Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Mosaic Sebrafisk transgenesis for Funksjonell Genomisk Analyse av søker Cooperative Gener i Tumor Patogenese

Published: March 31, 2015 doi: 10.3791/52567
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 1,3
1Department of Molecular Pharmacology & Experimental Therapeutics, Mayo Clinic College of Medicine, Center for Individualized Medicine, 2Tufts University School of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic

Introduction

Kreft er progressive sykdommer preget av opphopning av patologiske mutasjoner, slettinger og kromosom gevinster over tid. Disse genetiske avvik kan påvirke flere cellulære prosesser som strekker seg fra cellesyklus, celledød, energisk metabolisme og montering av cytoskjelettet til stressresponser som hypoksi. Derfor reflekterer tumorigenesis de kollektive handlinger av flere genetiske avvik over et spektrum av biologiske prosesser. Nyere integrerende genomisk forskningsinnsats, inkludert hele genomsekvensering, exome sekvensering, målrettet sekvensering, dyp sekvensering og genom-wide association studies, har identifisert et økende antall nye genetiske endringer i hovedsak alle typer svulster 1-4. I mange tilfeller oppstår genetiske lesjoner sammen i et ikke-tilfeldig måte 5-8, noe som tyder på deres samarbeid i sykdom patogenesen. Dissekere de onkogene roller stort utvalg av abnorme uttrykte gener som følge fROM disse genomiske lesjoner er nødvendig å finne nye terapeutiske strategier og å forstå svarene av kreftceller til disse midlene, men dette har vist seg å være en vanskelig oppgave, som krever svært robuste dyr modellsystemer for gjennomføringen av høy gjennomstrømming funksjonell genomanalyse vivo.

Selv om pattedyr, spesielt gnagere, er favoriserte modeller i kreft biologi, har sebrafisk begynt å tiltrekke seg stor oppmerksomhet. Den teleost sebrafisk (Dario rerio) har blitt brukt som modellorganisme for utviklingsstudie siden 1960-tallet og ble først brukt til studiet av svulst patogenesen i 1982 9-11. Enkelt vedlikehold, liten kroppsstørrelse, og høy fruktbarhet gjør sebrafisk en robust modell for store termin genetiske skjermer for å identifisere mutasjoner som unormale og patologiske fenotyper 10. Den optiske åpenhet av sebrafisk embryo er en annen viktig funksjon som støtter større bruk av denne kreft-modellen, somdet tillater in vivo avbildning skal gjennomføres for å finne svulst utvikling i sanntid 9, et program som er relativt vanskelig i gnagere 12. Nyere komparative genomikk analyse av sebrafisk referansen genomet (Zv9) avslørte 26 206 proteinkodende gener, med 71% å ha menneskelige orthologues, hvorav 82% er korrelert med sykdomsassosierte gener i Online Mendels arvelover i Man (OMIM) database 13, 14. Derfor har sebrafisk blitt brukt til å modellere ulike typer kreft hos mennesker, inkludert neuroblastom 8, T-celle akutt lymfatisk leukemi (T-ALL) 15,16, melanom 17,18, Ewings sarkom 19, rhabdomyosarcoma 20,21, bukspyttkjertelkreft 22, leverkreft 23 og myeloide kreft 24,25, og har blitt valgt som en kreft modell for xenotransplantasjon studerer 11,26.

En stabil transgentilnærming i sebrafisk er ofte brukt for å studere effekten av gain-of-funksjon av gener i normal utvikling eller sykdom patogenesen 27,28. For å utvikle en slik modell (figur 1A), injiserer man en DNA-konstruksjon som inneholder genet av interesse som drives av en vevsspesifikk promoter i en celle-villtype-embryoer. Tre til fire måneder etter injeksjon, når de injiserte embryoer blir kjønnsmodne, de outcrossed med vill-type fisk til skjermen for de som viser integrering av DNA konstruere i deres kimlinje, som lisensierer dem som grunnleggeren fisk. Mange faktorer, slik som kopiantall og integrering området av transgenet, påvirker ekspresjonen av transgenet i stabile transgene linjer. Således, for å utvikle en transgen tumormodell, flere stabile transgene linjer som overuttrykker et enkelt onkogen må genereres først og screenet for linje som uttrykker transgenet på et nivå som kan føre til tumorfremkallelse. Men hvis overekspresjon av en kandidat oncogene er giftig for bakterieceller, er det vanskelig å generere en stabil transgen linje ved direkte overekspresjon i transgen 29. Følgelig kan denne metode være tidkrevende, med en høy risiko for svikt til å generere en passende kreftmodell.

Her illustrerer vi en alternativ strategi basert på mosaikk transient transgenesis (figur 1B) som gir unike fordeler fremfor tradisjonell stabil transgenesis for funksjonell genomstudie in vivo. I denne fremgangsmåten blir en eller flere av transgene konstruksjoner injisert i en celle-stadiet av transgene eller villtype-embryoer. De injiserte DNA-konstruksjoner inneholdende transgener er da mosaically og tilfeldig integrert i primær injisert fisk, noe som resulterer i blandede genotyper i flere cellepopulasjoner i enkeltfisk 30. Videre coinjection av flere DNA konstruerer i ett-celle embryo fører til co-integrering i samme celle på tilfeldige steder, slik at man i Trace cellene med uttrykk av transgener og utforske samspillet mellom ulike gener under sykdom patogenesen i mosaikk dyr 31. Som bevis for prinsippet vi transient overuttrykt mutasjons aktivert ALK (F1174L) med mCherry reporter-genet i det perifere sympatiske nervesystem (PSNS) under kontroll av dopamin-beta-hydroksylase (d .eH) promoter i vill-type fisk og transgen fisk som overuttrykker MYCN. ALK, som koder for en reseptor tyrosin kinase, er den hyppigst muterte genet i høy-risiko neuroblastom 5-7,32,33. ALK (F1174L), som en av de mest hyppige og potente somatiske aktiverende mutasjoner, er overrepresentert i MYCN- forsterket høyrisiko neuroblastom pasienter og synergizes med MYCN overekspresjon å akselerere neuroblastom tumorigenesis i både stabile gene mus og transgene sebrafisk modeller 8,34,35. Av mosaikktransient overekspresjon av ALK (F1174L) med mCherry i MYCN transgen fisk, rekapitulert vi akselerasjonen av begynnende svulstdannelse observert i den stabile transgene fisken overekspresjon både ALK (F1174L) og MYCN, noe som tyder på at mosaikken transgenesis strategi kan brukes til raskt og effektivt vurdere de relative bidrag fra flere oncogenes i startfasen i vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Alle sebrafisk studier og vedlikehold av dyrene ble gjort i samsvar med Mayo Clinic Institute IACUC-godkjent protokoll # A41213.

1. DNA-konstruksjoner for transgenesis

  1. Forsterke en 5,2-kb dopamin beta hydroksylase (d .eH) promoter region 8 bruker CH211-270H11 BAC klone (fra BacPac ressurser sentrum (BPRC)) som en DNA-mal. Bruke en PCR-system egnet for lang og nøyaktig PCR-amplifisering av lange DNA-templater, og de følgende syklusprogrammer for PCR: 94 ° C i 2 minutter, 10 sykluser av (94 ° C, 15 sek, 50 ° C, 30 sek, 68 ° C, 8 minutter), etterfulgt av 30 sykluser av (94 ° C, 15 sek, 53 ° C, 30 sek, 68 ° C, 8 minutter), 68 ° C, 4 minutter (forover primer 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 ' og revers primer 5'GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 ').
  2. Lag den d .eH -pDONRP4-P1R oppføring clone 8 ved hjelp av kommersiell rekombinant kloning system som multisite gateway. Bland 1 mL av renset dβh PCR produkt (172 ng / mL), en mikroliter (150 ng / mL) pDONRP4-P1R donor vektor (sammen med andre gateway vektorer er generøse gaver fra Dr. Chi-Bin Chien, Univ. Of Utah) , 4 pl av TE-buffer (pH 8,0) med 2 mL av BP clonase enzymblandingen, inkubere i 1 time ved 25 ° C, og deretter omdanne til One Shot TOP10 kompetente E. coli i henhold til produsentens protokoll.
  3. Generere d .eH: EGFP-MYCN transgen konstruere 8 ved hjelp av rekombinant kloning system nevnt i trinn 1.2. Bland 1 mL av hver oppføring klone (150 ng / mL), inkludert en 5,2-kb dβh promoter (dβh -pDONR P4-P1R konstruere), EGFP mangler et stoppkodon (PME-EGFP konstruere), og human MYCN cDNA (en sjenerøs gave fra Dr. Hogarty på Barnas Hospital of Pennsylvania, MYCN-pDONRP2R-P3 konstruere), en mikroliter (150 ng / mL) av den modifiserte reisemålet vektor som inneholder I-SCEI gjenkjenningsseter (en sjenerøs gave fra Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Tyskland), 4 mL av TE buffer ( pH 8,0) med 2 mL av LR Clonase enzymblandingen, inkubere i 1 time ved 25 ° C, og deretter omdanne til kjemisk kompetent E. coli som Ett skudd topp 10 og følg produsentens protokoll.
  4. Gjør MITF: MITF konstruere transgene 8 ved fordøyelse av PNP-MITF vektor med Notl og Sall-restriksjonsenzymer i 2 timer ved RT, og etter subkloning av det frigjorte 2,65 kb (en generøs gave fra Dr. D. Raible, Univ of Washington). DNA-fragmentet som inneholder MITF promotoren og den kodende sekvens av sebrafisk MITF genet inn i Notl og Mlul områder av en modifisert pBluescript vektor inneholdende flankerende I-SCEI gjenkjenningsseter (en generøs gave fra Dr. Hui Feng, Boston University), ved bruk av T4 DNA-ligase i henhold til produsentens protokoll.
    MERK: For å øke effektiviteten i å generere stabile MYCN -expressing linjer, d .eH: EGFP-MYCN og MITF:. MITF DNA-konstruksjoner er coinjected i ett-cellestadiet Nacre embryoer Nacre betegner en type mutant fisk mangler en neural crest-avledet melanophore under utvikling 36. Således vil utseendet av pigmentceller i de injiserte embryoer antyder integrering av MITF: MITF DNA-konstruksjonene i genomet. Det har vist seg at to eller tre coinjected DNA-konstruksjoner kan cointegrated inn i fisken genomet 31. Dermed kan pigmentering forårsaket av MITF uttrykk tjene som en markør for integrering av dβh: EGFP-MYCN transgenet og for enklere identifisering av MYCN stabil transgen linje.
  5. Bland d .eH: EGFP-MYCN og MITF: MITF DNAkonstruksjoner på en 3: 1 forhold i et totalvolum på 15 ul reaksjon med en ul I-SCEI enzym og 0,75 mL av bufferen. Pass på at den totale mengden av DNA i reaksjonen ikke overstiger 750 ng.
  6. Utføre I-SCEI fordøyelse ved RT i 4 timer eller O / N. På den andre dagen, I-SceI- spaltet DNA er klare for mikroinjeksjon, eller kan lagres ved -20 ° C til injeksjon i fremtiden. Oppbevar I-SCEI enzym ved -80 ° C i små porsjoner for å opprettholde enzymeffektivitet.
  7. Subklone menneske ALKF1174L og villtype ALK-genet fra pcDNA3 vektor (en sjenerøs gave fra Dr. George på Dana-Farber Cancer Institute) 7 inn EcoRI- og Noti- områder av en pENTRY1A vektor (en sjenerøs gave fra Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Tyskland) ved hjelp av T4 DNA ligase henhold til produsentens protokoll.
  8. Generere d .eH: ALKF1174L </ Em> eller dβh: ALKWT transgene konstruksjoner ved hjelp av rekombinante systemet som nevnt i protokoll 1.2. Kort, kombinere tre oppføring kloner, dβh -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (eller ALKWT -pENTRY1A) og P3E-polyA, inn den modifiserte reisemålet vektor som inneholder I-SCEI gjenkjenningsseter (en sjenerøs gave fra Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Tyskland), ved hjelp av LR Clonase enzym Mix, i henhold til produsentens protokoll.
  9. Bland d .eH: ALKF1174L (eller dβh: ALKWT) og dβh: mCherry DNA konstruerer på en 3: 1-forhold og linearize dem med I-SCEI enzym som beskrevet i PROTOKOLL 1,5-1,6.

2. Mikroinjeksjon

  1. Bruke glass mikropipetter med mm diameter 1.0 for alle injeksjoner 37. Bryt av tuppen av glass mikropipetter med et barberblad før injeksjon. Kalibrere injeksjonsvolumet ved injecting H 2 O i en dråpe mineralolje. Måle diameteren av de resulterende dråpene og juster microinjector (trykk eller varigheten av trykkpulsen) for å sikre at injeksjonsvolumet er mindre enn 10% av det totale cellevolum av en celle-trinns embryoer.
  2. Legg ytterligere 0,5 mL av fersk I-SCEI enzym (5 enhet / mikroliter) i 5 mL av injeksjon løsning som inneholder DNA konstruerer rett før injeksjon for å øke effektiviteten av transgenesis 38. Injisere 50-80 pg linearisert DNA-konstruksjoner inn i cytoplasmaet til en celle-trinns embryoer. For å sikre suksess for injeksjon, blande prøven med 0,25% fenolrødt for visualisering. Hvis cellene blir røde etter injeksjon, betyr det at mikroinjeksjon er vellykket. For å sikre en høy suksessrate for å generere transgen fisk, vi vanligvis injisere så mange som 500 embryoer.
  3. Å generere transgen fisk stabilt uttrykker MYCN, coinject den lineariserte d .eH: EGFP-MYCN og MITF: MITF DNA-konstruksjoner (i et 3: 1 forhold) i embryoer ved pigmentering mutant perlemor sebrafisk ved en-cellestadiet. Ekspresjon av MITF fungerer som en reporter for integrering av transgene konstrukter i fisken genomet.
  4. For mosaikk overekspresjon av ALK i vill-type eller MYCN transgene embryoer, co-injisere det lineariserte d .eH: ALK F1174L (eller dβh: ALKWT) med dβh: mCherry DNA-konstruksjonene (ved en 3: 1 ratio) i den ene celle- embryoer som følge av avl av F1 heterozygous Tg (dβh: EGFP-MYCN) transgen fisk med villtype AB fisk. Dermed halvparten av avkom er transgen for MCYN og halvparten er villtype.

3. Skjerm for Stabil eller Mosaic Transgenic Fish

  1. For å øke effektiviteten av identifikasjon av stabile MYCN -expressing linjer, bedøve primært injisert Nacre embryoer med Tricaine (0,02%) ent dager 3-5 av postfertilization og skjermen for pigmentering. Overfør embryoene med pigmentering til en ny petriskål med friskt egg vann og heve dem til seksuell modenhet for ytterligere screening for grunnleggeren fisk, som bære d .eH: EGFP-MYCN transgenet i kjønnscellene.
  2. Å identifisere grunnleggeren med kimlinje overføring av EGFP-MYCN, utkrysning pigmentert F0 voksen fisk med villtype AB fisk og skjerm for EGFP-positive embryoer på 1-2 dager etter befruktning for videre genotyping. Plasser ett enkelt EGFP-positive F1 embryoet inn i en PCR rør og fjerne all væske. Tilsett 50 pl av gDNA utvinning buffer som inneholder 12,5 ul 4x lyseringsbuffer, 35 ul H2O og 2,5 pl proteinase K (10 mg / ml) for å enkelt embryo. Inkuber reaksjonsblandingen i 2-3 timer ved 55 ° C, etterfulgt av 10 min med inkubasjon ved 98ºC å inaktivere proteinase K. For å lage 50 ml 4x lysis buffer, tilsett 500 ul av 1 M Tris (pH 8,4), 2,5 ml 1M KCl to 47 ml H 2 O. MERK: Etter F0 MYCN stabil transgen fisk er avlet med vill-type AB fisk, alle av avkommet er pigmentert. Således kan pigmentering ikke tjene som markør for identifisering av positive MYCN- fisk. Mens i MYCN transgene fisken er EGFP-MYCN-fusjonsprotein uttrykt i PSNS, inkludert de sympatiske neuroner i den overlegne cervical ganglia og sekvensiell segmental ganglion av det sympatiske kjede og de ​​ikke-PSNS dopaminerge neuroner, slik som medulla oblongata og kranie ganglia 8. Således kan ekspresjon av EGFP tjene som en markør for identifisering av MYCN stabile transgene embryoer.
  3. Bruke 2 mL av gDNA hentet fra pigmentert F1 embryo som mal, primere MYCN-test F1: 5'-CTG CTT GAG AAC GAG CTG TG-3 '; MYCN R3: 5'-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 ', og følgende program viddh GC-rik PCR System: 1 syklus med 95 ° C i 3 minutter, 25 sykluser av 95 ° C i 30 sek, 58 ° C i 30 sek, og 72 ° C i 3 min. Vi vanligvis genotype 14-16 pigment embryoer fra en enkelt paring for å bekrefte tilstedeværelse av integrerte MYCN transgenet i de pigmenterte embryoer, mer enn seks grunnleggeren fisk overekspresjon MITF og MYCN ble identifisert ved denne metoden.
  4. Løft opp resten av EGFP-positive F1 embryoer. Fin klippet og genotype dem ved 2-3 måneders alder ved hjelp av ovennevnte protokoll for ytterligere å bekrefte integrering av MYCN transgenet inn i fisken. Avle F1 MYCN stabil transgen fisk med villtype AB fisk. Co-injisere linearisert d .eH: ALK F1174L (eller dβh: ALKWT) med dβh: mCherry DNA konstruerer inn i ett-celle embryoer som beskrevet i PROTOKOLL 2.4.
  5. Sortere MYCN -expressing embryoer i forsøket beskrevet i PROTOKOLL 2.4 bruker en stereoskopisk fluorescence mikroskop og skjerme de primært injisert embryo på dag 1-3 av postfertilization for uttrykket av EGFP-MYCN i PSNS. Deretter, i løpet dager 2-5 av postfertilization, bedøve embryoene med Tricaine (0,02%) og sortere de MYCN- positive eller negative embryoer igjen basert på uttrykk for mCherry i PSNS bruker en stereoskopisk fluorescens mikroskop. Uttrykket av mCherry fungerer som en markør for koekspresjonen av ALK i vev av mosaikk primære injisert dyr.
    MERK: ~ 600 avkom som følge av avl av MYCN stabil transgen fisk med vill-type fisk ble injisert per gruppe med de lineariserte DNA-konstruksjoner, herunder d .eH: ALK F1174L og dβh: mCherry, dβh: ALKWT og dβh: mCherry, eller dβh : mCherry alene, henholdsvis. Mosaikk ekspresjon av mCherry kan observeres i 70-90% av den første rekke injisert fisk. En halv til to-tredjedel av den injiserte fisk overlevde gjennom larvene scenen for svulst watch.
  6. Heve hele mCherry + MYCN + og mCherry + MYCN - embryoer i henhold til standard protokoller fra sebrafisk bok 39 og overvåke svulsten utbruddet begynner på fem uker postfertilization.

4. Tumor Watch i Mosaic Transgenic Fish

  1. Overvåke mCherry- positiv primært injisert fisk hver 2. uke starter på fem uker postfertilization etter bevis for tumor utbruddet.
  2. Bedøve fisk med Tricaine (0,02%) og skjermen for tilstedeværelse av mCherry - og EGFP -expressing svulster i PSNS under Nikon SMZ-1500 stereoskopisk fluorescens mikroskop utstyrt med et digitalt syn DS-U1 kamera.
  3. For å bekrefte om svulstene uttrykker ALK transgenet, isolere mCherry- og EGFP-positive massene for ALK genotyping PCR.
  4. Ved hjelp av PCR, forsterke genomisk DNAekstrahert fra utviklede tumorer med følgende primere: ALK P7: 5'-AGG CCA GGT GTC CGG AAT GC-3 ', og ALK P18: 5'-TGT CTT CAG GCT GAT GTT GC-3', og den følgende PCR-reaksjonen: 1 syklus på 94 ° C i 5 minutter, 30 sykluser av (94 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sek, og 72 ° C i 60 sek). Deretter sekvensen av PCR-produkt med ALK P7 primer for ytterligere å bekrefte eksistensen av mutant eller villtype-ALK i mCherry-positive tumorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å undersøke hvorvidt overekspresjon av mutasjons aktivert ALK F1174L eller villtype-ALK kunne samarbeide med MYCN i neuroblastom induksjon, overuttrykt vi enten aktivert humant ALK eller vill-type human ALK under kontroll av d .eH-promoteren i PSNS av transgen fisk som overuttrykker MYCN. Et av følgende konstruksjoner, dβh - ALKF1174L eller dβh - ALKWT, ble coinjected med dβh - mCherry i ett-celle villtype eller MYCN transgene embryoer (Figur 2A) 8. Uttrykket av mCherry servert som en markør for koekspresjonen av ALK i vev av mosaikk primære injisert dyr. Alle de forventede genotyper var representert i den injiserte fisk: (1) MYCN -expressing fisk med mosaikk koekspresjon av aktivert ALKF1174L og mCherry MYCN -expressing fisk med mosaikk koekspresjon av villtype ALK og mCherry, utpekt MYCN; mosaikk ALKWT; (3) MYCN -expressing fisk med mosaikk uttrykk for mCherry, utpekt MYCN; mosaikk mCherry; (4) villtype fisk med mosaikk koekspresjon av aktivert ALKF1174L og mCherry, betegnet WT; mosaikk ALKmut; og (5) villtype fisk med mosaikk koekspresjon av villtype-ALK og mCherry, betegnet WT; mosaikk ALKWT. En svulst watch ble deretter utføres hver to uker fra 5 uker postfertilization (WPF) på til sammen 492 injisert dyr.

Åtte GFP + / mCherry + tumorer oppsto i interrenal kjertel, den menneskelige binyrene tilsvarende, med 9 WPF i MYCN -expressing fisk coinjected med d .eH - ALKF1174 L og dβh - mCherry (Tall 2B og 3). Disse svulstene var histologically, immunohistokjemisk og ultrastructurally sammenlignbar med human neuroblastom (data kan finnes i referanse 8). Til sammenligning var ingen svulster observert ved 9 ukers alder i MYCN -expressing fisk coinjected med dβh - ALKWT og dβh - mCherry (Tall 2C og 3, p = 0,002) eller injiseres med dβh - mCherry alene (Tall 2D og 3, p = 0,007). Svulster oppsto i både MYCN, mosaikk ALKWT og MYCN; mosaikk mCherry fisk med samme rate av induksjon etter 12 ukers alder. I tillegg ble neuroblastomer ikke påvist i noen vill-type fisk coinjected med enten villtype-ALK og mCherry eller ALKF1174L og mCherry transgener i løpet av 15 ukers oppfølging. Samlet utgjør disse funnene viser at mosaikk overekspresjon av mutasjons aktivert ALK akselererer MYCN -indusert svulst onset, uavhengig av integreringssete i de enkelte mosaikk dyr, og at overekspresjon av vill-type ALK på nivåene drevet av dβh promoteren ser ikke ut til å samarbeide med MYCN overekspresjon å indusere neuroblastom i dette modellsystemet.

Figur 1
Figur 1: Skjematisk oversikt over konvensjonell stabil og mosaikk forbigående sebrafisk transgene strategier i studiet av Cooperative Bidrag av Kandidat Onkogener til tumorigenesis (A) Stabil transgen strategi.. Transgen linearisert DNA-konstruksjon som inneholder kandidaten onkogen blir injisert i en celle-stadiet villtype eller mutante NACRE sebrafisk embryoer hvor transgenet kan bli integrert inn i genomet fisken tilfeldig genomiske loci. Integrering av transgenet i kjønnsceller er nødvendig for genen av stabil transgen linje. Primært injisert embryoer ta 3 til 4 måneder å nå seksuell modenhet (F0 generasjonen av fisk), som vil bli outcrossed med villtype eller Nacre mutant fisk å screene for grunnleggeren fisk med transgenet kimlinje overføring. Den resulterende avkom av grunnleggeren fisk, kalt F1-generasjonen, bære de heterozygote alleler av transgenet i sitt genom. Å vurdere samarbeids effekten av to kandidat onkogener, for eksempel genet "a" og gen "b", i tumorigenesis, avlet vi F1 avkom av to stabile transgene linjer overekspresjon disse transgener, med bare en fjerdedel av avkom bærer sammensatte transgener. På grunn av den relativt lave effektivitet for å generere stabile transgene linjer, er denne fremgangsmåten ikke mulig for high-throughput funksjonelle genomiske analyser. (B) Mosaic transient transgen strategi. I likhet med den stabile transgenesis, linearized transgen DNA co nstructs inneholder kandidat gener kan bli injisert i en celle-trinns villtype-embryoer. Fordi transgenet ikke behøver å bli integrert inn i genomet til bakterieceller, kan mye tid og krefter lagres i prosessen med å identifisere legger fisk. Alternativt, hvis den transgene fisken linje som overuttrykker en av kandidat onkogener er tilgjengelig (i vårt tilfelle ble MYCN transgen fisk utviklet), transgene lineariserte DNA-konstruksjoner inneholdende andre kandidat gener kan bli injisert i en celle-stadiet transgene embryoer for å studere deres samarbeid tumorigenesis. Opptil tre transgene konstruksjoner kan coinjected og kouttrykte i hovedsak injisert fisk 31; dermed kan samspillet av kandidat onkogener i tumorigenesis vurderes i hovedsak injisert fisk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

"Src =" / files / ftp_upload / 52567 / 52567fig2.jpg "/>
Figur 2: Mosaic Expression of Aktivert ALK Akselererer Onset of MYCN indusert Neuroblastom 8 Modifisert figur med tillatelse fra Elsevier (referanse 3466510609819).. (A) Approach for å konstruere mosaikk transgenesis. (BF) to dager gamle larver av primært injisert embryoer. Sideutsikt over stabil EGFP uttrykk i de dopaminerge nevroner, inkludert kranie ganglia (CG, pilspisser) i fusjonerte fluorescens-lysfelt bilder (øvre paneler). Sideutsikt over mosaikk mCherry uttrykk (nedre paneler) i kranie ganglia (CG, pilspisser), forlengede marg (MO, piler). Noen ektopisk mCherry ekspresjon observeres i den ikke-PSNS og ikke-dopaminerge neuroner. (G - K) 7 uker gamle primært injiserte fisk.(B, G) MYCN -expressing fisk coinjected med d .eH - ALKF1174L og dβh - mCherry konstruerer (MYCN; mosaikk ALKmut). EGFP - og mCherry -positive svulster oppsto på 7 uker (hvite tomme piler i G). (C, H) ​​MYCN -expressing fisk coinjected med dβh - ALKWT og dβh - mCherry konstruerer (MYCN; mosaikk ALKWT). (D, I) MYCN -expressing fisk injisert med dβh - mCherry konstruere alene (MYCN; mosaikk mCherry). (E, J) Wild-type (WT) fisk coinjected med dβh - ALKF1174L og dβh - mCherry konstruerer (WT, mosaikk ALKmut). (F, K) Wild-type (WT) fisk coinjected med dβh - ALKWT og dβh - mCherry konstruksjoner (WT, mosaikk ALKWT). Neuroblastomer ble ikke observert i MYCN -expressing fisk coinjected med dβh-ALKWT og dβh - mCherry eller dβh - mCherry alene på syv WPF, eller i noen av søsknene som ikke arver MYCN transgenet og ble injisert med enten ALKWT genet eller den ALKF1174L genet. Skala barer, 100 mikrometer i B - F og 1 mm i G - K. En Nikon SMZ-1500 stereoskopisk fluorescens mikroskop utstyrt med en digital syn DS-U1 kamera og en Leica MZ10F stereoskopisk fluorescens mikroskop utstyrt med en digital Leica DFC 345FX kamera ble brukt til å fange den fluorescerende images.The kjøpte bilder ble behandlet og kompilert med Adobe Photoshop og Illustrator CS3 (Adobe) programvare. Klikk her for å se en større versjonav denne figur.

Figur 3
Figur 3: Onset of Neuroblastom i MYCN Transgenic Fisk eller Wild-type (WT) Fisk som Mosaics Coinjected med DNA-konstruksjonene. Gjengitt med tillatelse fra Elsevier (referanse 3466510609819) d .eH - ALKF1174 L og dβh - mCherry (mosaikk ALKmut);. Dβh - ALKWT og dβh - mCherry (mosaikk ALKWT); eller dβh - mCherry (mosaikk mCherry) alene 8. Forskjellen mellom svulst utbruddet med 9 WPF i MYCN -expressing fisk coinjected med dβh - ALKF1174 L og dβh - mCherr y (MYCN; mosaikk ALKmut) og at det i MYCN linje coinjected med dβh - ALKWT dβh - mCherry (MYCN; mosaikk ALKWT) eller dβh - mCherry alene (MYCN; mosaikk mCherry) er signifikant på p = 0,002 og p = 0,007, henholdsvis ved to-tailed Fishers eksakte test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne representative studien brukte vi forbigående coinjection og koekspresjon av aktivert ALK med mCherry reporter genet i MYCN -expressing transgen fisk å vise at disse genene samarbeide til markert akselerere utbruddet av nevroblastom, i tråd med vår tidligere funn i forbindelse stabil transgen fisk coexpressing både aktivert ALK og MYCN 8. Denne mosaikk transgen tilnærming besitter flere klare fordeler i forhold til den konvensjonelle metoden. Det viktigste er at den muliggjør rask undersøkelse av virkningene av coexpressing kandidat onkogener i hovedsak injiserte dyr (F0 generasjon) uten behov for stabile transgene dyr, for eksempel eliminering av overdreven tid og arbeid vanligvis involvert i avl og identifisering av ALK -expressing stabil transgen fisk. Vi har også undersøkt effekten av overekspresjon av villtype ALK, med eller uten MYCN løpetuttrykk, på startfasen. Resultatene viser at transient overekspresjon av vill-type ALK i våre fiske modellen ikke er tilstrekkelig til å initiere neuroblastom tumorgenese, uavhengig av statusen til MYCN onkogenet. Det ville være interessant å teste i fremtiden om forbigående koekspresjon av både aktivert ALK og MYCN i villtype fisk kan indusere tidligere start tumorigenesis i hovedsak injisert fisk. Denne studien ville mer trofast etterligne selve sykdommen sammenheng, der somatiske endringer av både gener co-skje i en undergruppe av høyrisiko neuroblastom pasienter fem.

Et viktig designelement av mosaikk forbigående transgen strategi er inkluderingen av en reporter gen for coinjection med noen kandidat onkogener av interesse, som hjelpemidler i screening for dyr med vellykket integrering av transgener blant de primært injisert sebrafisk embryo og for å overvåke den positive fisk for Tumor utbruddet og progresjon. For å øke effektiviteten av transgenesis, har vi anvendt I-SCEI meganuclease-mediert transgene tilnærming, som i betydelig grad øker den ensartede promoter-avhengig ekspresjon av transgener fra 26% av de hovedsakelig injiserte embryoer uten meganuclease til 76% av injiserte embryoer med meganuclease 38 . Selv om bruk av I-SCEI meganuclease-mediert transgene tilnærming har effektivisert transgenesis bemerkelsesverdig, prosentandelen av injisert embryo positivt for transgener er fortsatt godt under 100%. Således kan ekspresjon av et reportergen coinjected tjene som en markør for å identifisere injiserte embryoer med vellykket integrering av kandidattransgener før videre overvåking av fisk for angrep av tumorer. I kontrast, har et Tol2 transposon-mediert transgene tilnærming blitt et populært genetisk verktøy i modell virveldyr og har blitt brukt for transgenesis, insertional mutagenese, genet felleping, og forsterker fangst 40,41. Coinjection av Tol2 transposoner med transposase mRNA inn befruktede embryoer kan lette tidlig integrering hendelser som øker effektiviteten av kromosom integrering og potensierer vellykket kimlinje overføring av transgenet 42. Imidlertid, på grunn av "cut-og-lime" mekanisme for DNA-transposisjon, er en enkelt kopi av transgenet er integrert inn i kromosomet per innsetting locus 42. Således er coinjected kandidatgener mest sannsynlig integrert enkeltvis inn i fisken genom på forskjellige steder, noe som kan føre til ekspresjon av kandidatgener i forskjellige celler, og en mer komplisert og transient ekspresjon mosaikkmønster coinjected gener i hovedsak injisert fisk.

Samlet, støtter denne studien fremtidig bruk av mosaikk transgenesis som en rask måte å evaluere samarbeids, kanskje synergistisk, relasjoner mellom flere onkogener i en high-throughput måte, en utfordring som er vanskelig å møte med andre dyremodeller, inkludert gnagere. Så langt denne strategien har også blitt brukt i transgen sebrafisk for å identifisere gener som hemmer aktivert RAS -indusert start rhabdomyosarcoma 31 og endre strålingen følsomhet av MYC-indusert T-celle akutt lymfatisk leukemi 31. Videre Langenau et al, 15 har vist at å kombinere coinjection tilnærming med et varmesjokk-induserbar transgen tilnærming kan indusere transgene uttrykk ved varmesjokk i hovedsak injisert fisk, noe som ville være svært nyttig i å utforske samarbeids roller oncogenes i tumor progresjon, som det tillater genuttrykk som skal slås på etter den primære svulsten er etablert. Ganske nylig, Langenau og kolleger utviklet den første immunkompromittert sebrafisk-modellen ved å målrette rag2 genet med konstruerte sink-finger nukleaser 43. Tapav funksjon av rag2 tillatt robust og langsiktig engraftment av flere vev og kreftceller 43, en fordel som kan være nyttig i transplantere de heterogene kreftceller som overuttrykker kandidattransgener og vurdere effekten av mosaikk transgene uttrykk på selvfornyelse kapasitet, terapeutisk svar og veksten av disse kreftceller.

Til slutt, mosaikk transgenesis tilbyr en annen unik fordel i forhold stabil transgenesis. I stabile transgene dyr, blir transgener er integrert i genomet til hver eneste celle i kroppen og er arvelig fra generasjon til generasjon 27. Men mange kreftformer oppstå fra genetiske endringer i somatiske celler i stedet for arvet mutasjoner i kjønnsceller 44. Dermed mosaikkmønster av transgenet integrasjon i den primære injisert fisk og blandet genotyper innenfor celle populasjoner av individuelle mosaikk transgene fisken ville bedre rekapitulere the somatiske feil som er funnet hos pasienter, og ville unngå det kunstige posisjons effekt forårsaket av en enkelt innføringsstedet i en stabil transgen linje. På den annen side, gjør mekanistisk studie vanskeligere mosaicism og liten populasjon av celler som overuttrykker den transgener i hovedsak injisert fisk.

Oppsummert gir mosaikk transgen strategi et robust verktøy for rask og effektiv vurdering av samarbeidet bidrag oncogenes til tumor initiering og spredning. Dette forhånd er ventet å generere brytende informasjon om samspillet mellom kandidat onkogener, som er sterkt behov for ytterligere produktiv etterforskning av onkogene mekanismer og stier og for å utvikle effektive målrettet terapi. Effektivisering av kointegrasjon av mer enn tre coinjected DNA-konstruksjoner ville åpne muligheten for undersøkelse av de komplekse forhold mellom samtidig uttrykt multigen kombinasjoner i ulike typer kantillitsvalgte. Utfordringene fremover vil være å endre mosaikk transgen strategi for å imøtekomme eventuelle genomisk eller epigenetisk endring som kan spille en rolle i den neoplastisk prosess, heller enn å begrense bruken til mutasjoner som endrer bare protein-koding eller til gener er overexpressed tjente eller forsterkes. Nylig har forbedrede genom redigering teknikker, slik som transkripsjons aktivator lignende effektor nukleaser (TALENS) 45 og gruppert regelmessig avbrutt av korte palindromiske gjentagelser (CRISPR) / CRISPR-assosiert (CAS) systemer 46, blir mye brukt til raskere og mer effektivt modifisere endogene gener i forskjellige typer av celler og organismer 46. Slike teknikker ville tillate oss å utføre målrettede, effektive modifikasjoner av genomsekvens og genuttrykk i sebrafisk modellsystemet og for å bedre forstå mekanismen (e) underliggende rolle genomisk eller epigenetiske forandringer i tumor patogenesen. Dette, i sin tur, er sannsynlig å anspore the utvikling av nye molekylære terapeutika for en rekke kreftformer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expand Long Template PCR System  Roche Applied Science, IN 11681834001
pCR-TOPO vector  Invitrogen, CA 451641
T4 DNA ligase New England Biolabs, MA M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme
Mix		 Invitrogen, CA 11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix Invitrogen, CA 11789-020
GC-RICH PCR System  Roche Applied Science, IN 12 140 306 001
Meganuclease I-SceI  New England Biolabs, MA R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope  Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera Nikon, NY

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10 (6), 353-358 (2009).
  2. Maher, B. Exome sequencing takes centre stage in cancer profiling. Nature. 459 (7244), 146-147 (2009).
  3. Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat Rev Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
  4. Chung, C. C., Chanock, S. J. Current status of genome-wide association studies in cancer. Hum Genet. 130 (1), 59-78 (2011).
  5. Mosse, Y. P., et al. Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene. Nature. 455 (7215), 930-935 (2008).
  6. Janoueix-Lerosey, I., et al. Somatic and germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 967-970 (2008).
  7. George, R. E., et al. Activating mutations in ALK provide a therapeutic target in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 975-978 (2008).
  8. Zhu, S., et al. Activated ALK Collaborates with MYCN in Neuroblastoma Pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
  9. White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
  10. Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
  11. Konantz, M., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).
  12. Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
  13. Kettleborough, R. N., et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).
  14. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  15. Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
  16. Feng, H., et al. T-lymphoblastic lymphoma cells express high levels of BCL2, S1P1, and ICAM1, leading to a blockade of tumor cell intravasation. Cancer Cell. 18 (4), 353-366 (2010).
  17. Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current biology : CB. 15 (3), 249-254 (2005).
  18. Santoriello, C., Anelli, V., Alghisi, E., Mione, M. Highly penetrant melanoma in a zebrafish model is independent of ErbB3b signaling. Pigment Cell Melanoma Res. 25 (2), 287-289 (2012).
  19. Leacock, S. W., et al. A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis. Dis Model Mech. 5 (1), 95-106 (2012).
  20. Le, X., et al. Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).
  21. Langenau, D. M., et al. Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma. Genes & development. 21 (11), 1382-1395 (2007).
  22. Park, S. W., et al. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
  23. Zheng, W., et al. Xmrk, kras and myc transgenic zebrafish liver cancer models share molecular signatures with subsets of human hepatocellular carcinoma. PLoS One. 9 (3), e91179 (2014).
  24. Forrester, A. M., et al. NUP98-HOXA9-transgenic zebrafish develop a myeloproliferative neoplasm and provide new insight into mechanisms of myeloid leukaemogenesis. British journal of haematology. 155 (2), 167-181 (2011).
  25. Alghisi, E., et al. Targeting oncogene expression to endothelial cells induces proliferation of the myelo-erythroid lineage by repressing the Notch pathway. Leukemia. 27 (11), 2229-2241 (2013).
  26. Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Dis Model Mech. 7 (7), 745-754 (2014).
  27. Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nat Rev Genet. 2 (12), 956-966 (2001).
  28. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  29. Igoucheva, O., Alexeev, V., Yoon, K. Differential cellular responses to exogenous DNA in mammalian cells and its effect on oligonucleotide-directed gene modification. Gene Ther. 13 (3), 266-275 (2006).
  30. Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).
  31. Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
  32. Chen, Y., et al. Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 971-974 (2008).
  33. Pugh, T. J., et al. The genetic landscape of high-risk neuroblastoma. Nature genetics. , (2013).
  34. Berry, T., et al. The ALK(F1174L) mutation potentiates the oncogenic activity of MYCN in neuroblastoma. Cancer Cell. 22 (1), 117-130 (2012).
  35. Heukamp, L. C., et al. Targeted expression of mutated ALK induces neuroblastoma in transgenic mice. Sci Transl Med. 4 (141), 141ra191 (2012).
  36. Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126 (17), 3757-3767 (1999).
  37. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  38. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  39. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  40. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (50), 19827-19832 (2008).
  41. Caneparo, L., Pantazis, P., Dempsey, W., Fraser, S. E. Intercellular bridges in vertebrate gastrulation. PLoS One. 6 (5), e20230 (2011).
  42. Ivics, Z., Izsvak, Z. The expanding universe of transposon technologies for gene and cell engineering. Mob DNA. 1 (1), 25 (2010).
  43. Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
  44. Watson, I. R., Takahashi, K., Futreal, P. A., Chin, L. Emerging patterns of somatic mutations in cancer. Nat Rev Genet. 14 (10), 703-718 (2013).
  45. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
  46. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).

Tags

Developmental Biology sebrafisk dyremodell mosaikk transgenesis coinjection funksjonell genomforskning tumor initiering
Mosaic Sebrafisk transgenesis for Funksjonell Genomisk Analyse av søker Cooperative Gener i Tumor Patogenese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, … More

Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis. J. Vis. Exp. (97), e52567, doi:10.3791/52567 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter