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Developmental Biology

Mosaic Zebrafisch Transgenese für Funktionelle Genomanalyse Candidate Cooperative Gene in Tumor Pathogenese

Published: March 31, 2015 doi: 10.3791/52567
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 1,3
1Department of Molecular Pharmacology & Experimental Therapeutics, Mayo Clinic College of Medicine, Center for Individualized Medicine, 2Tufts University School of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic

Introduction

Krebserkrankungen sind progressive Erkrankungen, die durch die Anhäufung von pathologischen Mutationen, Deletionen und Chromosomen gewinnt mit der Zeit gekennzeichnet. Diese genetischen Anomalien können mehrere zelluläre Prozesse, die vom Zellzyklus, Zelltod, energetische Metabolismus und Zusammensetzung des Zytoskeletts zu Reaktionen wie Hypoxie Stress beeinflussen. Daher spiegelt die Tumorgenese kollektive Aktionen von mehreren genetischen Veränderungen in einem breiten Spektrum von biologischen Prozessen. Neue integrative genomische Forschung, einschließlich Sequenzierung ganzer Genome, Exoms Sequenzierung, die gezielte Sequenzierung, deep sequencing und genomweiten Assoziationsstudien haben eine wachsende Zahl von neuen genetischen Veränderungen im Wesentlichen alle Arten von Tumoren 1-4 identifiziert. In vielen Fällen gemeinsam auftreten die genetischen Läsionen in einem nicht-zufälligen Weise 5-8, was darauf hindeutet, ihre Zusammenarbeit bei der Krankheitsentstehung. Sezieren der onkogenen Rollen der großen Palette von aberrant exprimierter Gene resultierenden from diese genomische Veränderungen ist notwendig, um neue therapeutische Strategien zu entwickeln und um die Antworten von Tumorzellen gegenüber diesen Substanzen zu verstehen, aber das hat sich als eine schwierige Aufgabe sein, die eine sehr robuste Tiermodellsysteme für die Durchführung von Hochdurchsatz-funktionelle Genomanalyse vivo.

Obwohl Säugetiere, insbesondere Nagetiere, sind bevorzugte Modelle in der Krebsbiologie hat der Zebrafisch begonnen, erhebliche Aufmerksamkeit zu erregen. Die Knochenfische Zebrabärbling (Dario rerio) als Modellorganismus für die Entwicklungsstudie seit 1960 im Einsatz und wurde zum ersten Mal auf die Untersuchung von Tumor Pathogenese 1982 9-11 angewendet. Einfache Wartung, geringe Körpergröße, und hohe Fruchtbarkeit machen den Zebrafisch ein robustes Modell für eine groß angelegte Vorwärts genetischen Screens von Mutationen, die abnorme und pathologische Phänotypen 10 verleihen identifizieren. Die optische Transparenz der Zebrafischembryonen ist ein weiteres wichtiges Merkmal unterstützt breitere Verwendung dieser Krebs-Modell, wiesie ermöglicht in vivo-Bildgebung, um durchgeführt, um die Tumorentwicklung in Echtzeit 9 zu finden, eine Anwendung, die bei Nagern 12 relativ schwer werden. Neueste vergleichende Genomik Analyse der Zebrafisch Referenzgenom (ZV9) ergab 26.206 Protein kodierende Gene, mit 71% mit menschlichen Orthologe, von denen 82% sind mit krankheitsassoziierten Genen im Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) Datenbank 13 korreliert, 14. Folglich ist die Zebrafisch wurde verwendet, um diverse Arten von menschlichen Krebsarten, einschließlich Neuroblastom Muster 8, T-Zell-akute lymphatische Leukämie (T-ALL), 15,16, 17,18 Melanom, Ewing-Sarkom 19, Rhabdomyosarkom 20,21, Pankreaskarzinom 22, 23 und Leberzellkarzinom myeloischen malignen Erkrankungen, 24,25, und wurde ausgewählt, wie ein Krebs-Modell für die Xenotransplantation studiert 11,26.

Eine stabile transgeneAnsatz im Zebrafisch wird häufig verwendet, um die Wirkung der Verstärkung-of-Funktion von Genen in der normalen Entwicklung oder Pathogenese 27,28 studieren. Ein solches Modell (Figur 1A) zu entwickeln, injiziert man ein DNA-Konstrukt, das das Gen von Interesse durch einen gewebespezifischen Promotor in die Ein-Zellen Wildtyp-Embryonen angetrieben enthält. Drei bis vier Monate nach der Injektion, wenn die injizierten Embryos geschlechtsreif sind, werden sie mit Wildtyp-Fischen ausgekreuzt, um diejenigen, die die Integration des DNA-Konstrukts in ihrer Keimbahn, die sie als Gründer Fisch Bildschirm Lizenzen. Viele Faktoren, wie beispielsweise die Kopienzahl und die Integrationsstelle des Transgens, beeinflussen die Expression des Transgens in stabilen transgenen Linien. Somit, um eine transgene Tumormodell zu entwickeln, haben, mehreren stabilen transgenen Linien Expression eines einzelnen Onkogen, zunächst erzeugt und für die Linie, die das Transgen in einer Ebene, die zu Tumorentstehung führen könnte exprimieren gescreent werden. Allerdings, wenn die Überexpression eines Kandidaten oncogene toxisch für Keimzellen, ist es schwierig, eine stabile transgene Linie erzeugt durch direkte Überexpression des Transgens 29. Daher kann dieser Ansatz sehr zeitaufwändig sein, mit einem hohen Risiko des Scheiterns, um ein geeignetes Modell Krebs erzeugen.

Hier zeigen wir eine alternative Strategie, die auf Mosaik transiente Transgenese (1B), die einzigartige Vorteile gegenüber herkömmlichen stabilen Transgenese für funktionelle genomische Untersuchung in vivo zur Verfügung stellt. In diesem Ansatz werden eine oder mehrere transgene Konstrukte in der Ein-Zell-Stadium von transgenen und Wildtyp-Embryos injiziert. Die injizierten DNA-Konstrukte, die Transgene sind dann mosaik und zufällig in den Primär injiziert Fisch integriert, was zu einer gemischten Genotypen in mehreren Zellpopulationen in den einzelnen Fisch 30. Außerdem Koinjektion von mehreren DNA-Konstrukte in einem Zellembryonen zu Co-Integration in die gleiche Zelle an zufälligen Stellen, so dass man trace die Zellen mit Expression von Transgenen und erkunden Sie die Wechselwirkungen verschiedener Gene im Krankheitsentstehung in den Mosaik-Tiere 31. Als Beweis für das Prinzip, transient wir im peripheren sympathischen Nervensystems (PSNS) unter der Kontrolle des Dopamin-beta-Hydroxylase (d & bgr; h) Promotors in Wildtyp-Fisch und transgene Fische überexprimierenden MYCN überexprimiert Mutation aktiviert ALK (F1174L) mit mCherry Reportergens. ALK, das einen Rezeptor-Tyrosin-Kinase kodiert, ist das am häufigsten mutierte Gen in Hochrisiko-Neuroblastom 5-7,32,33. ALK (F1174L), als eine der häufigsten und potente somatischen aktivierenden Mutationen ist in überrepräsentiert MYCN- verstärkt Neuroblastom-Patienten mit hohem Risiko und wirkt synergistisch mit MYCN Expression auf Neuroblastom Tumorentstehung in der stabilen transgenen Mäusen und transgenen Zebrafisch Modelle 8,34,35 beschleunigen. Durch Mosaiktransiente Überexpression von ALK (F1174L) mit mCherry im MYCN transgene Fische, rekapituliert wir die Beschleunigung der in der stabilen transgenen Fischen Überexpression sowohl ALK (F1174L) und MYCN beobachteten Tumor Beginn, was darauf hindeutet, dass das Mosaik Transgenese Strategie kann schnell und effizient eingesetzt werden Bewertung der relativen Beiträge mehrerer Onkogene in Tumorinitiation in vivo.

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Protocol

HINWEIS: Alle Zebrafisch Studien und Pflege der Tiere wurden in Übereinstimmung mit der Mayo-Klinik Institut IACUC genehmigten Protokoll # A41213 getan.

1. DNA-Konstrukte für Transgenese

  1. Amplify ein 5,2-kb Dopamin beta-Hydroxylase (d & bgr; h) Promotorbereich 8 mit dem CH211-270H11 BAC-Klon (von BACPAC Ressourcen-Center (BPRC)) als DNA-Template. Verwenden eines PCR-System geeignet für lange und genaue PCR-Amplifikation langer DNA-Matrizen und den folgenden Zyklus Programme für PCR: 94 ° C für 2 min, 10 Zyklen (94 ° C, 15 sec, 50 ° C, 30 sec, 68 & deg; C, 8 min), gefolgt von 30 Zyklen (94 ° C, 15 sec, 53 ° C, 30 sec, 68 ° C, 8 min), 68 ° C, 4 min (Vorwärtsprimer 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 ' und Rückwärtsprimer 5'- GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 ').
  2. Erstellen Sie die d & bgr; h -pDONRP4-P1R Eintrag clone 8 mit kommerziellen rekombinanten Klonen System wie Multisite-Gateway. Mischen Sie 1 ul gereinigtes dβh PCR-Produkt (172 ng / ul), 1 ul (150 ng / ul) pDONRP4-P1R Donorvektor (zusammen mit anderen Gateway Vektoren sind großzügige Geschenke von Dr. Chi-Bin Chien, Univ. Of Utah) , 4 & mgr; l TE-Puffer (pH 8,0) mit 2 ul BP Clonase Enzymmix, Inkubation 1 h bei 25 ° C und dann in One Shot TOP10 kompetente E. Transformation coli nach dem Protokoll des Herstellers.
  3. Generieren Sie die d & bgr; h: EGFP-transgenen MYCN konstruieren 8 mit in Schritt 1.2 genannten rekombinanten Klonen System. Mischen Sie 1 ul jeder entry clone (150 ng / ul) mit einem 5,2-kb dβh Promotor (dβh -pDONR P4-P1R Konstrukt), EGFP fehlt ein Stop-Codon (PME-EGFP Konstrukt) und menschliche MYCN cDNA (ein großzügiges Geschenk von Dr. Hogarty an der Kinderklinik von Pennsylvania, MYCN-pDONRP2R-P3 Konstrukt), 1 ul (150 ng / ul) des modifizierten Zielvektor, der I-SceI-Erkennungsstellen (ein großzügiges Geschenk von Dr. C. Grabher, Karlsruher Institut für Technologie, Karlsruhe, Deutschland), 4 ul TE Puffer ( pH-Wert 8,0) mit 2 & mgr; l LR Clonase Enzymmix, Inkubation 1 h bei 25 ° C und dann zu transformieren, um chemisch kompetente E. coli, wie One-Shot-Top-10 und folgen Sie dem Protokoll des Herstellers.
  4. Stellen mitf: mitf transgenen Konstrukt 8 durch Verdauen des PNP-mitf Vektor mit NotI und SalI Restriktionsenzyme für 2 h bei RT und durch Subklonieren des frei 2,65-kb (ein großzügiges Geschenk von Dr. D. Raible, Univ of Washington.) DNA-Fragment, das die MITF-Promotor und die kodierende Sequenz des Zebrafisch MITF Gen in die NotI und MluI-Stellen eines modifizierten pBluescript-Vektor, der flankierenden I-SceI-Erkennungsstellen enthält (ein großzügiges Geschenk von Dr. Hui Feng, Boston University), unter Verwendung von T4-DNA-Ligase gemß dem Protokoll des Herstellers.
    HINWEIS: Um die Effizienz der Erzeugung von stabilen MYCN exprimierenden Linien zu erhöhen, d & bgr; h: EGFP-MYCN und mitf:. Mitf DNA-Konstrukte sind in einem Zellstadium Perlmutt Embryonen koinjiziert Perlmutt bezeichnet eine Art von mutierten Fische fehlt ein Neuralleiste stamm Melanophor während der Entwicklung 36. Somit kann die Erscheinung von Pigmentzellen in den injizierten Embryos schlägt die Integration MITF: MITF DNA-Konstrukte in das Genom. Es wurde gezeigt, dass zwei oder drei koinjiziert DNA-Konstrukte können in das Fischgenom 31 kointegriert werden. EGFP-MYCN Transgen und zur leichteren Identifizierung von MYCN stabile transgene Linie: So kann die Pigmentierung von mitf Ausdruck verursacht als Marker für die Integration der dβh dienen.
  5. Mischen Sie die d & bgr; h: EGFP-MYCN und mitf: mitf DNAKonstrukte in einem 3: 1-Verhältnis in einem Gesamtvolumen von 15 & mgr; l Reaktion mit 1 & mgr; l von I-SceI Enzym und 0,75 ul Puffer. Sicherzustellen, dass die Gesamtmenge an DNA in der Reaktion nicht 750 ng nicht überschreiten.
  6. Führen Sie die I-SceI Verdauung bei RT für 4 h oder O / N. Am zweiten Tag wird die I-SceI- verdauten DNAs bereit sind für die Mikroinjektion oder bei -20 ° C für die Injektion in der Zukunft gespeichert werden. Bewahren Sie die I-SceI Enzym bei -80 ° C in kleinen Aliquots seiner Enzym zu gewährleiste.
  7. Subklonieren die menschliche ALKF1174L und Wildtyp-ALK-Gen aus dem pcDNA3-Vektor (ein großzügiges Geschenk von Dr. George am Dana-Farber Cancer Institute) 7 in EcoRI- und NotI-Stellen eines pENTRY1A Vektor (ein großzügiges Geschenk von Dr. C. Grabher, Karlsruher Institut für Technologie, Karlsruhe, Deutschland) unter Verwendung von T4-DNA-Ligase gemß dem Protokoll des Herstellers.
  8. Generieren Sie die d & bgr; h: ALKF1174L </ Em> oder dβh: ALKWT transgene Konstrukte mit dem rekombinanten dessen Einzelheiten in Protokoll 1.2 erwähnt. Kurz gesagt, kombiniert drei Eingabe Klone dβh -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (oder ALKWT -pENTRY1A) und P3E-polyA, in die modifizierte Zielvektor, der I-SceI-Erkennungsstellen (ein großzügiges Geschenk von Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institut für Technologie, Karlsruhe, Deutschland), mit LR Clonase Enzym-Mischung, nach dem Protokoll des Herstellers.
  9. Mischen Sie die d & bgr; h: ALKF1174L (oder dβh: ALKWT) und dβh: mCherry DNA-Konstrukte zu einem 3: 1-Verhältnis und linearisieren sie mit I-SceI Enzym wie in PROTOKOLL 1,5-1,6 beschrieben.

2. Mikroinjektion

  1. Verwenden Sie Glasmikropipetten mit 1,0 mm Durchmesser für alle Injektionen 37. Brechen Sie die Spitze der Glasmikropipetten mit einer Rasierklinge vor der Injektion. Kalibrieren Sie das Injektionsvolumen von spritzening H 2 O in einen Tropfen Mineralöl. Der Durchmesser der resultierenden Tröpfchen und einstellen Mikroinjektor (Druck oder die Dauer der Druckimpuls), um sicherzustellen, dass das Injektionsvolumen von weniger als 10% des gesamten Zellvolumens von einem zell Embryonen.
  2. Fügen Sie eine zusätzliche 0,5 ml frisches I-SceI Enzym (5 Einheiten / ul) in 5 ul Injektionslösung, die DNA-Konstrukte direkt vor der Injektion die Effizienz der Transgenese 38 zu erhöhen. Injizieren 50-80 pg linearisierter DNA-Konstrukte in das Zytoplasma einer Zelle-Embryonen. Um den Erfolg von Injektions sicherzustellen, mischen die Probe mit 0,25% Phenolrot zur Visualisierung. Wenn Zellen rot nach der Injektion, bedeutet dies, die Mikroinjektion erfolgreich ist. Um eine hohe Erfolgsquote für die Erzeugung transgener Fische zu gewährleisten, haben wir spritzen typischerweise bis zu 500 Embryonen.
  3. Um transgene Fische stabil exprimieren MYCN erzeugen, coinject das linearisierte d & bgr; h: EGFP-MYCN und MITF: MITF-DNA-Konstrukten (in einer 3: 1-Verhältnis) in Embryonen der Pigmentierung Mutante Perlmuttzebrafisch beim Ein-Zell-Stadium. Die Expression Mitf dient als Reporter für die Integration der transgenen Konstrukte im Fischgenom.
  4. Für Mosaikexpression von ALK in dem Wildtyp oder MYCN transgenen Embryos, Co-Injektion das linearisierte d & bgr; h: ALK F1174L (oder dβh: ALKWT) mit dβh: mCherry DNA-Konstrukte (bei ​​einem Verhältnis 3: 1) in die Ein-Zelle Embryonen aus der Zucht von F1 heterozygot Tg (dβh: EGFP-MYCN) erhaltenen transgenen Fisch mit Wildtyp AB Fische. So die Hälfte der Nachkommen transgen sind für MCYN und die Hälfte sind Wildtyp.

3. Bildschirm für stabile oder Mosaic transgene Fische

  1. Um die Effizienz der Identifizierung von stabilen MYCN -exprimierenden Leitungen zu erhöhen, zu betäuben vorwiegend injiziert Perlmutt Embryonen Tricaine (0,02%) at Tage 3-5 des postfertilization und Bildschirm für die Pigmentierung. Übertragen Sie die Embryonen mit Pigmentierung auf eine neue Petrischale mit frischen Ei Wasser und heben Sie sie bis zur Geschlechtsreife für weitere Überprüfungen für den Gründer Fisch, der den d & bgr; h durchzuführen: EGFP-MYCN Transgen in den Keimzellen.
  2. So ermitteln Sie den Gründer mit Keimbahntransmission von EGFP-MYCN, Outcross pigmentierte F0 wachsene Fische mit Wildtyp AB Fische und Bildschirm für EGFP-positiven Embryonen im 1-2 Tage nach der Befruchtung für weitere Genotypisierung. Legen Sie eine einzelne EGFP-positiven F1 Embryo in ein PCR-Röhrchen und entfernen Sie alle Flüssigkeit. In 50 ul von gDNA Extraktionspuffer, die 12,5 ul der 4x Lysepuffer, 35 ul H 2 O und 2,5 ul Proteinase K (10 mg / ml), um Embryo enthält. Inkubieren der Reaktion für 2-3 h bei 55 ° C, gefolgt von 10 Minuten Inkubation bei 98 ° C zur Inaktivierung von Proteinase K. Zu 50 ml 4x Lysepuffer machen, 500 & mgr; l von 1 M Tris (pH 8,4), 2,5 ml 1 M KCl to 47 ml H 2 O. HINWEIS: Nach dem F0 MYCN stabile transgene Fische mit Wildtyp AB Fische gezüchtet, die alle die Nachkommen pigmentiert sind. So Pigmentierung nicht als Marker zur Identifizierung von MYCN- positive Fisch servieren. Während in der MYCN transgene Fische wird das EGFP-MYCN Fusionsprotein im PSNS exprimiert, einschließlich der sympathischen Neuronen des oberen Halsganglien und sequentiellen Ganglien des sympathischen Kette und den nicht PSNS dopaminergen Neuronen wie die Medulla oblongata und Kopfganglien 8. So kann die Expression von EGFP als Marker zur Identifizierung der MYCN stabilen transgenen Embryos dienen.
  3. Verwenden Sie 2 ul von gDNA aus der pigmentierten F1 Embryo als Vorlage extrahiert Primer MYCN -test F1: 5'-CTG CTT GAG GAG AAC CTG TG-3 '; MYCN -R3: 5'-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 ', und das folgende Programm Witzh die GC-RICH PCR System: 1 Zyklus 95 ° C für 3 min, 25 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 58 ° C für 30 sec, und 72 ° C für 3 min. Wir Genotyp typischerweise 14-16 pigmentierten Embryonen aus einer Paarung, die Anwesenheit von integrierten MYCN Transgen in den pigmentierten Embryonen wurden über 6 Gründer Fisch überexprimieren MITF und MYCN wurden durch dieses Verfahren identifiziert bestätigen.
  4. Heben Sie den Rest der EGFP-positiven F1-Embryonen. Fin Clip und Genotyp sie bei 2-3 Monate alt Verwendung des obigen Protokolls, um die Integration des Transgens in MYCN Fisches weiter zu bestätigen. Breed F1 MYCN stabile transgene Fische mit Wildtyp AB Fische. Co-spritzen den linearisiert d & bgr; h: ALK F1174L (oder dβh: ALKWT) mit dβh: mCherry DNA-Konstrukte in den einzelligen Embryonen in Protokoll 2.4 beschrieben.
  5. Sortieren Sie die MYCN exprimierenden Embryos im Experiment in PROTOKOLL 2.4 beschrieben mit einem stereoskopischen Fluorescence Mikroskop und Bildschirm, die in erster Linie injizierten Embryonen an den Tagen 1-3 von postfertilization für die Expression von EGFP-MYCN im PSNS. Dann, während der Tage 2-5 des postfertilization, betäuben die Embryonen mit Tricaine (0,02%) und sortieren diese MYCN- positive oder negative Embryonen wieder basierend auf der Expression von mCherry im PSNS Verwendung eines stereoskopischen Fluoreszenzmikroskop. Die Expression mCherry dient als Marker für die Coexpression von ALK in Geweben der Mosaikprimär injizierten Tieren.
    HINWEIS: ~ 600 Nachkommen aus der Zucht von MYCN stabile transgene Fische mit Wildtyp-Fisch resultierenden Pro Gruppe wurden mit den linearisierte DNA-Konstrukte injiziert, einschließlich d & bgr; h: ALK F1174L und dβh: mCherry, dβh: ALKWT und dβh: mCherry oder dβh : mCherry allein sind. Mosaik Expression mCherry in 70-90% des hauptsächlich eingespritzten Fische beobachtet werden. Die Hälfte einer ein-Drittel des injizierten Fische überlebten durch die Larvenstadium zur Tumor Uhr.
  6. Heben Sie die gesamte mCherry + MYCN + und mCherry + MYCN - Embryonen gemäß den Standardprotokollen aus der Zebrafisch-Buch 39 und überwachen Tumor Beginn beginnend bei 5 Wochen postfertilization.

4. Tumor Watch in Mosaic transgene Fische

  1. Überwachen mCherry- positive primär injiziert Fisch alle 2 Wochen ab 5 Wochen postfertilization zum Nachweis von Tumor Beginn.
  2. Anesthetize Fisch mit Tricaine (0,02%) und der Bildschirm für die Anwesenheit von mCherry - und EGFP-exprimierenden Tumoren in den PSNS unter Nikon SMZ-1500 stereoskopischen Fluoreszenzmikroskop mit einer Digitalsicht DS-U1-Kamera ausgestattet.
  3. Um zu bestätigen, ob die Tumoren der ALK Transgen exprimieren, isolieren mCherry- und EGFP-positive Massen für ALK Genotypisierung PCR.
  4. Unter Verwendung von PCR, verstärken genomischer DNAALK P7:: 5'-AGG CCA GGT GTC CGG AAT GC-3 'und ALK P18: 5'-TGT CTT CAG GCT GAT GTT GC-3' und die folgende PCR-Reaktion: 1 Zyklus aus entwickelten Tumoren mit den folgenden Primern extrahiert von 94 ° C für 5 min, 30 Zyklen (94 ° C für 30 sec, 55 ° C für 30 sec, und 72 ° C für 60 sec). Dann Folge das PCR-Produkt mit ALK P7 Primer weiter die Existenz von mutierten oder Wildtyp-ALK in den mCherry-positiven Tumoren bestätigen.

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Representative Results

Um zu untersuchen, ob die Überexpression von Mutation aktiviert ALK F1174L oder Wildtyp-ALK konnte mit MYCN in Neuroblastom-Induktions zusammenzuarbeiten, überexprimiert wir entweder aktivierten menschlichen ALK oder Wildtyp-menschlichen ALK unter der Kontrolle der d & bgr; h Promotor in der PSNS transgener Fische überexprimierenden MYCN. Eine der folgenden Konstrukte, dβh - ALKF1174L oder dβh - in einzelligen Wildtyp oder MYCN transgenen Embryos (2A) 8 mCherry - ALKWT wurden mit dβh koinjiziert. Die Expression mCherry diente als ein Marker für die Coexpression von ALK in Geweben der Mosaikprimär injizierten Tieren. Alle erwarteten Genotypen wurden in der injizierten Fisch dargestellt: (1) MYCN -exprimierenden Fisch mit Mosaik Coexpression aktiviert ALKF1174L und mCherry MYCN exprimierenden Fisch mit Mosaik-Co-Expression von Wildtyp-ALK und mCherry, bezeichnet MYCN; Mosaik ALKWT; (3) MYCN exprimierenden Fisch mit Mosaik Ausdruck mCherry, bezeichnet MYCN; Mosaik mCherry; (4) Wildtyp-Fisch mit Mosaik Koexpression aktiviert ALKF1174L und mCherry, bezeichnet WT; Mosaik ALKmut; und (5) Wildtyp-Fisch mit Mosaik-Co-Expression von Wildtyp-ALK und mCherry, bezeichnet WT; Mosaik ALKWT. Ein Tumor Uhr wurde dann durchgeführt, alle 2 Wochen 5 Wochen postfertilization (WPF) auf insgesamt 492 injizierten Tieren.

Acht GFP + / mCherry + Tumoren entstand im Interrenal- Drüse des menschlichen Nebenniere gleichwertigen, von 9 wpf im MYCN exprimierenden Fisch koinjiziert mit d & bgr; h - ALKF1174 L und dβh - mCherry (2B und 3). Diese Tumoren waren histologisch, immunhistochemisch und ultrastrukturell vergleichbar mit humanen Neuroblastom (Daten in Bezug 8 zu finden). ALKWT und dβh - - Im Gegensatz dazu wurden keine Tumore durch Alter von 9 Wochen im MYCN exprimierenden Fisch mit dβh koinjiziert beobachtet mCherry (2C und 3, p = 0,002) oder injiziert mit dβh - mCherry allein (den 2D und 3, p = 0,007). Tumoren entstanden sowohl im MYCN; Mosaik ALKWT und MYCN; Mosaik mCherry Fisch mit der gleichen Rate der Induktion nach 12 Wochen alt sind. Darüber hinaus wurden Neuroblastome in keiner Wildtyp-Fisch während der 15 Wochen der Überwachung entweder mit dem Wildtyp-ALK und mCherry oder ALKF1174L und mCherry Transgene koinjiziert erkannt. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass Mosaikexpression von Mutation aktiviert ALK beschleunigt MYCN induzierten Tumor onsoll, unabhängig von der Integrationsstelle in einzelnen Mosaiktiere, und dass die Überexpression von Wildtyp-ALK auf den Ebenen von der dβh Promotor angetrieben scheint nicht mit MYCN Expression zusammenarbeiten, um Neuroblastom in diesem Modellsystem zu induzieren.

Figur 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung von konventionellen stabilen und Mosaik transiente Zebrafisch transgenen Strategien im Studium der Genossenschaft Beiträge der Kandidaten Onkogene zur Tumorentstehung (A) Stabile transgene Strategie.. Linearisierte transgene DNA-Konstrukt, das Kandidaten-Onkogen zu einem Zellstadium Wildtyp- oder Perlmutt mutierten Zebrafischembryos, wo das Transgen in das Fischgenom zufällig genomische Loci integriert werden injiziert. Integration des Transgens in die Keimzellen für die gene erforderlichen von stabilen transgenen Linie. In erster Linie injizierten Embryonen nehmen 3 bis 4 Monate bis zur Geschlechtsreife (F0-Generation der Fische), die mit dem Wildtyp oder Mutante Perlmutt Fisch ausgekreuzt werden, um für den Gründer Fisch mit dem Transgen Keimbahntransmission screenen, zu erreichen. Die sich ergebende Nachkommen des Gründers Fisch, zu bezeichnen die F1-Generation, tragen die heterozygote Allele des Transgens in ihrem Genom. Um die kooperative Effekte der beiden Kandidaten Onkogenen, wie zum Beispiel Gen "a" und Gen "b", in der Tumorgenese zu bewerten, gezüchtet wir den F1-Nachkommen von zwei stabilen transgenen Linien Überexpression dieser Gene, also mit nur einem Viertel der Nachkommen trägt die Verbindung Transgene. Aufgrund der relativ geringen Effizienz der Erzeugung von stabilen transgenen Linien, ist dieser Ansatz nicht durchführbar für Hochdurchsatz-Genom-Analysen. (B) Mosaic transient transgenen Strategie. Ähnlich wie bei der stabilen Transgenese, linearisierte transgene DNA co nstructs, die Kandidaten-Gene können in einen Zellstadium Wildtyp-Embryonen injiziert werden. Weil das Transgen nicht in das Genom der Keimzellen integriert werden, kann viel Zeit und Aufwand bei der Ermittlung Gründer Fisch gespeichert. Alternativ, wenn die transgene Fische Linie Überexpression einer der Kandidaten Onkogene ist (in unserem Fall wurden MYCN transgene Fische entwickelt), linearisiert transgenen DNA-Konstrukte, die andere Kandidaten-Gene können in einen Zellstadium transgenen Embryos injiziert, um ihre Zusammenarbeit im zu untersuchen Tumorgenese. Bis zu drei transgene Konstrukte können koinjiziert und in erster Linie injiziert Fisch 31 coexprimiert werden; so kann das Zusammenspiel von Kandidaten Onkogene in der Tumorgenese in der vor allem injizierten Fische beurteilt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Abbildung 2: Mosaic Expression von Aktiv ALK beschleunigt das Auftreten von MYCN induzierte Neuroblastom 8 Modifizierte Abbildung mit Genehmigung von Elsevier (Referenz 3466510609819).. (A) Ansatz zur Konstruktion von Mosaik Transgenese. (BF) 2 Tage alte Larven von primär injizierten Embryonen. Seitenansichten stabil EGFP-Expression in den dopaminergen Neuronen, einschließlich Kopfganglien (CG, Pfeilspitzen) in zusammengeführte Fluoreszenz-Hellfeld Bilder (obere Felder). Seitenansichten Mosaik mCherry Ausdruck (untere Felder) in der Kopfganglien (CG, Pfeilspitzen), Medulla oblongata (MO, Pfeile). Einige ektopische mCherry Expression im nicht-PSNS und nicht-dopaminergen Neuronen beobachtet. (G - K) 7 Wochen alte vorwiegend injiziert Fisch.(F, G) MYCN exprimierenden Fisch koinjiziert mit d & bgr; h - ALKF1174L und dβh - mCherry Konstrukte (MYCN; Mosaik ALKmut). EGFP - und mCherry -positiven Tumoren entstanden 7 Wochen (weiße leere Pfeile in G). (C, H) ​​MYCN exprimierenden Fisch mit dβh koinjiziert - ALKWT und dβh - mCherry Konstrukte (MYCN; Mosaik ALKWT). (D, I) MYCN exprimierenden Fisch mit dβh injiziert - mCherry konstruieren allein (MYCN; Mosaik mCherry). (E, J) Wildtyp (WT) Fisch mit dβh koinjiziert - ALKF1174L und dβh - mCherry Konstrukte (WT; Mosaik ALKmut). (F, K) Wildtyp (WT) Fisch mit dβh koinjiziert - ALKWT und dβh - mCherry-Konstrukte (WT; Mosaik ALKWT). MCherry oder dβh - - Neuroblastomen wurden in der MYCN exprimierenden Fisch mit dβh-ALKWT und dβh koinjiziert beobachtet mCherry allein um 7 wpf, oder in einer der Geschwister, die nicht erben nicht die MYCN Transgen und wurden entweder mit dem ALKWT Gen oder injiziert die ALKF1174L Gens. Maßstabsbalken 100 & mgr; m B - F und 1 mm in G - K. Ein Nikon SMZ-1500 stereoskopischen Fluoreszenzmikroskop mit einer Digitalsicht DS-U1-Kamera und einem Leica MZ10F stereoskopischen Fluoreszenzmikroskop mit einem Leica DFC 345FX Digitalkamera ausgestattet wurden verwendet, um die Fluoreszenz images.The erfassen erfaßten Bilder verarbeitet und mit Adobe Photoshop kompiliert und Illustrator CS3 (Adobe) Software. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehendieser Zahl.

Figur 3
Abbildung 3: Einsetzen der Neuroblastom in MYCN transgene Fisch oder Wildtyp (WT) Fisch gemäß Mosaiken koinjiziert mit den DNA-Konstrukte. . Mit Genehmigung von Elsevier (Referenz 3466510609819) Nachdruck d & bgr; h - ALKF1174 L und dβh - mCherry (Mosaik ALKmut); dβh - ALKWT und dβh - mCherry (Mosaik ALKWT); oder dβh - mCherry (Mosaik mCherry) allein 8. Der Unterschied zwischen Tumor Beginn um 9 wpf im MYCN exprimierenden Fisch mit dβh koinjiziert - ALKF1174 L und dβh - mCherr y (MYCN; Mosaik ALKmut) und dass im Einklang mit MYCN dβh koinjiziert - ALKWT dβh - mCherry (MYCN; Mosaik ALKWT) oder dβh - mCherry allein (MYCN; Mosaik mCherry) ist p = 0,002 und p = 0,007 bzw. signifikante, durch zweiseitigen Fisher-Test.

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Discussion

In dieser repräsentativen Studie verwendeten wir transiente Co-Injektion und Co-Expression von aktivierten ALK mit dem mCherry Reportergens in MYCN exprimierenden transgene Fische, um zu zeigen, dass diese Gene zusammenarbeiten, um deutlich zu beschleunigen den Ausbruch von Neuroblastom, im Einklang mit unseren früheren Feststellung in Verbindung stabil transgene Fische Koexpression beide aktiviert ALK und MYCN 8. Dieses Mosaik transgenen Ansatz besitzt mehrere deutliche Vorteile gegenüber dem herkömmlichen Verfahren. Am wichtigsten ist, ermöglicht es eine schnelle Prüfung der Wirkungen der Koexpression Kandidaten Onkogenen in erster Linie injizierten Tieren (F0-Generation), ohne das Erfordernis für einen stabilen transgenen Tieren, wie durch die übermäßige Zeit und Arbeit in der Regel in der Züchtung und Identifizierung von ALK exprimierende stabile beteiligten transgene Fische. Wir untersuchten auch die Wirkung der Überexpression von Wildtyp-ALK, mit oder ohne MYCN überAusdruck auf Tumor Einweihung. Die Ergebnisse zeigen, dass transiente Überexpression von Wildtyp-ALK in unserem Fischmodell nicht ausreicht, um Neuroblastom Tumorgenese zu initiieren, unabhängig vom Status des Onkogens MYCN. Es wäre interessant, um in der Zukunft zu testen, ob transienten Koexpression beider aktiviert ALK und MYCN in Wildtyp-Fisch könnte früheren Beginn der Tumorentstehung in der vor allem Fisch injiziert induzieren. Diese Studie würde getreuer imitieren die tatsächliche Krankheit Kontext, in dem somatischen Veränderungen beider Gene kommen gemeinsam in einer Untergruppe von Hochrisiko Neuroblastompatienten 5.

Ein wichtiges Gestaltungselement des Mosaiks transiente transgene Strategie ist die Einbeziehung eines Reportergens für Co-Injektion mit beliebigen Kandidaten Onkogene von Interesse, die im Screening für Tiere mit erfolgreichen Integration von Transgenen unter den überwiegend injiziert Zebrafischembryonen und die positive Fisch für Überwachung hilft tumor Entstehung und Progression. Um die Effizienz der Transgenese erhöhen, haben wir die Meganuklease I-SceI-vermittelten transgenen Ansatz, der deutlich die einheitliche Promotor-abhängige Expression von Transgenen von 26% der injizierten Embryonen primär mit Meganuclease 38 erhöht, ohne Meganuclease bis 76% der injizierten Embryonen angewendet haben . Obwohl die Verwendung des I-SceI Meganuclease vermittelte transgenen Ansatz wurde die Effizienz der Transgenese merklich verbessert, bleibt der Anteil der injizierten Embryos positiv für die Transgene von deutlich unter 100%. So kann der Ausdruck eines koinjiziert Reportergens als Marker dienen, injizierten Embryonen mit erfolgreichen Integration der Kandidaten Transgene vor der Fisch für den Beginn der Tumoren weitere Überwachung zu identifizieren. Im Gegensatz dazu hat ein Tol2 Transposon-vermittelten transgenen Ansatz zu einem beliebten genetisches Werkzeug in Modellwirbeltiere und wurde erfolgreich für die Transgenese, Insertionsmutagenese, Genfallen verwendetping, und Enhancer-Trapping 40,41. Koinjektion von Tol2 Transposons mit Transposase mRNA in befruchtete Embryonen können frühzeitig Integrationsereignissen, die die Effizienz der chromosomalen Integration erhöht und potenziert erfolgreiche Keimbahntransmission des Transgens 42 erleichtern. Doch aufgrund der "Cut-and-Paste" Mechanismus der DNA-Umsetzung, eine einzige Kopie des Transgens in das Chromosom pro Einfügung locus 42 integriert. Somit koinjiziert Kandidatengenen wahrscheinlich einzeln in das Fischgenom an unterschiedlichen Stellen, die mit der Expression von Kandidatengenen in verschiedenen Zellen und einer komplizierteren transienten und Mosaikexpressionsmuster koinjiziert Gene im primär injiziert Fische führen könnten integriert.

Insgesamt ist die aktuelle Studie unterstützt die künftige Nutzung der Mosaiktransgenese als schnelles Mittel, um die Zusammenarbeit, vielleicht synergistische, Beziehungen zwischen mehreren Onkogenen in einem Hoch th bewertenroughput Weise eine Herausforderung, der nur schwer mit anderen Tiermodellen, einschließlich Nager entsprechen. Bisher wurde diese Strategie ebenfalls erfolgreich in transgenen Zebrafisch angewandt, um Gene zu den aktivierten RAS -induzierte Einleitung Rhabdomyosarkom 31 zu unterdrücken, und Ändern der Strahlungsempfindlichkeit des MYC-induzierten T-Zell-akute lymphatische Leukämie 31 identifizieren. Außerdem Langenau et al, 15 haben gezeigt, dass die Kombination der Koinjektion Ansatz mit einem Hitzeschock induzierbaren transgenen Ansatz kann die transgene Expression von Hitzeschock in der vor allem Fisch injiziert induzieren, die als sehr nützlich in der Erforschung der kooperativen Rollen von Onkogenen in Tumor würde Progression, wie es die Genexpression ermöglicht, nachdem der Primärtumor etabliert gedreht werden. Vor kurzem Langenau und Kollegen entwickelten die erste immunZebraFisch-Modell, indem sie auf Rag2 Gen mit technisch Zinkfinger-Nukleasen 43. Verlustder Funktion der Rag2 gestattet robust und dauerhaftes Anwachsen von mehreren Geweben und Krebszellen 43, einen Vorteil, die nützlich in Transplantation der heterogene Krebszellen, die Kandidaten Transgene überexprimieren und Bewertung der Auswirkungen von Mosaik Transgen-Expression auf Selbsterneuerungskapazität, therapeutisch sein könnte Antworten und die Wachstumsrate dieser Krebszellen.

Schließlich bietet Mosaik Transgenese eine weitere einzigartige Vorteil gegenüber stabilen Transgenese. In stabilen transgenen Tieren werden die Transgene in das Genom jeder einzelnen Zelle des Körpers integriert und vererbbar sind von Generation zu Generation 27. Allerdings ergeben sich viele Krebsarten von genetischen Veränderungen in Körperzellen statt vererbte Mutationen in Keimzellen 44. Somit ist die Mosaikmuster des Transgens Integration in den ersten injizierten Fische und die gemischten Genotypen in Zellpopulationen einzelner Mosaik transgene Fische besser zu rekapitulieren the somatischen Defekte bei Patienten gefunden und würde die künstlichen Positionseffekt durch eine einzige Einführungsstelle in einem stabilen transgenen Linie zu vermeiden. Andererseits macht die mosaicism und kleine Population von Zellen Überexpression der Transgene in der hauptsächlich eingespritzten Fisch mechanistische Studie erschwert.

Zusammenfassend stellt das Mosaik transgene Strategie ein robustes Werkzeug für die schnelle und effektive Bewertung des Genossenschaftsbeitrag von Onkogenen, um Tumorinitiation und zu verbreiten. Dieser Fortschritt wird erwartet, dass Samen Informationen über das Zusammenspiel zwischen den Kandidaten-Onkogene, die für eine weitere produktive Untersuchung von onkogenen Mechanismen und Signalwege und für die Entwicklung wirksamer gezielte Therapie dringend benötigt wird zu generieren. Steigerung der Effizienz der Kointegration von mehr als drei koinjiziert DNA-Konstrukte, würde die Gelegenheit zur Untersuchung der komplexen Beziehungen zwischen gleichzeitig ausgedrückt Multigen-Kombinationen in verschiedenen Arten von Dose zu öffnenziere. Herausforderungen für die Zukunft wird es sein, das Mosaik transgene Strategie, jede genomische oder epigenetische Veränderungen, die eine Rolle bei der neoplastischen Prozess der Verwendung von Mutationen, die nur Protein-Codierung zu ändern oder Gene spielen könnte, anstatt zu begrenzen zubringen ändern überexprimiert, gewonnen oder amplifiziert. In letzter Zeit haben sich verbessert Genom Bearbeitungstechniken wie Transkriptionsaktivator artigen Effektormolekülen Nukleasen (TALENS) 45 und geclusterte regelmäßig beabstandeten kurzen palindromischen Repeats (CRISPR) / CRISPR-assoziierten (Cas) Systeme 46, weit verbreitet zu werden, schneller genutzt und endogene effizient ändern Genen in verschiedenen Zelltypen und Organismen 46. Solche Techniken könnten wir gezielt durchführen, hocheffiziente Änderungen Genomsequenz und der Genexpression in der Zebrafisch-Modellsystem und den Mechanismus (n) die Rolle der genomischen oder epigenetische Veränderungen in Tumor Pathogenese zugrunde liegen, besser zu verstehen. Diese wiederum sind wahrscheinlich Sporn the Entwicklung neuer molekularer Therapeutika für eine Reihe von Krebserkrankungen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expand Long Template PCR System  Roche Applied Science, IN 11681834001
pCR-TOPO vector  Invitrogen, CA 451641
T4 DNA ligase New England Biolabs, MA M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme
Mix		 Invitrogen, CA 11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix Invitrogen, CA 11789-020
GC-RICH PCR System  Roche Applied Science, IN 12 140 306 001
Meganuclease I-SceI  New England Biolabs, MA R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope  Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera Nikon, NY

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Entwicklungsbiologie Zebrafisch Tiermodell Mosaik Transgenese Co-Injektion der funktionellen Genomik Tumor-Initiation
Mosaic Zebrafisch Transgenese für Funktionelle Genomanalyse Candidate Cooperative Gene in Tumor Pathogenese
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Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, … More

Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis. J. Vis. Exp. (97), e52567, doi:10.3791/52567 (2015).

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