Abstract
Både transkriptionel og post-transkriptionel regulering har en dybtgående indvirkning på gener udtryk. Men almindeligt vedtagne cellebaserede screeningassays fokus på transkriptionel regulering, der hovedsagelig tager sigte på at identificere promoter-targeting molekyler. Som et resultat, er post-transkriptionelle mekanismer vid udstrækning udækket af genekspression udvikling målrettet lægemiddel. Her beskriver vi en celle-baseret assay der tager sigte på at undersøge betydningen af den 3 'utranslaterede region (3'UTR) i moduleringen af den skæbne dets mRNA og ved identifikation af forbindelser i stand til at ændre den. Assayet er baseret på anvendelsen af et luciferase reporter konstrukt indeholdende 3'UTR af et gen af interesse er stabilt integreret i en sygdom-relevant cellelinie. Protokollen er opdelt i to dele, med det oprindelige fokus på den primære screening rettet mod at identificere molekyler, der påvirker luciferaseaktivitet efter 24 timers behandling. Den anden del af protokollenbeskriver counter-screening nødvendigt at skelne forbindelser modulerende luciferaseaktivitet specifikt gennem 3'UTR. Ud over den detaljerede protokol og repræsentative resultater, vi leverer vigtige overvejelser om analysen udvikling og validering af hittet (r) på den endogene målet. Den beskrevne cellebaserede reportergen assay vil give forskerne at identificere molekyler, der modulerer proteinniveauer via post-transkriptionelle mekanismer er afhængige af en 3 'UTR.
Introduction
I en lang periode transkriptionel regulering af genekspression blev anset for at spille en vigtig, hvis ikke udelukkende rolle i kontrollen proteinproduktion. Akkumulerende beviser, viser imidlertid, at posttranskriptionel regulering bidrager så meget som, hvis ikke mere end, transkriptionsregulering at bestemme cellulær protein overflod 1,2. Post-transkriptionel kontrol af genekspression er meget mere kompleks og omfattende, end det var ved første tanke. Faktisk har alle de forskellige stadier af post-transkriptionel kontrol opstået for at blive reguleret, herunder mRNA behandling, lokalisering, omsætning, oversættelse 3 samt den nyligt beskrevne reversible RNA methylering 4. Fra en række post-transkriptionel regulering processer potentielt berørte beskrevet assayet nedenfor fokuserer på dem, der involverer mRNA 3 'utranslaterede region (3'UTR). 3'UTR bredt påvirker mRNA skæbne hovedsageligt via specifik interaktion af RNA-bindende proteins og ikke-kodende RNA sine regulatoriske sekvenser og / eller sekundære strukturer 5. Derfor vil små molekyler der ændrer disse vekselvirkninger eller interfererer med opstrøms signaltransduktionsveje ændre balancen, der regulerer protein overflod. Denne terapeutiske tilgang er af særlig betydning for menneskelige sygdomme, som vides viser, at sygdomsrelaterede relevante gener underkastes posttransskriptionel regulering, som således udgør et potentielt mål for farmakologisk intervention. Derfor kan der muliggør screening af mRNA-niveauer 'modulatorer gennem indgreb i posttranskriptionel kontrolmekanismer i en high-throughput format blive værdifulde redskaber i identifikation af potentielle nye behandlinger.
Den beskrevne cellebaserede reportergen assay muliggør identifikation af forbindelser, der kan modulere mRNA skæbne via mekanismer afhængig af 3'UTR. Den består af flere hovedstol components (figur 1) og kræver få indledende skridt til at validere gennemførligheden af analysen. Først og fremmest er det reporter konstrukt designet til at omfatte 3'-UTR fra et gen af interesse. 3'UTR er fusioneret til enden af et reportergen, såsom ildflue-luciferase (figur 1). Eventuelle ændringer i post-transkriptionelle kontrolmekanismer udøves gennem den indsatte 3'UTR vil ændre stabiliteten og / eller translation effektiviteten af dette kimære transskript, hvilket resulterer i forskellige luciferase niveauer. Derfor ændringer i luciferaseaktivitet tjener som indirekte mål for påvirkede post-transkriptionel regulering af genet af interesse. Den anden komponent i systemet er en kontrol reporter konstrukt, en identisk ekspressionsplasmid, der udtrykker den samme reportergen, men indeholder ikke nogen 3'UTR. De to reporterplasmider kan udformes i laboratoriet under anvendelse af konventionelle molekylærbiologiske protokoller eller købt fra kommercielle kilder.
Udvælgelsen af en passende cellelinie er kritisk for assay konstruktion. Hvilken cellelinie er den optimale model afhænger af mange faktorer, der spænder fra de kliniske krav som maksimal lighed med patologi til blot praktiske spørgsmål som tilgængelighed, transficerbarhed og vækst karakteristika. Vigtigt er det, før at fortsætte en bør sørge for, at fusion af 3'UTR til reportergenet har en forventet effekt på størrelsen af det kimære udskrift. Fraværet af signifikant forskel i luciferase signal fra 3'UTR-bærende og kontrol reporterkonstruktioner kortvarigt transficeret i de markerede celler tyder på, at 3'UTR er ikke funktionel i denne cellulære model, hvilket fik til søgning af alternative dem. For high-throughput format, bør 3'UTR-bærende og kontrol luciferasereporter konstruktioner integreres stabilt i den valgte cellelinje. Ved hjælp af en stabilt integreret over transient transficeretcellelinje er at foretrække af flere årsager. Dette vil udvide valget af en cellulær model herunder svære at transfektere cellelinjer, mindske variabiliteten i de data, der følger af udsving i transfektionseffektivitet, stilne omkostningerne. Endvidere er der ved forbigående transfektion celler er meget ofte overbelastet med et DNA-plasmid fører til mætning af systemet. I disse indstillinger en yderligere stigning i reporter udtryk kan være udfordrende, hvilket resulterer i nedsat følsomhed over for potentielle opregulering forbindelser.
Endelig, når alle assaykomponenterne er sat op, er det afgørende før flytning til high-throughput format for at bestemme gennemførligheden af assayet, dvs hvis luciferaseaktivitet faktisk kan op- og ned-reguleres specifikt via indsat 3 ' UTR. De bedste kontrol vil være små molekyler rapporteret at modulere stabilitet eller oversættelighed af mRNA gennem 3'UTR af interesse. Hvis der disse erikke er muligt, er surrogat kontrol efterligne den ønskede effekt accepteret. Det kan være miRNA eller RNA-bindende proteiner, der vides at udøve deres virkninger via binding til 3'-UTR af interesse. Evaluering af sådanne kontroller før det primære screening indikerer ikke kun funktionaliteten af den udviklede assay, men giver også mulighed for estimering af sin dynamikområde, følsomhed og ydeevne i høj kapacitet format.
Ved hjælp af beskrevne protokol screenede vi et 2.000 forbindelse bibliotek 6. Neuroblastom, den mest almindelige ekstrakranialt fast tumor hos børn, blev anvendt som en biologisk model og 3'UTR af MitCN onkogenet, hvis amplifikation stærkt forudsiger negative resultat af neuroblastom, som et målgen 7. Figur 2 skitserer den eksperimentelle layout. Screeningen blev delt i tre kørsler med batchstørrelsen af 27 plader screenet i én køre. Portionen af 27 plader inkluderet Spectrum Collection bibliotekplader N.1-N.8 + N.25 (første kørsel), n.9-n.16 + N.25 (anden kørsel) og n.16-n.24 + N.25 (tredje løb), hver plade screenet i tre eksemplarer. Således blev et bibliotek plade (N.25) analyseres inden for alle tre kørsler, der muliggør indbyrdes run sammenligning. Protokollen nedenfor beskriver en enkelt kørsel af 9 Library plader testet tredobbelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: gennemløb af sådanne analysesystemer afhænger af den tilgængelige HTS laboratorieudstyr. Denne protokol lettes af et Tecan Freedom EVO 200 robot, som udfører væskehåndtering i 96-brønds format. Miniaturisering 384-brønds format er også mulig. Den robot væskehåndteringssystem er placeret under en laminar strømningshætte for at opretholde aseptiske forhold under alle eksperimentelle trin. Hvis ingen væske håndtering automatisering er til rådighed, kan protokollen let tilpasses til lav-throughput format.
Primær Screening
1. Dag 1: Forberede og Seed Cells
BEMÆRK: Seed celler til opnåelse af 80% konfluens på tidspunktet for analyse luciferaseaktivitet, dvs 48 timer efter podning.
- Resuspender trypsiniseret CHP134-mycn3UTR neuroblastomceller til en koncentration på 2 x 10 5 celler / ml i RPMI indeholdende 10% FBS og 1% L-glutamin. For 27 plader fremstilles mindst 250 ml cellesuspension under hensyntagen væskehåndtering, trug dødvolumener og gentagne pipetteringstrin. Hæld cellesuspensionen i sterilt reservoir og placere den på robotten skrivebord.
- Placer 9 stregkodede hvide fladbundede plader med 96 brønde og en æske 200 pi sterile pipettespidser på robotten reception. Bland cellesuspensionen ved pipettering før hver dispensation skridt for at undgå celler afregning under tyngdekraften. Dispenser 75 pi celler i hver brønd på 9 plader for at få en endelig densitet på 1,5 x 10 4 celler pr.
- Dække pladerne med låg og lad dem uden for inkubatoren i 30 minutter for at tillade cellerne at sedimentere til bunden af brønden. Dette vil minimere randeffekter.
- Gentag trin 1.2 og 1.3 to gange for at forberede et samlet antal på 27 plader.
- Placer pladerne ved 37 ° C og 5% CO2 og inkuberes i 24 timer.
2. Dag 2: Behandl cellerne med Library Forbindelser
ntent "> BEMÆRK: Spectrum Collection lille molekyle bibliotek består af 2.000 forbindelser arrangeret i 8 rækker og 10 kolonner i 25 plader med 96 brønde i en koncentration på 10 mM i DMSO Brøndene på de første og sidste kolonner er tomt for kontrol. . Forbindelse screeningsassays udføres typisk ved 1-10 uM forbindelseskoncentration 8. Screeningen protokollen beskrevet her løser 2 um som koncentrationen bearbejdning og 24 timer som assayet slutpunktet.- Optø 9 stofbibliotek plader ved stuetemperatur.
- Forbered to trug med sterilt PBS og PBS-0,5% DMSO-løsninger og placere dem på robotten skrivebord. For hvert bibliotek plade, forberede og mærke i overensstemmelse hermed én fortynding plade - en polypropylen U-bottom 96-brønds plade med et arbejdsvolumen på mindst 400 pi. Fyld hver brønd i kolonne 2 til 11 i fortynding plader med 398 pi sterilt PBS ved hjælp af væskehåndteringsudstyr faste tips. Fill kolonne 1 og 12 med 50 pi sterilt PBSmed 0,5% DMSO for at reproducere koncentrationen køretøjet i kontrolbrøndene (0,02%).
- Placer to bibliotek plader, de tilsvarende mærkede fortynding plader, to kasser med 50 pi sterile pipettespidser og seks celler plader på robotten reception. Afdække celler plader.
- Pipetter 2 ul af 10 mM stamopløsning fra en af to Library plader i den tilsvarende fortynding pladen og bland godt. Dette vil resultere i en mellemliggende forbindelser koncentration på 50 uM. Brug det samme sæt af tips, dispensere 3 pi af 50 uM fortynding i 3 stregkodede hvide plader med 96 brønde med celler. Denne fortynding ordning medfører 2 um arbejder koncentration af hver testet forbindelse.
BEMÆRK: For at undgå unødvendige manipulationer med tips, skal du bruge et komplet sæt af 96 tips fra begyndelsen, selvom biblioteket pladerne indeholder kun 80 forbindelser. Dette er muligt, fordi det første og det sidste kolonner af biblioteket plader er tom. - Udskift pipettespidser og gentag Step 2.4 for andet bibliotek plade.
- Dæk cellerne pladerne og returnere dem til inkubatoren i 24 timer.
- Gentag trin 2,3-2,6 to gange mere for de resterende bibliotekets plader.
3. Dag 3: Udfør Luciferase Assay
BEMÆRK: Før udførelse af luciferase assay, er det muligt at multiplekse det med en cellelevedygtighed assay baseret på reduktionen af resazurin for at opnå en celle-levedygtighed indeks fra hver brønd 9. Multiplexing luciferase og levedygtighedsassay assays resulterer i en reduktion af luciferase signal, dog kan ignoreres, hvis cellerne giver højt nok niveau af luciferaseaktivitet. Luciferaseaktivitet kan påvises ved en række kommercielle og hjemmelavede 10,11 luciferaseassayet reagenser med stabil luminescerende signal.
- Ækvilibrere rekonstituerede luciferase-reagens med valg til stuetemperatur. Sørg for, at lydstyrken er nok til alle analyserede plader. For 27 plades 170 ml luciferase-reagens vil være påkrævet under hensyn til væskehåndtering, trug dødvolumen og gentagne pipetteringstrin. Hæld luciferase reagens i et reservoir og placere den på robotten skrivebord.
- Fjern 9 plader med celler fra inkubatoren, placere dem på robotten skrivebord, afdække og vente, indtil opnået stuetemperatur. Der tilsættes 50 ul af luciferase-reagens per brønd plade af pladen. Mellem pladerne indføre en forsinkelse svarende til luminescens læsning på én plade. Dette vil sikre, at alle pladerne måles inden lige tidsinterval fra reagenstilsætning.
- Efter en 30 minutters inkubation, placere den første plade i luminometeret og måle luminescens efter en kort omrystning trin. Gentag for alle plader. Optag stregkoden af hver plade og knytte det til den tilsvarende datafil for at undgå fejl som følge af et stort antal håndterede plader.
- Gentag trin 3,2-3,3 to gange for de resterende 18 plader med celler. Saml de resterende luciferase reagens og opbevar det ved -20 ° C.
4. Dag 4: Data Analysis
- Proces eksperimentelle data ved hjælp af normalisering af alle prøver med gennemsnittet af bærerbehandlede kontrol på plade. For hvert bibliotek forbindelse beregne middelværdien X og SD i tre eksemplarer.
- Vælg opregulere og nedregulering hits ved at sætte en tærskel på X ± k × SD, hvor den gennemsnitlige værdi X og SD er beregnet over alle assay behandles værdier, og k er en defineret konstant.
- Vælg en vilkårlig tærskel afskæring <20% af vehikelbehandlede kontroller, når en reduktion af luciferase signal sandsynligvis forbundet med forbindelse toksicitet. Udsmid hits under denne tærskel vil reducere en række falske positive hits i counter-screening.
BEMÆRK: I stedet for kontrol-baserede normalisering kan forsøgsdata behandles anvende Z score eller dens robuste analog B skerne 12. Desuden alternative statistiske metoder til hit udvælgelse til rådighed 12.
5. Counter-screening
BEMÆRK: Forbindelser identificeret i den primære skærm (mærket "hits") bekræftes og evalueres for specificiteten af en tæller-screening.
- Cherry plukke de valgte hits fra de portioner, der er gemt i en enkelt 2D stregkodede rør og skabe nye "hit plader", sparer den tilsvarende layout. Glem ikke at forlade frie positioner for kontrollen.
BEMÆRK: I mangel af en effektiv cherry-picking system, kan man teste både kontrol- og 3'UTR-bærende celler parallelt i den primære screening. I dette tilfælde vil specifik udvælgelse af forbindelser med effekter kun afhænger indført 3'UTR være muligt efter den primære screening eliminerer behovet for counter-screening. Den parallelle screening i to cellelinjer vil imidlertid fordoble assayomkostninger. - Efter protokollen for den primære screening (afsnittet "Dag 1: Forberede og Seed celler"), for hver "hit plade" forberede tre plader med 96 brønde af hver CHP134-mycn3UTR og CHP134-CTRL stabile celler.
- Efter protokollen for den primære screening (afsnittet "Dag 2: Behandl cellerne med Library forbindelser"), skal du bruge hver hit plade til at behandle tre CHP134-mycn3UTR og tre CHP134-CTRL-plader på 2 um arbejder koncentration.
BEMÆRK: Mens counter-skærmen beskrevet her udføres i tre eksemplarer på enkelt dosis på 2 uM, kan det være en fordel at erstatte standard gentagelser og teste de hits i 3 koncentrationer som 10 gange fortyndinger fra 2 pm til 20 Nm. Anvendelsen af denne fremgangsmåde vil ikke blot gøre det muligt at bekræfte oplysningerne i den primære skærm, men også for at opnå foreløbige dosis-respons data om de primære hits, hvilket minimerer falsk-positive rater. I dette tilfælde bør en anden analyse rørledning være ansøged at behandle forsøgsdata og bekræfte hits. - Efter protokollen for den primære screening (afsnittet "Dag 3: Udfør Luciferase Assay"), måle luciferaseaktivitet i alle CHP134-mycn3UTR og CHP134-CTRL-plader.
- Efter protokollen for den primære screening (afsnittet "Dag 4: Data Analysis"), normalisere forsøgsdata fra behandlede brønde med gennemsnittet af bærerbehandlede kontrol på plade og beregne det gennemsnitlige og SD i gentagelser. For hver testet forbindelse, beregne fold ændring af luciferaseaktivitet i CHP134-mycn3UTR vs. CHP134-CTRL-celler. Vælg vilkårlig fold ændre cut-offs af> 1,5 og betydning p-værdier på <0,01.
BEMÆRK: I de beskrevne assay indstillingerne den afgørende parameter for hit specificitet er en væsentlig fold ændring af luciferaseaktivitet i CHP134-mycn3UTR vs. CHP134-CTRL-celler. Hvis det er nødvendigt, kan man også vurdere sammensatte toksicitet ved at udføre samtidig en levedygtighed celleassay om SEvalgte handlinger forbindelser. Dette kan især være en fordel, hvis de primære hits counter-screenet i en dosis respons analyse. For en enkelt dosis, indikerer vores erfaring en stærk sammenhæng med reduceret luciferaseaktivitet med nedsat cellelevedygtighed 6. Derfor faldt luciferaseaktivitet i målceller samt kontrolceller kan betragtes som en indikator af forbindelse toksicitet ved den testede koncentration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brug den beskrevne fremgangsmåde, screenede vi en 2.000-forbindelse bibliotek for potentielle modulatorer af post-transkriptionelle kontrolmekanismer udøves gennem 3'UTR af MitCN genet. Figur 3 viser resultaterne af den primære screening eksemplificeret ved et enkelt bibliotek plade. Luciferase signal vises som procent af vehikelbehandlede kontroller blev opnået ved måling af luciferaseaktivitet i tredobbelte plader CHP134-mycn3UTR celler behandlet med forbindelser med et enkelt bibliotek plade. Som forventet, at størstedelen af forbindelser havde nogen virkning på luciferaseaktivitet som angivet ved værdier tæt på 100% baseline. De hits (klare firkanter) blev udvalgt fastsætte en tærskel på X ± 2 SD, hvor middelværdien X og SD er beregnet over alle analyseværdier. Forbindelser reducerer luciferaseaktivitet under 20% (den ene er markeret med stjerne) bør fjernes fra betragtning som den registrerede hæmning sandsynligvis skyldes pronoucerede cellulær toksicitet af forbindelsen.
Figur 4 illustrerer nogle repræsentative eksempler på data opnået i counter-screening af omkring 100 forbindelser. Som kan bedømmes ud fra normaliserede luciferase signal i CHP134-CTRL-celler, sammensatte W ved 2 uM koncentration har ingen effekt på cellelevedygtighed, mens forbindelse X viser noget cytotoksisk aktivitet. Begge forbindelser W og X forårsager imidlertid MitCN 3'UTR-specifik opregulering af luciferaseaktivitet, som indikeret ved fold ændring forskel og t-test. Forbindelse Y ved 2 uM koncentration synes at kompromittere levedygtighed CHP134 celler; i form af specificitet er der ingen forskel i luciferaseaktivitet i CHP134-mycn3UTR og CHP134-CTRL-celler. Endelig stigning i luciferaseaktivitet påvist i den primære screening for forbindelse Z er ikke rigtig afhængig MitCN 3'UTR, idet der observeres en tilsvarende opregulering i CHP134-CTRL-celler. Vi ikke afsløre nogen hit resulterer i MYCN 3'UTR-specifik nedregulering af luciferaseaktivitet.
Figur 1:. Komponenter i det cellebaserede reportergenassay Den øvre panel viser skematisk diagram af MitCN genet. Den MitCN udskrift (NM_005378.4) henledes på skalaen. Kasser repræsenterer exoner med skraverede områder, der svarer til CDS, repræsenterer linjer introns. Journalisten konstruerer Luc-CTRL og Luc-3UTR-MitCN er skematisk nedenfor. CMV, cytomegalovirus; SV40, simianvirus 40. CHP134 neuroblastomcellelinje blev valgt til at producere stabilt transficerede celler ved anvendelse af ovennævnte plasmider. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2:. Beskrivelse af den primære screening Hver enkelt forbindelse bibliotek plade blev anvendt til at behandle tredobbelte plader af CHP134-mycn3UTR celler. Luciferaseaktivitet blev målt efter 24 timers behandling.
Figur 3:. Plate brønde scatter plot af normaliserede værdier repræsenterer en enkelt plade med 96 brønde fra den primære screening CHP134-mycn3UTR celler, der vokser i 96-brønds plader blev behandlet med bibliotekets forbindelser ved 2 uM koncentration. Hvert punkt svarer til luciferaseaktivitet detekteret en enkelt forbindelse efter 24 timer af behandlingen og normaliseret til den gennemsnitlige luciferase detekteret i vehikelbehandlede kontroller inden for samme plade. Vises Datapunkter efter forbindelser stilling i en plade med 96 brønde (10 forbindelser i kolonne 2-10 af rå A tilG). Middelværdi over tre gentagelser ± SD er vist. De hits vises som klare firkanter. Et hit karakteriseret ved reduceret luciferaseaktivitet under 20% er markeret med asterisk.
Figur 4:. Repræsentative eksempler på counter-screening CHP134-mycn3UTR og CHP134-CTRL stabile celler blev behandlet parallelt med forbindelser forhånd valgt i den primære screening. Luciferase-assayet blev udført efter 24 timers behandling ved 2 uM koncentration. Grafen viser repræsentative resultater for fire udvalgte forbindelser, betegnet W, X, Y og Z. Hver søjle svarer til luciferaseaktivitet detekteret en enkelt forbindelse og normaliseret til den gennemsnitlige luciferase signal vehikelbehandlede kontroller i de angivne stabile celler. Fold ændring forskel og statistisk signifikans i to-halet t-test vises, ** p <0,01,*** P <0,001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50 μl Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200 μl Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1x, w/o Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200 mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
References
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (1), 220 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3’ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).
- Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3’ UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene. Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).
- Cheung, N. -K. V., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Herbst, J., et al. Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies. Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).
- van Olst, E. S. iebring-, et al. Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening. J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Hitti, E., et al. A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control. RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).
- Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. Systematic identification of regulatory elements in conserved 3’ UTRs of human transcripts. Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J. Vis. Exp. (87), (2014).
- Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. The 3’ untranslated region of messenger RNA: A molecular “hotspot” for pathology. Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).
- Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention. J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).
- Pascale, A., Govoni, S. The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins. Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).
- Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3’ untranslated regions contribute to the development of human disorders. Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).
- Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. Mining the GEMS--a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms. Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).
- Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. Targeting post-transcriptional control for drug discovery. RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).
