Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Mosaic Zebrafish genmodifiering för Funktionell Genomic analys av kandidat Kooperativa gener i tumör Patogenes

Published: March 31, 2015 doi: 10.3791/52567
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 1,3
1Department of Molecular Pharmacology & Experimental Therapeutics, Mayo Clinic College of Medicine, Center for Individualized Medicine, 2Tufts University School of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic

Introduction

Cancer är progressiva sjukdomar präglas av ansamling av patologiska mutationer, deletioner och kromosomvinster över tid. Dessa genetiska avvikelser kan påverka flera cellulära processer som sträcker sig från cellcykeln, celldöd, energisk metabolism och montering av cytoskelettet betona svar såsom hypoxi. Därför speglar tumorigenes de gemensamma åtgärder av flera genetiska avvikelser över ett spektrum av biologiska processer. Senaste integrativa iska forskningsinsatser, inklusive hela genom sekvensering, Exoma sekvense, riktad sekvensering, djupa sekvensering och genomtäckande associationsstudier, har identifierat ett växande antal nya genetiska förändringar i stort sett samtliga typer av tumörer 1-4. I många fall, de genetiska skador förekommer tillsammans i ett icke slumpvis sätt 5-8, vilket tyder sitt samarbete i sjukdoms patogenes. Dissekera onkogena roller stort utbud av abnormt uttryckta gener resulte from dessa iska lesioner är nödvändig för att utarbeta nya behandlingsstrategier och förstå svaren från tumörceller till dessa medel, men det har visat sig vara en svår uppgift, som kräver mycket robusta djurmodellsystem för genomförandet av hög genomströmning funktionell genomisk analys vivo.

Även däggdjur, särskilt gnagare, är gynnade modeller i cancerbiologi, har zebrafisk börjat locka stor uppmärksamhet. Den teleost zebrafisk (Dario rerio) har använts som modellorganism för utvecklingsstudie sedan 1960-talet och var först appliceras på studier av tumör patogenes 1982 9-11. Enkelt underhåll, mindre kroppsstorlek, och hög fruktsamhet gör zebrafisk en robust modell för storskaliga framåt genetiska skärmar för att identifiera mutationer som ger onormala och patologiska fenotyper 10. Den optiska insyn i zebrafisk embryon är en annan viktig funktion som stöder en bredare användning av denna cancer modell, somdet tillåter in vivo imaging att genomföras för att lokalisera tumörutveckling i realtid 9, ett program som är relativt svårt i gnagare 12. Senaste komparativ genomik analys av zebrafisk referens genomet (Zv9) avslöjade 26.206 proteinkodande gener, med 71% som har mänskliga ortologer, varav 82% är korrelerade med sjukdomsassocierade gener i Online Mendels ärftlighetslagar i Man (OMIM) databas 13, 14. Följaktligen har zebrafisk använts för att modellera olika typer av humana cancerformer, inklusive neuroblastom 8, T-cells akut lymfatisk leukemi (T-ALL) 15,16, melanom 17,18, Ewings sarkom 19, rhabdomyosarkom 20,21, pankreaskarcinom 22, hepatocellulär cancer 23 och myeloida maligniteter 24,25, och har valts ut som en cancermodell för xenotransplantation studerar 11,26.

En stabil transgentillvägagångssätt i zebrafisk används ofta för att studera effekten av förstärkningen-of-funktionen hos gener i normal utveckling eller sjukdom patogenes 27,28. Att utveckla en sådan modell (Figur 1A), injicerar en en DNA-konstruktion som innehåller genen av intresse drivs av en vävnadsspecifik promotor i en-cell av vildtyp embryon. Tre till fyra månader efter injektionen, när de injicerade embryona blir könsmogna, de utparade med vildtyp fisk att screena för de som visar integration av DNA-konstruktionen i deras könsceller, som licensierar dem som grundare fisk. Många faktorer, såsom kopietalet och integrationsstället i transgenen, påverkar expression av transgenen i stabila transgena linjerna. Således, för att utveckla en transgen tumörmodell, multipla stabila transgena linjer som överuttrycker ett enskilt onkogen måste genereras först och screenas för den linje som uttrycker transgenen på en nivå som skulle kunna leda till tumörinduktion. Men om överuttryck av en kandidat oncogene är toxisk för bakterieceller, är det svårt att generera en stabil transgen linje genom att direkt överuttrycker transgen 29. Därför kan denna metod vara tidskrävande, med en hög risk för misslyckande för att generera en lämplig cancermodell.

Här visar vi en alternativ strategi baserad på mosaik gående genmodifiering (Figur 1B) som ger unika fördelar jämfört med traditionella stabil genmodifiering för funktionell genomisk studie in vivo. I detta tillvägagångssätt, är en eller flera transgenstrukturerna injiceras i en-cells stadiet av transgena eller vildtyp embryon. De injicerade DNA-konstruktioner som innehåller transgener är sedan mosaically och slumpmässigt integrerade i den primära injicerade fisk, vilket resulterar i blandade genotyper inom flera cellpopulationer i individuella fiskar 30. Dessutom saminjektion av multipel DNA-konstruktioner i embryon en cell leder till co-integration i samma cell vid slumpmässiga platser, tillåter en att trace cellerna med uttryck av transgener och utforska samspelet mellan olika gener under sjukdoms patogenes i mosaikdjur 31. Som bevis på princip, vi transient överuttryckt mutation aktiverade ALK (F1174L) med mCherry reportergen i det perifera sympatiska nervsystemet (PSNS) under kontroll av dopamin beta hydroxylas (d βh) promotor i vildtyp fisk och transgen fisk överuttrycker MYCN. ALK, som kodar en receptor tyrosinkinas, är den vanligaste muterade genen i högrisk neuroblastom 5-7,32,33. ALK (F1174L), som en av de mest frekventa och potenta somatiska aktiverande mutationer, är överrepresenterade i MYCN- förstärkta neuroblastompatienter högrisk och synergistiskt med MYCN uttryck att accelerera neuroblastom tumorigenes både stabila transgena möss och transgena zebrafisk modeller 8,34,35. Genom mosaikgående överuttryck av ALK (F1174L) med mCherry i MYCN transgen fisk, rekapituleras vi accelerationen av tumördebut observerats i stallet transgen fisk överuttrycker både ALK (F1174L) och MYCN, vilket tyder på att den mosaik genmodifiering strategin kan användas för att snabbt och effektivt bedöma de relativa bidragen från flera onkogener i tumör initiering in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOTERA: Alla zebrafisk studier och underhåll av djuren gjordes i överensstämmelse med Mayo Clinic Institute lACUC-godkända protokoll # A41213.

1. DNA-konstrukt för genmodifiering

  1. Förstärk ett 5,2-kb dopamin beta hydroxylas (d βh) promotorregionen 8 använder CH211-270H11 BAC-klon (från BacPac resurser centrum (BPRC)) som en DNA-mall. Använd ett PCR-system är lämpligt för lång och noggrann PCR-amplifiering av långa DNA-mallar och följande cykelprogram för PCR: 94 ° C under 2 min, 10 cykler av (94 ° C, 15 sek, 50 ° C, 30 sek, 68 ° C, 8 min), följt av 30 cykler av (94 ° C, 15 sek, 53 ° C, 30 sek, 68 ° C, 8 min), 68 ° C, 4 min (framåtriktad primer 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 ' och omvänd primer 5'- GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 ').
  2. Skapa d βh -pDONRP4-P1R posten clone 8 använder kommersiella rekombinant kloningssystem såsom multisite gateway. Blanda 1 l renat dβh PCR-produkt (172 ng / l), 1 pl (150 ng / l) pDONRP4-P1R donator vektor (tillsammans med andra gateway vektorer är generösa gåvor från Dr Chi-Bin Chien, Univ. Of Utah) , 4 pl TE-buffert (pH 8,0) med 2 | il av BP CLONASE enzymblandning, inkubera i 1 timme vid 25 ° C och sedan omvandla till One Shot Top10 kompetenta E. coli enligt tillverkarens protokoll.
  3. Generera d βh: EGFP-MYCN transgen konstruera 8 med hjälp av rekombinant kloningssystemet nämns i steg 1.2. Blanda 1 | il av varje entryklonen (150 ng / ^ il) innefattande ett 5,2-kb dβh promotorn (dβh -pDONR P4-P1R-konstruktion), EGFP saknar ett stoppkodon (PME-EGFP-konstruktion), och humant MYCN cDNA (en generös gåva från Dr. Hogarty på barnsjukhuset i Pennsylvania, MYCN-pDONRP2R-P3-konstruktion), 1 pl (150 ng / l) av den modifierade destinations vektorn innehållande I-SCEI igenkännings (en generös gåva från Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Tyskland), 4 pl TE-buffert ( pH 8,0) med 2 pl av LR Clonase enzymblandning, inkubera i 1 timme vid 25 ° C och sedan omvandla till kemiskt kompetenta E. coli såsom One shot topp 10 och följ tillverkarens protokoll.
  4. Gör MITF: MITF transgen konstruera 8 genom uppslutning av PNP-MITF vektorn med Notl och Sall-restriktionsenzymer för 2 h vid RT, och genom subkloning av utsläppt 2,65-kb (en generös gåva från Dr. D. Raible, Univ of Washington.) DNA-fragment som innehåller MITF promotorn och den kodande sekvensen för den zebrafisk MITF genen in i Notl och Mlul ställena i en modifierad pBluescript-vektor innehållande flankerande I-SCEI igenkänningsställen (en generös gåva från Dr. Hui Feng, Boston University), med användning av T4 DNA-ligas enligt tillverkarens protokoll.
    OBS: För att öka effektiviteten i att generera stabila MYCN uttryckande linjer, d βh: EGFP-MYCN och MITF:. MITF DNA-konstruktioner saminjiceras i en cell skede nacre embryon Nacre betecknar en typ av mutant fiskar som saknar en neurallisten-derived melanoforanalysbuffert under utveckling 36. Således föreslår utseendet på pigmentceller i de injicerade embryon integration av MITF: MITF DNA-konstruktioner i genomet. Det har visats att två eller tre saminjicerat DNA-konstruktioner kan kointegrerade i fiskens genomet 31. Således kan pigmente orsakas av MITF uttryck tjäna som en markör för integrationen av dβh: EGFP-MYCN transgen och för enklare identifiering av MYCN stabil transgen linje.
  5. Blanda d βh: EGFP-MYCN och MITF: MITF DNAkonstruktioner på en 3: 1-förhållande i en total volym av en 15 pl reaktion med ett pl av I-SCEI enzym och 0,75 pl av buffert. Se till att den totala mängden DNA i reaktionen inte överstiger 750 ng.
  6. Utför I-SCEI rötning vid RT under 4 h eller O / N. På den andra dagen, digere I-SceI- DNA är redo för mikroinjektion eller kan lagras vid -20 ° C för injektion i framtiden. Förvara I-SCEI enzym vid -80 ° C i små alikvoter för att bibehålla dess enzymeffektivitet.
  7. Subklona den mänskliga ALKF1174L och vildtyp ALK-genen från pCDNA3 vektorn (en generös gåva från Dr. George på Dana-Farber Cancer Institute) 7 i EcoRI- och Notl-ställen i en pENTRY1A vektor (en generös gåva från Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Tyskland) med hjälp av T4 DNA-ligas enligt tillverkarens protokoll.
  8. Generera d βh: ALKF1174L </ Em> eller dβh: ALKWT transgena konstruktioner med hjälp av rekombinant systemet som nämns i protokoll 1.2. I korthet kombinera tre inträdes kloner, dβh -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (eller ALKWT -pENTRY1A) och P3E-polyA, in i den modifierade destinations vektorn innehållande I-SCEI igenkännings (en generös gåva från Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Tyskland), med hjälp av LR Clonase enzym Mix, enligt tillverkarens protokoll.
  9. Blanda d βh: ALKF1174L (eller dβh: ALKWT) och dβh: mCherry DNA-konstruktioner på en 3: 1-förhållande och linearisera dem med I-SCEI enzym såsom beskrivits i PROTOKOLL 1,5-1,6.

2. Mikroinjektion

  1. Använd glasmikropipetter med 1,0 mm diameter för alla injektioner 37. Bryt av spetsen av glasmikropipetter med ett rakblad före injektion. Kalibrera injektionsvolymen med injiceraing H2O i en droppe av mineralolja. Mät diametern av de resulterande dropparna och justera mikroinjektor (tryck eller varaktighet tryckpuls) för att säkerställa att injektionsvolymen är mindre än 10% av den totala cellvolymen av en cellstegs embryon.
  2. Lägg ytterligare 0,5 pl färsk I-SCEI enzym (5 enhet / pl) i 5 pl injektionslösning innehållande DNA-konstruktioner precis innan injektion för att öka effektiviteten i genmodifiering 38. Injicera 50-80 pg av linjäriserade DNA-konstruktioner in i cytoplasman av en-cellstadiet embryon. För att säkerställa framgång för injektion, blanda provet med 0,25% fenolrött för visualisering. Om cellerna blir röda efter injektion, betyder det att mikroinjektion är framgångsrik. För att säkerställa ett bra resultat för att generera transgen fisk, injicera vi vanligtvis så många som 500 embryon.
  3. För att generera transgen fisk stabilt uttrycker MYCN, coinject det linjäriserade d βh: EGFP-MYCN och MITF: MITF DNA-konstruktioner (vid ett 3: 1 förhållande) i embryon av pigmente mutanten pärlemor zebrafisk vid en-cellstadiet. Uttrycket av MITF fungerar som en reporter för integreringen av transgena konstruktioner i fisk genomet.
  4. För mosaikuttryck av ALK i vildtyp eller MYCN transgena embryon, samar injicera linjäriserade d βh: ALK F1174L (eller dβh: ALKWT) med dβh: mCherry DNA-konstruktioner (vid en 3: 1 ratio) i en cell embryon till följd av avel av F1 heterozygot Tg (dβh: EGFP-MYCN) transgen fisk med vildtyp AB fisk. Således hälften avkommor är transgena för MCYN och hälften är vildtyp.

3. Skärm för Stabil eller Mosaic transgen fisk

  1. För att öka effektiviteten i identifieringen av stabila MYCN uttryckande linjer, söva främst injicerade nacre embryon med tricaine (0,02%) at dagar 3-5 av postfertilization och skärm för pigmente. Överför embryon med pigmente till en ny petriskål med färskt ägg vatten och höja dem till sexuell mognad för ytterligare screening för grundaren fisk, som bär d βh: EGFP-MYCN transgen i könscellerna.
  2. För att identifiera grundaren med könsceller överföring av EGFP-MYCN, utparning pigmenterad F0 vuxna fiskar med vildtyp AB fisk och skärm för EGFP-positiva embryon vid 1-2 dagar efter befruktning för ytterligare genotypning. Placera ett enda EGFP-positiva F1 embryo till ett PCR-rör och ta bort all vätska. Lägg 50 pl av gDNA extraktionsbuffert, som innehåller 12,5 | il 4x lysbuffert, 35 | il H2O och 2,5 ul proteinas K (10 mg / ml) till enda embryo. Inkubera reaktionen för 2-3 h vid 55 ° C, följt av 10 min av inkubation vid 98ºC att inaktivera proteinas K. För att göra 50 ml av 4x lysbuffert, tillsätt 500 | il av 1 M Tris (pH 8,4), 2,5 ml 1 M KCl to 47 ml H2O OBS: Efter F0 MYCN stabil transgen fisk föds med vildtyp AB fisk, alla avkomman är pigmenterade. Således pigmente kan inte fungera som markör för att identifiera MYCN- positiva fisk. Medan i MYCN transgen fisk, är EGFP-MYCN fusionsprotein som uttrycks i PSNS, inklusive sympatiska neuroner i det överlägsna cervikala ganglier och sekventiell segmentell ganglion av det sympatiska kedjan och de icke-PSNS dopaminerga neuroner, såsom förlängda märgen och skall ganglierna 8. Således kan uttrycket av EGFP tjäna som en markör för identifiering av MYCN stabila transgena embryon.
  3. Använd 2 ul av gDNA extraherade från den pigmente F1 embryot som templat, primrar MYCN -test F1: 5'-CTG CTT GAG AAC GAG CTG TG-3 '; MYCN -R3: 5'-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 ', och följande program with den GC-rika PCR-systemet: 1 cykel av 95 ° C under 3 min, 25 cykler av 95 ° C under 30 sek, 58 ° C under 30 sekunder, och 72 ° C under 3 min. Vi genotyp vanligtvis 14-16 pigmente embryon från en enda parning för att bekräfta förekomsten av integrerade MYCN transgen i pigmente embryon, mer än 6 grundare fisk överuttrycker MITF och MYCN identifierades genom denna metod.
  4. Höj upp resten av EGFP-positiva F1 embryon. Fin klipp och genotyp dem vid 2-3 månaders ålder med hjälp av ovanstående protokoll för att ytterligare bekräfta att integrera MYCN transgen i fisken. Ras F1 MYCN stabil transgen fisk med vildtyp AB fisk. Co-injicera linearise d βh: ALK F1174L (eller dβh: ALKWT) med dβh: mCherry DNA-konstruktioner i embryona en cell som beskrivs i PROTOKOLL 2.4.
  5. Sortera på MYCN uttryckande embryon i experimentet som beskrivs i PROTOKOLL 2.4 med hjälp av en stereoskopisk fluorescence mikroskop och gallra främst injicerade embryon på dag 1-3 av postfertilization för uttrycket av EGFP-MYCN i PSNS. Sedan, under dagarna 2-5 av postfertilization, söva embryona med tricaine (0,02%) och sortera dessa MYCN- positiva eller negativa embryon återigen baserat på expressionen av mCherry i PSNS använder ett stereoskopiskt fluorescensmikroskop. Uttrycket av mCherry fungerar som en markör för samuttryck av ALK i vävnader hos mosaik primära injicerade djur.
    OBS: ~ 600 avkomma resulterande från uppfödning av MYCN stabil transgen fisk med vildtyp fisk injicerades per grupp med den linjäriserade DNA-konstruktioner, inklusive d βh: ALK F1174L och dβh: mCherry, dβh: ALKWT och dβh: mCherry eller dβh : mCherry ensam, respektive. Mosaik uttryck av mCherry kan observeras i 70-90% av den primärt injicerade fisk. En halv till en-tredjedel av den injicerade fisk överlevde genom larverna scenen för tumör klocka.
  6. Höj alla mCherry + MYCN + och mCherry + MYCN - embryon enligt standardprotokoll från zebrafisk bok 39 och övervaka tumördebut som börjar på 5 veckor postfertilization.

4. Tumör Watch i Mosaic transgen fisk

  1. Övervaka mCherry- positivt främst injiceras fisk var 2 veckor börjar på 5 veckor postfertilization för tecken på tumördebut.
  2. Bedöva fisk med tricaine (0,02%) och skärmen för närvaron av mCherry - och EGFP uttryckande tumörer i PSNS enligt Nikon SMZ-1500 stereoskopisk fluorescensmikroskop utrustad med en digital sikte DS-U1 kamera.
  3. För att bekräfta om tumörerna uttrycker ALK transgen, isolera mCherry- och EGFP-positiva massorna för ALK genotypning PCR.
  4. Använda PCR, förstärka iskt DNAutvinns från utvecklade tumörer med följande primers: ALK P7: 5'-AGG CCA GGT GTC CGG AAT GC-3 "och ALK M18: 5'-TGT CTT CAG GCT GAT GTT GC-3" och följande PCR-reaktionen: 1 cykel av 94 ° C under 5 min, 30 cykler av (94 ° C under 30 sekunder, 55 ° C under 30 sekunder, och 72 ° C under 60 sek). Sedan, sekvens PCR-produkten med ALK P7 primer för att ytterligare bekräfta förekomsten av mutant eller vildtyp ALK i mCherry-positiva tumörer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att undersöka huruvida överuttryck av mutationellt aktiverad ALK F1174L eller vildtyp ALK kunde samarbeta med MYCN vid neuroblastom induktion, överuttryckt vi antingen aktiverad human ALK eller vildtyp human ALK under kontroll av d βh promotorn i PSNS av transgen fisk uttrycker MYCN. Endera av följande konstruktioner, dβh - ALKF1174L eller dβh - ALKWT, ades saminjicerades med dβh - mCherry till en-cells vildtyp eller MYCN transgena embryon (figur 2A) 8. Uttrycket av mCherry fungerat som en markör för samuttryck av ALK i vävnader hos mosaik primära injicerade djur. Samtliga av de förväntade genotyper var representerade i den injicerade fisk: (1) MYCN uttryckande fisk med mosaik koexpression aktiverat ALKF1174L och mCherry MYCN uttryckande fisk med mosaik samuttryck av vildtyp ALK och mCherry, utsedd MYCN, mosaik ALKWT; (3) MYCN uttryckande fisk med mosaik uttryck av mCherry, utsedd MYCN, mosaik mCherry; (4) vildtyp fisk med mosaik koexpression aktiverat ALKF1174L och mCherry, betecknad WT, mosaik ALKmut; och (5) vildtyp fisk med mosaik samuttryck av vildtyp ALK och mCherry, betecknad WT; mosaik ALKWT. En tumör klocka utfördes sedan var 2 veckor från 5 veckors postfertilization (WPF) på totalt 492 injicerade djur.

Åtta GFP + / mCherry + tumörer uppstod i interrenal körteln, den mänskliga binjuren motsvarande, med 9 WPF i MYCN uttryckande fisken saminjiceras med d βh - ALKF1174 L och dβh - mCherry (Siffrorna 2B och 3). Dessa tumörer var histologiskt, immunohistokemiskt och ultrastrukturellt jämförbar med människans neuroblastom (uppgifterna finns i referens 8). Däremot sågs inga tumörer observerades av nio veckors ålder i MYCN uttryckande fisken saminjicerades med dβh - ALKWT och dβh - mCherry (Siffrorna 2C och 3, p = 0,002) eller injiceras med dβh - mCherry ensam (figur 2D och 3, p = 0,007). Tumörer uppstod i både MYCN, mosaik ALKWT och MYCN, mosaik mCherry fisk med samma induktionsgrad efter 12 veckors ålder. Dessutom har neuroblastom detekterades inte i något vildtyp fisk saminjiceras med antingen vildtyp ALK och mCherry eller ALKF1174L och mCherry transgener under 15 veckors uppföljning. Sammantaget visar dessa resultat visar att mosaik uttryck av mutation aktiverade ALK accelererar MYCN inducerad tumör onbör, oberoende av integrationsstället i individuella mosaikdjur och att överuttryck av vildtyp ALK på de nivåer som drivs av dβh promotorn inte förefaller att samarbeta med MYCN överuttryck att inducera neuroblastom i detta modellsystem.

Figur 1
Figur 1: Schematisk skiss över konventionella stabilt och mosaik gående zebrafisk transgena strategier i studien av de kooperativa Bidrag från kandidat Onkogener till tumorigenes (A) Stabil transgen strategi.. Linjäriserad transgen DNA-konstruktion innehållande kandidat onkogenen injiceras i en-cellstadiet vildtyp eller nacre mutanta zebrafiskembryon där transgenen kan integreras i fiskgenomet slumpvis genomisk lokus. Integrering av transgen i könscellerna krävs för genen av stabil transgen linje. Främst injicerade embryon tar 3 till 4 månader för att bli könsmogna (F0 generationen av fisk), som kommer att utparade med vildtyp eller pärlemor mutant fisk till skärmen för grundaren fisken med transgen könsceller överföringen. Den resulte avkomma grundaren fisk, kallas F1-generationen, bär heterozygota alleler av transgen i sitt genom. För att bedöma de samverkande effekterna av två kandidat onkogener, såsom gen "a" och gen "b", i tumorigenes, uppfödd vi F1 avkomman av två stabila transgena linjer som överuttrycker dessa transgener, med endast en fjärdedel av avkomman bär sammansatta transgener. På grund av den relativt låga effektivitet generera stabila transgena linjer, är detta tillvägagångssätt inte genomförbart för hög genomströmning funktionella iska analyser. (B) Mosaik gående transgen strategi. I likhet med stabila genmodifiering, arise transgen DNA co nstructs innehållande kandidatgener kan injiceras i en-cellstadiet vildtyp embryon. Eftersom transgenen inte behöver integreras i genomet hos könsceller, kan mycket tid och ansträngning att sparas i processen att identifiera grundare fisk. Alternativt, om den transgena fiskar linjen överuttrycker en av kandidat onkogener finns (i vårt fall var MYCN transgen fisk utvecklas), linjäriserade transgena DNA-konstruktioner som innehåller andra kandidatgener kan injiceras i en cell skede transgena embryon för att studera deras samarbete tumorigenes. Upp till tre transgenstrukturerna kan saminjicerades och samuttrycks i första hand injicerade fisk 31; alltså, kan interaktionen mellan kandidat onkogener i tumorigenes bedömas i första hand injicerade fisk. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

"Src =" / filer / ftp_upload / 52.567 / 52567fig2.jpg "/>
Figur 2: Mosaik Uttryck av Aktiverad ALK Accelererar Onset av MYCN inducerad Neuroblastom 8 Modifierad figur med tillstånd från Elsevier (referens 3466510609819).. (A) Närma sig för att konstruera mosaik genmodifiering. (BF) 2 dagar gamla larver av främst injiceras embryon. Sidoutsikt över stabila EGFP uttryck i dopaminerga neuroner, inklusive kraniell ganglier (CG, pilspetsar) i fusionerade fluorescens-bright bilder (övre paneler). Sidoutsikt över mosaik mCherry uttryck (lägre paneler) i hjärn ganglierna (CG, pilspetsar), förlängda märgen (MO, pilar). Några ektopisk mCherry uttryck observeras i den icke-PSNS och icke-dopaminerga neuroner. (G - K) 7 veckor gamla främst injicerade fisk.(B, G) MYCN uttryckande fisk saminjiceras med d βh - ALKF1174L och dβh - mCherry konstruerar (MYCN; mosaik ALKmut). EGFP - och mCherry-positiva tumörer uppstod vid 7 veckor (vita tomma pilar i G). (C, H) ​​MYCN uttryckande fisk saminjicerades med dβh - ALKWT och dβh - mCherry konstruerar (MYCN; mosaik ALKWT). (D, I) MYCN uttryckande fisk injicerad med dβh - mCherry konstruera ensam (MYCN; mosaik mCherry). (E, J) Wild-typ (WT) fisk saminjicerades med dβh - ALKF1174L och dβh - mCherry konstruerar (WT; mosaik ALKmut). (F, K) Wild-typ (WT) fisk saminjicerades med dβh - ALKWT och dβh - mCherry konstruktioner (WT; mosaik ALKWT). Neuroblastom observerades inte i MYCN uttryckande fisken saminjicerades med dβh-ALKWT och dβh - mCherry eller dβh - mCherry ensam vid 7 WPF, eller i någon av syskonen som inte ärva MYCN transgen och injicerades med antingen ALKWT genen eller den ALKF1174L genen. Skala barer, 100 nm i B - F och 1 mm i G - K. En Nikon SMZ-1500 stereoskopisk fluorescensmikroskop utrustad med en digital sikte DS-U1 kamera och en Leica MZ10F stereoskopisk fluorescensmikroskop utrustat med en Leica DFC 345FX digitalkamera användes för att fånga fluorescerande images.The förvärvade bilder bearbetades och sammanställs med Adobe Photoshop och Illustrator CS3 (Adobe) mjukvara. Klicka här för att se en större versionav denna siffra.

Figur 3
Figur 3: Uppkomsten av Neuroblastom i MYCN transgen fisk eller vildtyp (WT) Fisk som Mosaik saminjiceras med DNA-konstruktioner. Återges med tillstånd från Elsevier (referens 3466510609819) d βh - ALKF1174 L och dβh - mCherry (mosaik ALKmut);. Dβh - ALKWT och dβh - mCherry (mosaik ALKWT); eller dβh - mCherry (mosaik mCherry) enbart 8. Skillnaden mellan tumördebut med 9 WPF i MYCN uttryckande fisken saminjicerades med dβh - ALKF1174 L och dβh - mCherr y (MYCN; mosaik ALKmut) och att i MYCN linje saminjicerades med dβh - ALKWT dβh - mCherry (MYCN; mosaik ALKWT) eller dβh - mCherry ensam (MYCN; mosaik mCherry) är signifikant vid p = 0,002 och p = 0,007 respektive med två-tailed Fishers exakta test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denna representativa studien använde vi gående saminjektion och samuttryck av aktiverade ALK med mCherry reportergen i MYCN uttryckande transgen fisk att visa att dessa gener samverkar för att markant påskynda uppkomsten av neuroblastom, i linje med vår tidigare fynd i förening stabil transgen fisk samuttrycker både aktiverad ALK och MYCN 8. Denna mosaik transgen tillvägagångssätt besitter flera distinkta fördelar jämfört med den konventionella metoden. Viktigast, gör det snabb granskning av effekterna av samuttrycker kandidat onkogener i första hand injicerade djur (F0 generationen) utan krav på stabila transgena djur, såsom att eliminera överdriven tid och arbete vanligtvis involverad i avel och identifiering av ALK uttryckande stabilt transgen fisk. Vi har även granskat effekten av överuttryck av vildtyp ALK, med eller utan MYCN överuttryck, på tumör initiering. Resultaten visar att gående överuttryck av vildtyp ALK i vår fisk modellen är inte tillräckligt för att initiera neuroblastom tumorigenes, oavsett status för MYCN onkogen. Det skulle vara intressant att testa i framtiden om gående samuttryck av både aktiverade ALK och MYCN i vildtyp fisken kunde framkalla börjar tidigare tumorigenes i första hand injicerade fisk. Denna studie skulle mer troget efterlikna den verkliga sjukdomen sammanhang i vilket somatiska förändringar av båda generna samar uppstå i en delmängd av högriskpatienter neuroblastom 5.

Ett viktigt designelement av mosaiken gående transgena strategi är införandet av en reporter gen för saminjektion med alla kandidat onkogener av intresse, vilket underlättar screening för djur med en framgångsrik integration av transgener bland främst injiceras zebrafisk embryon och övervaka positiva fisk för Tumor uppkomsten och utvecklingen. För att öka effektiviteten i genmodifiering har vi tillämpat I-SCEI meganuclease-medierad transgena tillvägagångssätt, vilket ökar den enhetliga promotor beroende uttryck av transgener från 26% av de i första hand injicerade embryon utan meganuclease till 76% av injicerade embryon med meganuclease 38 . Även användning av I-SCEI meganuclease-medierad transgena tillvägagångssätt har effektiviserat genmodifiering anmärkningsvärt är den andel av injicerade embryon positivt för transgener fortfarande långt under 100%. Således kan uttrycket av en saminjiceras reportergen fungera som en markör för att identifiera injicerade embryon med framgångsrik integration av kandidattransgener innan ytterligare övervaka fisk för uppkomsten av tumörer. Däremot har en Tol2 transposon-medierad transgena tillvägagångssätt blivit ett populärt genetisk verktyg i modell ryggradsdjur och har med framgång använts för genmodifiering, insertionsmutationer, genfällaping, och förstärkare fånga 40,41. Saminjektion av Tol2 transposoner med transposasaktivitet mRNA till befruktade embryon kan underlätta händelser tidiga integration som ökar effektiviteten av kromosom integration och förstärker framgångsrik nedärvda överföring av transgen 42. Men på grund av den "klippa och klistra" mekanismen för DNA-införlivande, en enda kopia av transgen är integrerad i kromosomen per insättningslokuset 42. Således saminjiceras kandidatgener troligen integreras individuellt i fisken genomet på olika platser, vilket skulle kunna leda till att uttrycket av gener i olika celler och en mer komplicerad gående och mosaikuttrycksmönster saminjiceras gener i första hand injicerade fisk.

Sammantaget stöder den aktuella studien den framtida användningen av mosaik genmodifiering som ett snabbt medel för att utvärdera samarbets, kanske synergistisk, relationer mellan flera onkogener i en hög throughput sätt, en utmaning som är svår att träffa andra djurmodeller, inklusive gnagare. Hittills denna strategi har också framgångsrikt tillämpats i transgen zebrafisk att identifiera gener som hämmar aktiverade RAS inducerad initiering av rabdomyosarkom 31 och modifierar strålningskänslighet MYC-inducerad T-cells akut lymfatisk leukemi 31. Dessutom Langenau et al, 15 har visat att kombinera saminjektion strategi med en värmechock-inducerbart transgena tillvägagångssätt kan inducera transgenuttryck genom värmechock i första hand injicerade fisk, vilket skulle vara mycket användbart i att utforska de kooperativa roller onkogener i tumörer progression, eftersom den tillåter genuttryck som ska slås på efter primärtumören är etablerad. Helt nyligen Langenau och kollegor utvecklade den första nedsatt immunförsvar zebrafisk modellen genom att rikta rag2 gen med engineered zinkfinger nukleaser 43. Förlustav funktion rag2 tillåten robust och långsiktig inympning av flera vävnader och cancerceller 43, en fördel som skulle kunna vara användbara i transplantera de heterogena cancerceller som överuttrycker kandidattransgener och bedöma effekten av mosaik transgenuttryck på självförnyelse kapacitet, terapeutisk svar och tillväxten av dessa cancerceller.

Slutligen erbjuder mosaik genmodifiering annan unik fördel jämfört stabil genmodifiering. I stabila transgena djur, är transgener integrerade i genomet hos varje enskild cell i kroppen och är ärftlig från generation till generation 27. Men många cancerformer uppstår genetiska förändringar i kroppsceller i stället för nedärvda mutationer i könsceller 44. Således mosaikmönster av transgen integrering i den primära injicerade fisk och de blandade genotyper inom cellpopulationer enskilda mosaik transgena fiskar skulle bättre rekapitulera the somatiska defekter hos patienter och skulle undvika den artificiella positions effekt som orsakas av en enda insättningsställe i en stabil transgen linje. Å andra sidan gör mekanistisk studie svårare mosaicism och liten population av celler som överuttrycker transgenerna i huvudsakligen injicerade fisk.

Sammanfattningsvis ger mosaiken transgen strategin ett kraftfullt verktyg för snabb och effektiv bedömning av den kooperativa bidrag onkogener till tumör initiering och spridning. Detta förskott beräknas generera sädes- information om samspelet mellan kandidat onkogener, och absolut nödvändigt för ytterligare produktiva utredning av onkogena mekanismer och spridningsvägar och för att utveckla en effektiv riktad terapi. Att öka effektiviteten i kointegration på mer än tre saminjiceras DNA-konstruktioner skulle öppna möjligheten för granskning av de komplexa relationerna mellan samtidigt uttryckta multigen kombinationer i olika typer av burkcenter. Utmaningar för framtiden blir att modifiera mosaik transgena strategi för att rymma alla iska eller epigenetisk förändring som skulle kunna spela en roll i den neoplastiska processen, snarare än att begränsa dess användning till mutationer som förändrar bara protein-kodning eller gener överuttryckt, fick eller amplifieras. Nyligen har förbättrat genomredigeringstekniker, såsom transkriptions aktivator liknande effektor nukleaser (Talens) 45 och klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (CRISPR) / CRISPR associerade (Cas) system 46, blir ofta för att snabbare och effektivare modifiera endogena gener i olika typer av celler och organismer 46. Sådana tekniker skulle tillåta oss att utföra riktade, högeffektiva modifieringar av arvsmassa och genuttryck i zebrafisk modellsystem och för att bättre förstå mekanismen (s) som ligger till grund roll iska eller epigenetiska förändringar i tumör patogenes. Dessa, i sin tur, kommer sannolikt att sporra the utveckling av nya molekylära terapeutika för en rad olika cancerformer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expand Long Template PCR System  Roche Applied Science, IN 11681834001
pCR-TOPO vector  Invitrogen, CA 451641
T4 DNA ligase New England Biolabs, MA M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme
Mix		 Invitrogen, CA 11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix Invitrogen, CA 11789-020
GC-RICH PCR System  Roche Applied Science, IN 12 140 306 001
Meganuclease I-SceI  New England Biolabs, MA R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope  Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera Nikon, NY

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10 (6), 353-358 (2009).
  2. Maher, B. Exome sequencing takes centre stage in cancer profiling. Nature. 459 (7244), 146-147 (2009).
  3. Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat Rev Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
  4. Chung, C. C., Chanock, S. J. Current status of genome-wide association studies in cancer. Hum Genet. 130 (1), 59-78 (2011).
  5. Mosse, Y. P., et al. Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene. Nature. 455 (7215), 930-935 (2008).
  6. Janoueix-Lerosey, I., et al. Somatic and germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 967-970 (2008).
  7. George, R. E., et al. Activating mutations in ALK provide a therapeutic target in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 975-978 (2008).
  8. Zhu, S., et al. Activated ALK Collaborates with MYCN in Neuroblastoma Pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
  9. White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
  10. Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
  11. Konantz, M., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).
  12. Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
  13. Kettleborough, R. N., et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).
  14. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  15. Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
  16. Feng, H., et al. T-lymphoblastic lymphoma cells express high levels of BCL2, S1P1, and ICAM1, leading to a blockade of tumor cell intravasation. Cancer Cell. 18 (4), 353-366 (2010).
  17. Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current biology : CB. 15 (3), 249-254 (2005).
  18. Santoriello, C., Anelli, V., Alghisi, E., Mione, M. Highly penetrant melanoma in a zebrafish model is independent of ErbB3b signaling. Pigment Cell Melanoma Res. 25 (2), 287-289 (2012).
  19. Leacock, S. W., et al. A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis. Dis Model Mech. 5 (1), 95-106 (2012).
  20. Le, X., et al. Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).
  21. Langenau, D. M., et al. Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma. Genes & development. 21 (11), 1382-1395 (2007).
  22. Park, S. W., et al. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
  23. Zheng, W., et al. Xmrk, kras and myc transgenic zebrafish liver cancer models share molecular signatures with subsets of human hepatocellular carcinoma. PLoS One. 9 (3), e91179 (2014).
  24. Forrester, A. M., et al. NUP98-HOXA9-transgenic zebrafish develop a myeloproliferative neoplasm and provide new insight into mechanisms of myeloid leukaemogenesis. British journal of haematology. 155 (2), 167-181 (2011).
  25. Alghisi, E., et al. Targeting oncogene expression to endothelial cells induces proliferation of the myelo-erythroid lineage by repressing the Notch pathway. Leukemia. 27 (11), 2229-2241 (2013).
  26. Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Dis Model Mech. 7 (7), 745-754 (2014).
  27. Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nat Rev Genet. 2 (12), 956-966 (2001).
  28. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  29. Igoucheva, O., Alexeev, V., Yoon, K. Differential cellular responses to exogenous DNA in mammalian cells and its effect on oligonucleotide-directed gene modification. Gene Ther. 13 (3), 266-275 (2006).
  30. Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).
  31. Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
  32. Chen, Y., et al. Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 971-974 (2008).
  33. Pugh, T. J., et al. The genetic landscape of high-risk neuroblastoma. Nature genetics. , (2013).
  34. Berry, T., et al. The ALK(F1174L) mutation potentiates the oncogenic activity of MYCN in neuroblastoma. Cancer Cell. 22 (1), 117-130 (2012).
  35. Heukamp, L. C., et al. Targeted expression of mutated ALK induces neuroblastoma in transgenic mice. Sci Transl Med. 4 (141), 141ra191 (2012).
  36. Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126 (17), 3757-3767 (1999).
  37. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  38. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  39. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  40. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (50), 19827-19832 (2008).
  41. Caneparo, L., Pantazis, P., Dempsey, W., Fraser, S. E. Intercellular bridges in vertebrate gastrulation. PLoS One. 6 (5), e20230 (2011).
  42. Ivics, Z., Izsvak, Z. The expanding universe of transposon technologies for gene and cell engineering. Mob DNA. 1 (1), 25 (2010).
  43. Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
  44. Watson, I. R., Takahashi, K., Futreal, P. A., Chin, L. Emerging patterns of somatic mutations in cancer. Nat Rev Genet. 14 (10), 703-718 (2013).
  45. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
  46. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).

Tags

Utvecklingsbiologi zebrafisk djurmodell mosaik genmodifiering saminjektion funktionell genomik tumör initiering
Mosaic Zebrafish genmodifiering för Funktionell Genomic analys av kandidat Kooperativa gener i tumör Patogenes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, … More

Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis. J. Vis. Exp. (97), e52567, doi:10.3791/52567 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter