़ेक क्षणिक ट्रांसजेनिक रणनीति का एक महत्वपूर्ण डिजाइन तत्व मुख्य रूप से इंजेक्शन zebrafish भ्रूण के बीच और के लिए सकारात्मक मछली की निगरानी के लिए transgenes की सफल एकीकरण के साथ जानवरों के लिए स्क्रीनिंग में एड्स जो हित के किसी भी उम्मीदवार ओंकोजीन साथ coinjection के लिए एक पत्रकार जीन का समावेश है, tumoआर शुरुआत और प्रगति। Transgenesis की दक्षता बढ़ाने के लिए, हम काफी meganuclease 38 इंजेक्शन के साथ भ्रूण के 76% करने के लिए meganuclease बिना मुख्य रूप से इंजेक्शन भ्रूण के 26% से transgenes की वर्दी प्रमोटर निर्भर अभिव्यक्ति बढ़ जाती है जो मैं-SCEI meganuclease की मध्यस्थता ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण, आवेदन किया है । मैं-SCEI meganuclease की मध्यस्थता ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण का उपयोग उल्लेखनीय transgenesis की दक्षता में सुधार हुआ है हालांकि, सकारात्मक ट्रांसजीन के लिए इंजेक्शन भ्रूण का प्रतिशत अभी भी अच्छी तरह से 100% से नीचे बनी हुई है। इस प्रकार, एक coinjected रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति आगे ट्यूमर की शुरुआत के लिए मछली की निगरानी से पहले उम्मीदवार transgenes की सफल एकीकरण के साथ इंजेक्शन भ्रूण की पहचान करने के लिए एक मार्कर के रूप में सेवा कर सकते हैं। इसके विपरीत, एक Tol2 transposon की मध्यस्थता ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण मॉडल रीढ़ में एक लोकप्रिय आनुवंशिक उपकरण बन गया है और सफलतापूर्वक transgenesis, insertional उत्परिवर्तजनन, जीन जाल के लिए इस्तेमाल किया गया हैपिंग, और बढ़ाने 40,41 फँसाने। निषेचित भ्रूण में transposase mRNA के साथ Tol2 transposons की Coinjection गुणसूत्र एकीकरण की क्षमता बढ़ जाती है और transgene 42 के सफल germline संचरण potentiates कि जल्दी एकीकरण की घटनाओं सुविधा कर सकते हैं। हालांकि, डीएनए स्थानांतरण की "कट और पेस्ट" तंत्र की वजह से, transgene की एक एक प्रति प्रविष्टि ठिकाना 42 प्रति गुणसूत्र में एकीकृत है। इस प्रकार, coinjected उम्मीदवार जीन सबसे अधिक संभावना विभिन्न कोशिकाओं में उम्मीदवार जीनों की अभिव्यक्ति है और मुख्य रूप से इंजेक्शन मछली में coinjected जीनों के एक अधिक जटिल क्षणिक और मोज़ेक अभिव्यक्ति पैटर्न को ले जा सकता है, जो विभिन्न स्थलों पर मछली जीनोम में व्यक्तिगत रूप से एकीकृत कर रहे हैं।

कुल मिलाकर, वर्तमान अध्ययन सहयोगी, शायद सहक्रियाशील, एक उच्च वीं में कई ओंकोजीन के बीच संबंधों का मूल्यांकन करने के लिए एक तेजी से साधन के रूप में मोज़ेक transgenesis के भविष्य के उपयोग का समर्थन करता हैroughput तरीके, कृन्तकों सहित अन्य पशु मॉडल, के साथ मिलने के लिए मुश्किल है कि एक चुनौती है। इस प्रकार अब तक, इस रणनीति भी सफलतापूर्वक rhabdomyosarcoma 31 की सक्रिय रास -induced दीक्षा को दबाने और MYC प्रेरित टी सेल तीव्र लिम्फोब्लासटिक ल्यूकेमिया 31 के विकिरण संवेदनशीलता को संशोधित कि जीन की पहचान करने के लिए ट्रांसजेनिक zebrafish में लागू किया गया है। इसके अलावा, Langenau एट अल, 15 एक गर्मी सदमे inducible ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण के साथ coinjection दृष्टिकोण के संयोजन, मुख्य रूप से इंजेक्शन मछली में गर्मी सदमे से transgene अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित कर सकते हैं ट्यूमर में ओंकोजीन की सहकारी भूमिकाओं की खोज में बहुत उपयोगी होगा जो दिखा दिया है कि यह जीन अभिव्यक्ति परमिट के रूप में, प्राथमिक ट्यूमर स्थापित होने के बाद प्रगति पर दिया जाएगा। हाल ही में, Langenau और उनके सहयोगियों ने इंजीनियर जस्ता उंगली से rag2 जीन को लक्षित करके पहला प्रतिरक्षा अक्षमता zebrafish मॉडल 43 न्युक्लिअसिज़ विकसित की है। नुकसानrag2 के समारोह का, चिकित्सकीय, उम्मीदवार ट्रांसजीन overexpress और आत्म नवीकरण क्षमता पर मोज़ेक transgene अभिव्यक्ति के प्रभाव का आकलन है कि विषम कैंसर की कोशिकाओं की रोपाई में उपयोगी हो सकता है कि एक फायदा कई ऊतकों और कैंसर की कोशिकाओं को 43 के मजबूत और लंबी अवधि के engraftment की अनुमति प्रतिक्रियाएं और इन कैंसर की कोशिकाओं की वृद्धि दर।

अंत में, मोज़ेक transgenesis स्थिर transgenesis पर एक और अद्वितीय लाभ प्रदान करता है। स्थिर ट्रांसजेनिक जानवरों में, ट्रांसजीन शरीर में हर एक कोशिका के जीनोम में एकीकृत और पीढ़ी से पीढ़ी से 27 पैतृक हैं। हालांकि, कई तरह के कैंसर जर्म कोशिकाओं 44 में दैहिक कोशिकाओं के बजाय विरासत में मिला म्यूटेशन में आनुवंशिक परिवर्तन से उत्पन्न होती हैं। इस प्रकार, प्राथमिक में transgene एकीकरण की मोज़ेक पैटर्न मछली और बेहतर वें पुनरावृत्ति होगी व्यक्तिगत मोज़ेक ट्रांसजेनिक मछली की सेल आबादी के भीतर मिश्रित जीनोटाइप इंजेक्टई दैहिक दोष रोगियों में पाया जाता है और एक स्थिर ट्रांसजेनिक लाइन में एक भी प्रविष्टि साइट की वजह से कृत्रिम स्थितीय प्रभाव से बचना होगा। दूसरी ओर, मुख्य रूप से इंजेक्शन मछली में transgenes overexpressing कोशिकाओं के mosaicism और छोटी आबादी यंत्रवत अध्ययन और अधिक कठिन बना देता है।

सारांश में, मोज़ेक ट्रांसजेनिक रणनीति ट्यूमर दीक्षा और प्रसार के लिए ओंकोजीन की सहकारी योगदान के तेजी से और प्रभावी मूल्यांकन के लिए एक मजबूत उपकरण प्रदान करता है। इस अग्रिम तत्काल oncogenic तंत्र और रास्ते के आगे उत्पादक जांच के लिए और प्रभावी रूप से लक्षित चिकित्सा के विकास के लिए आवश्यक है, जो उम्मीदवार ओंकोजीन के बीच परस्पर क्रिया, पर मौलिक जानकारी उत्पन्न करने की उम्मीद है। तीन से अधिक coinjected डीएनए निर्माणों की cointegration की कार्यकुशलता बढ़ाने के लिए कर सकते हैं के विभिन्न प्रकारों में समवर्ती व्यक्त बहुजीनीय संयोजनों के बीच जटिल संबंधों की परीक्षा के लिए अवसर खुलेंगेसीईआर। भविष्य के लिए चुनौतियां प्राप्त की, overexpressed कर रहे हैं केवल प्रोटीन कोडिंग बदलने कि म्यूटेशन के लिए या जीन से इसके उपयोग नियोप्लास्टिक प्रक्रिया में एक भूमिका निभाते हैं, बजाय सीमा सकता है कि किसी भी जीनोमिक या epigenetic परिवर्तन को समायोजित करने के लिए मोज़ेक ट्रांसजेनिक रणनीति को संशोधित करने के लिए किया जाएगा या प्रवर्धित। हाल ही में, इस तरह के प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS) 45 और क्लस्टर नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता (CRISPR) / CRISPR जुड़े (कैस) सिस्टम 46, के रूप में सुधार जीनोम संपादन तकनीक, और अधिक तेजी से करने के लिए इस्तेमाल किया और कुशलता से अंतर्जात को संशोधित व्यापक रूप से हो गए हैं कोशिकाओं और जीवों 46 के विभिन्न प्रकारों में जीन। इस तरह की तकनीक हमें zebrafish मॉडल प्रणाली में, जीनोम अनुक्रम और जीन अभिव्यक्ति की अत्यधिक कुशल संशोधनों लक्षित प्रदर्शन करने के लिए और बेहतर ट्यूमर रोगजनन में जीनोमिक या epigenetic परिवर्तन की भूमिका अंतर्निहित तंत्र (ओं) को समझने के लिए अनुमति होगी। ये, बारी में, वें प्रेरणा की संभावना हैकैंसर की एक श्रृंखला के लिए उपन्यास आणविक चिकित्सा विज्ञान की ई विकास।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expand Long Template PCR System  Roche Applied Science, IN 11681834001
pCR-TOPO vector  Invitrogen, CA 451641
T4 DNA ligase New England Biolabs, MA M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme
Mix		 Invitrogen, CA 11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix Invitrogen, CA 11789-020
GC-RICH PCR System  Roche Applied Science, IN 12 140 306 001
Meganuclease I-SceI  New England Biolabs, MA R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope  Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera Nikon, NY

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विकास जीवविज्ञान अंक 97 zebrafish पशु मॉडल मोज़ेक transgenesis coinjection कार्यात्मक जीनोमिक्स ट्यूमर दीक्षा
ट्यूमर रोगजनन में उम्मीदवार सहकारी जीन की कार्यात्मक जीनोमिक विश्लेषण के लिए मोज़ेक Zebrafish transgenesis
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Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, … More

Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis. J. Vis. Exp. (97), e52567, doi:10.3791/52567 (2015).

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