Abstract
転写および転写後調節の両方が遺伝子発現に大きな影響を持っている。しかし、一般的に採用細胞ベースのスクリーニングアッセイは、本質的に、プロモーター - 標的分子の同定を目的とされて、転写調節に焦点を当てる。その結果、転写後のメカニズムは、主に薬剤開発の標的遺伝子の発現によって明らかにされる。ここでは、それを修正することができる化合物を同定することで、そのmRNAの運命の調節において3 '非翻訳領域（UTR）の役割を調べることを目的とした細胞ベースのアッセイを記載する。アッセイは、安定に疾患関連細胞株に組み込まれた目的の遺伝子の3 'UTRを含むルシフェラーゼレポーター構築物の使用に基づいている。プロトコルは、処理の24時間後にルシフェラーゼ活性に影響する分子の同定を目的とした一次スクリーニングでの最初の焦点を、2つの部分に分割される。プロトコルの第2部分カウンタースクリーニング3 'UTRを通じて、具体的ルシフェラーゼ活性を調節する化合物を区別する必要を説明しています。詳細なプロトコルおよび代表的な結果に加えて、我々はアッセイ開発および内因性標的に対するヒット（複数可）の妥当性についての重要な考慮事項を提供する。記載した細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイは、科学者が3 'UTR依存的転写後機構を介してタンパク質レベルを調節する分子を同定することを可能にする。
Introduction
長期間の遺伝子発現の転写調節は、タンパク質産生の制御において主要でない場合、排他的な役割を果たしていると考えられた。証拠を蓄積するが、転写後調節は、細胞のタンパク質存在量1,2を決定する限り、そうでない場合、転写調節よりも寄与していることを示している。遺伝子発現の転写後制御は、最初に考えただけであったよりはるかに複雑かつ精巧である。実際には、転写後制御のすべての様々な段階は、mRNAプロセシング、局在、代謝回転、並進3と同様に、新たに記載の可逆的RNAのメチル4を含む、調節されることが浮上している。潜在的に影響を受けた転写後調節プロセスの数から、以下に記載のアッセイは、mRNAの3 '非翻訳領域（UTR）に関与するものに焦点を当てている。 3 'UTRは広く、主にRNA結合PRの特異的相互作用を介してmRNAの運命に影響を与えるその調節配列および/ または二次構造5 oteinsおよび非コードRNA。したがって、これらの相互作用を変化させるか、上流のシグナル伝達経路を妨害する小分子は、タンパク質の存在量を調節するバランスをシフトする。この治療アプローチは、証拠は、疾患関連遺伝子がこのような薬理学的介入のための潜在的標的を表す転写後調節に供されていることを示す存在するヒトの病状のために特に重要である。したがって、ハイスループット形式における転写後制御機構との干渉を介してmRNAレベル「モジュレーターのスクリーニングを可能にするシステムは、潜在的な新規治療の同定に有用なツールになることができる。
記載した細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイは、その3 'UTR依存メカニズムを介してmRNAの運命を調節することができる化合物の同定を可能にする。これは、いくつかの主要なCで構成されていomponents（ 図1）およびアッセイの実現可能性を検証するためにいくつかの予備的な手順が必要です。まず、レポーター構築物は、目的の遺伝子の3 'UTRを含むように設計されている。 3 'UTRは、ホタルルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子（ 図1）の末端に融合される。挿入された3 'UTRを介して発揮される転写後制御機構の変化は、様々なルシフェラーゼのレベルをもたらす、このキメラ転写物の安定性および/または翻訳効率を変える。したがって、ルシフェラーゼ活性の変化は、目的の遺伝子の影響を受けた転写後調節の間接的な尺度として役立つ。システムの第二の成分は、対照レポーター構築、同じレポーター遺伝子を発現するが、任意の3 'UTRを含まない同一の発現プラスミドである。 2つのレポータープラスミドは、従来の分子生物学プロトコールを用いて実験室で設計された、または商業的供給源から購入することができる。
適切な細胞株の選択は、アッセイの構築のために重要である。どの細胞株が最適モデルである可用性、トランスフェクション能力、及び成長特性のようなだけで実用的な問題への病理に対する最大の類似性のような臨床要件に至るまで、多くの要因に依存します。重要なことは、前には1つが、レポーター遺伝子の3 'UTRの融合がキメラ転写物のレベルで期待される効果があることを確認する必要が進みます。 3からのルシフェラーゼシグナルの有意差がないこと」UTR-ベアリングとコントロールレポーター一過選択した細胞にトランス構築物3ことを示すことになる」UTRは、代替ものの検索の入力を求める、この細胞モデルにおいて機能していません。ハイスループットフォーマットでは、3 'UTR-軸受および制御ルシフェラーゼレポーター構築物を安定的に選択された細胞株中で統合されるべきである。安定的にトランスフェクト一過上に統合を使用して、細胞株は、いくつかの理由のために好ましい。これは、困難なトランスフェクト細胞株を含む細胞モデルの選択を広げるトランスフェクション効率の変動によるデータのばらつきを減少させ、コストが治まる。また、一過性トランスフェクション細胞に非常に多くの場合、システムの飽和につながるDNAプラスミドで過負荷にされている。これらの設定ではレポーター発現の更なる増加は、潜在的なアップレギュレート化合物に向かって減少した感度で、その結果、困難な場合があります。
すべてのアッセイ成分が設定されている場合、ルシフェラーゼ活性を特異的に挿入3を介して上方及び下方調節することができ、実際に最後に、もし、それは、 すなわち 、アッセイの実行可能性を決定するために、ハイスループットフォーマットに移動する前に、重要であるUTR。最高のコントロールが関心の3 'UTRを通じてmRNAの安定性または翻訳可能を調節することが報告された小分子であろう。これらを有するある場合所望の効果を模倣していない可能性、サロゲートコントロールが受け入れられます。これらのmiRNAまたは対象の3 'UTRへの結合を介してそれらの効果を発揮することが知られているRNA結合タンパク質であり得る。このような制御の評価は次スクリーニングは、開発されたアッセイの機能性を示すだけでなく、ハイスループット形式でのダイナミックレンジ、感度や性能の推定を可能にするだけでなく、前に。
記載されているプロトコルを使用して、我々は、2000-化合物ライブラリ6をスクリーニングした。神経芽細胞腫、幼児期の最も一般的な頭蓋外固形腫瘍は、増幅強く標的遺伝子7として、神経芽細胞腫の有害転帰を予測するMYCN癌遺伝子の生物学的モデルおよび3 'UTRとした。 図2実験的なレイアウトの概要を示します。スクリーニングは、1回の実行でスクリーニング27のプレートのバッチサイズで3回の実行に分けた。 27プレートのバッチはスペクトラムコレクションライブラリが含まれてプレートN.1-N.8 + n.25（ファーストラン）、n.9-n.16 + n.25（セカンドラン）とn.16-n.24 + n.25（第3ラン）、各三重でスクリーニングプレート。このように、1ライブラリプレート（n.25）が可能インターラン比較を行う3つのすべての実行中で分析した。以下のプロトコルを3回試験9ライブラリプレートの回の実行について説明します。
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Protocol
注：そのようなアッセイシステムのスループットは、利用可能なHTSのラボ機器に依存します。このプロトコルは、96ウェルフォーマットで液体ハンドリングを行うテカン自由EVO 200ロボットによって促進される。 384ウェルフォーマットの小型化も可能である。ロボット液体ハンドリングシステムは、全ての実験工程の間、無菌状態を維持するために、層流フードの下に配置されている。に液体ハンドリング自動化が可能でない場合、プロトコルは、容易に低スループットフォーマットに適合させることができる。
一次スクリーニング
1. 1日目：準備し、種細胞
NOTE：種子細胞はルシフェラーゼ活性、播種後、すなわち 、48時間の検定時に80％のコンフルエンスが得られた。
- 再懸 濁し、10％FBSおよび1％L-グルタミンを含むRPMI中で2×10 5細胞/ mlの濃度にCHP134-mycn3UTR神経芽腫細胞をトリプシン処理。 27プレート用の少なくとも250ミリリットルを準備アカウント液体ハンドリングを考慮細胞懸濁液は、デッドボリュームを繰り返しピペット操作谷。無菌のリザーバに細胞懸濁液を注ぎ、ロボット机の上に置きます。
- 9バーコード白平底96ウェルプレートとロボットの机の上に200μlの滅菌ピペットチップの箱を置きます。重力下で沈降細胞を避けるために、各分注工程の前に、ピペッティングにより細胞懸濁液を混合する。ウェルあたり1.5×10 4細胞の最終密度を得るために9プレートの各ウェルへの細胞の75μlの分注する。
- 蓋でプレートをカバーし、細胞がウェルの底に沈降することを可能にするために30分間インキュベーターの外にそれらを残す。これは、エッジ効果を最小化する。
- 繰り返し27プレートの総数を調製するために、二度1.2および1.3を繰り返す。
- 37℃でプレートを置き、5％CO 2および24時間インキュベート。
2. 2日目：ライブラリ化合物を用いて細胞を処理
ntent ">注：スペクトラムコレクション小分子ライブラリーは、DMSO中10mMの濃度で、25を96ウェルプレートに8行10列に配列された2000の化合物で構成され、最初と最後のカラムにウェルをコントロールの空のままにされている。 。化合物スクリーニングアッセイは、通常、1〜10μMの化合物濃度8で実行されている。ここで説明するスクリーニングプロトコルは、アッセイのエンドポイントとして使用濃度として2μM、24時間を修正します。- 室温で9化合物ライブラリープレートを解凍する。
- 滅菌PBSとPBS-0.5％のDMSO溶液で2谷を準備し、ロボットの机の上に置きます。少なくとも400μlの作業容積でポリプロピレンU底96ウェルプレート - 各ライブラリープレートについては、それに応じてつの希釈プレートを調製し、ラベルを付けます。液体ハンドラの固定チップを使用して滅菌PBSの398μlの希釈プレートの11に列2の各ウェルを埋める。無菌PBS50μlと列1および12を埋める対照ウェルにおける車両濃度（0.02％）を再生するために、0.5％のDMSOを含む。
- ロボット机の上に2ライブラリのプレート、それに応じてラベル希釈プレート、50μlの滅菌したピペットチップと6セルプレートの2箱を置きます。細胞プレートを発見する。
- 対応する希釈プレート内の2つのライブラリプレートの1から10 mMのストック溶液をピペットを2μl、よく混ぜる。これは、50μMの中間体化合物の濃度になります。チップの同じセットを使用して、細胞と3バーコードの白色96ウェルプレートに50μMの希釈液3μlを分配する。各々の濃度を作業2μMでこの希釈スキームの結果は、化合物をテストした。
注：ライブラリプレートは唯一の80の化合物が含まれているにもかかわらず、最初から96のヒントの完全なセットを使用し、ヒントを不要な操作を避けるために。第ライブラリプレートの最後の列は空であるので、これは可能である。 - ピペットチップを交換して、聖を繰り返す第二のライブラリプレート用EP 2.4。
- 細胞プレートをカバーし、24時間培養器に戻す。
- 繰り返して、残りのライブラリプレート用2.3から2.6をさらに2回繰り返します。
3. 3日目：ルシフェラーゼアッセイを行う
注：ルシフェラーゼアッセイを行う前に、各ウェルからの9細胞生存率を得るために、レサズリンの還元に基づく細胞生存率アッセイでそれを多重化することが可能である。多重ルシフェラーゼおよび生存率アッセイ細胞を、ルシフェラーゼ活性の十分に高いレベルを提供する場合、しかし、無視できるルシフェラーゼシグナルの減少アッセイの結果。ルシフェラーゼ活性は、安定した発光シグナルの商業自家製10,11ルシフェラーゼアッセイ試薬の多様によって検出することができる。
- 室温への最適な再構成されたルシフェラーゼ試薬を平衡化する。ボリュームはすべてのアッセイされたプレートには十分であることを確認してください。 27プレートのためにSルシフェラーゼ試薬の170ミリリットルは、アカウントの液体処理を考慮して必要とされる、デッドボリュームと繰り返しピペット操作ステップを谷。リザーバにルシフェラーゼ試薬を注ぎ、ロボット机の上に置きます。
- インキュベーターから細胞と9のプレートを取り外し、ロボット机の上に置き、明らかにし、室温に平衡化するまで待つ。プレートによってウェルプレートあたりルシフェラーゼ試薬50μlのを追加。プレート間に、一方のプレートの発光読み取り時間に等しい遅延を導入する。これは、すべてのプレートが試薬添加から等しい時間間隔内に測定されることを保証する。
- 30分間のインキュベーション後、ルミノメーターで第一プレートを配置し、簡単な振盪工程後の発光を測定する。すべてのプレートについて繰り返します。各プレートのバーコードを記録し、取り扱いのプレートの大多数から生じるミスを避けるために、対応するデータファイルに関連付けます。
- 繰り返して細胞と残りの18プレート用二度3.2から3.3を繰り返します。 残りのルシフェラーゼ試薬を収集し、-20℃で保管してください。
4. 4日目：データ解析
- オンプレートビヒクル処置対照の平均にすべてのサンプルの正規化を使用して、プロセスの実験データ。各ライブラリー化合物については、トリプリケートにわたる平均値XおよびSDを計算。
- 選択してアップレギュレートおよびダウンレギュレートの平均値xとSDが全てのアッセイ処理された値に対して計算されているSD、およびK×K±xのしきい値を設定することでヒットを定義された定数である。
- ルシフェラーゼシグナルの減少は、おそらく、化合物の毒性に関連付けられている場合、任意の閾値カットオフ<ビヒクル処置対照の20％を選択する。このしきい値以下のヒットを破棄することが大幅カウンタースクリーニングで偽陽性ヒット数を減らすことができます。
注：代わりに、制御系の正常化のため、実験データは、Zスコアまたはその堅牢なアナログB sに適用して処理することができるコア12。また、ヒットの選択のための代替統計的アプローチは12利用可能です。
5.カウンタースクリーニング
注：一次スクリーニング（ラベル「ヒット」）で同定された化合物は、カウンタースクリーニングにより特異性について確認され、評価される。
- チェリーは単一の2Dバーコードのチューブに格納されている分量から選択ヒットを選んで、「プレートをヒット "新しいを作成し、対応するレイアウトを保存する。コントロールの自由な位置を残すことを忘れないでください。
注：効率的なチェリー·ピッキングシステムが存在しない場合には、1を制御し、一次スクリーニングで並行して、3 'UTRを有する細胞の両方をテスト可能性があります。この場合、唯一の導入3 'UTR依存効果を有する化合物の特定の選択は、カウンタースクリーニングの必要性を排除し、一次スクリーニングの後に可能となる。しかし、2つの細胞株における並列スクリーニングアッセイを倍増コスト。 - 一次スクリーニングのためのプロトコル（セクション "1日目：準備し、種細胞」）に続いて、各「ヒットプレート」のために各CHP134-mycn3UTRとCHP134-CTRL安定した細胞の3の96ウェルプレートを準備します。
- 一次スクリーニングのためのプロトコル（セクション「2日目：ライブラリ化合物を用いて細胞を処理」）に続いて、作業濃度2μMで3 CHP134-mycn3UTRと3 CHP134-CTRLプレートを治療するための各ヒットプレートを使用しています。
注：ここで説明するカウンター画面が2μmの単回投与で、三連で行われている間、それは標準の複製を代用し、2μMから20の範囲の10倍希釈液として3濃度でのヒットをテストすることは有益かもしれません。このアプローチを適用する一次画面のデータを確認することを可能にするだけでなく、一次ヒットの予備的な用量 - 応答データを取得するために、偽陽性率を最小化する。この場合、異なる解析パイプラインはアプリであるべき実験データを処理し、ヒットを確認するために、編。 - 一次スクリーニングのためのプロトコル（セクション「3日目：ルシフェラーゼアッセイの実行」）に続いて、すべてのCHP134-mycn3UTRとCHP134-CTRLプレートでルシフェラーゼ活性を測定する。
- 一次スクリーニングのためのプロトコル（セクション「4日目：データ解析 "）に続いて、オンプレートビヒクル処置対照の平均に処理したウェルからの実験データを正規化し、反復実験にわたる平均およびSDを計算する。試験した各化合物について、CHP134-CTRL細胞対CHP134-mycn3UTRにおけるルシフェラーゼ活性の変化倍率を計算する。任意の倍率変化カットオフ> <0.01の1.5と意義p値を選択します。
注：記載されているアッセイの設定でヒット特異性のための行列式のパラメータは、CHP134-CTRL細胞対CHP134-mycn3UTRにおけるルシフェラーゼ活性の有意な倍率変化である。必要に応じて、一つ又それに並行して細胞生存率アッセイを行うことにより、化合物の毒性を評価するかもしれないlected化合物。一次ヒットは、用量反応分析でカウンタースクリーニングされる場合に特に有益であり得る。単回投与のために、我々の経験は6細胞生存率の低下を低減し、ルシフェラーゼ活性の強い相関関係を示している。従って、標的細胞におけるルシフェラーゼ活性の低下、並びにコントロール細胞は、試験した濃度で、化合物の毒性の指標と考えることができる。
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Representative Results
説明したアプローチを用いて、我々は、MYCN遺伝子の3 'UTRを介して発揮される転写後制御機構の潜在的調節のための2000-化合物ライブラリーをスクリーニングした。 図3を単一のライブラリープレートによって例示次スクリーニングの結果を示す。ビヒクル処置対照のパーセンテージとして表示されるルシフェラーゼシグナルは、単一のライブラリープレートの化合物で治療CHP134-mycn3UTR細胞の三連のプレート中のルシフェラーゼ活性を測定することにより求めた。予想されるように、100％のベースラインに近い値で示されるように、化合物の大部分は、ルシフェラーゼ活性に影響を及ぼさなかった。ヒット（透明の四角形）は、平均値XとSDを全てのアッセイ値に対して計算されるX±SD 2の閾値を設定することを選択した。検出された阻害はおそらくpronouした結果として20％（アスタリスクでマーク1）は、以下のルシフェラーゼ活性を低下させる化合物は、検討対象から除外されるべきである化合物のNCED細胞毒性。
図4は、約100の化合物のカウンタースクリーニングで得られたデータのいくつかの代表的な例を示す。 CHP134-CTRL細胞における正規化されたルシフェラーゼシグナルから判断されるように、化合物Xは、いくつかの細胞傷害活性を示す一方、2μMの濃度での化合物のWは、細胞生存率に影響を及ぼさない。倍率変化の差のt検定によって示されるように、W及びXの両方の化合物は、しかしながら、アップレギュレーションは、ルシフェラーゼ活性のMYCN 3 'UTR固有引き起こす。 2μMの濃度の化合物のYはCHP134細胞の生存を危うくするようだ。特異性の点で、CHP134 mycn3UTRとCHP134-CTRL細胞におけるルシフェラーゼ活性の差異はない。同等のアップレギュレーションは、CHP134-CTRL細胞で観察されているので、最終的に、化合物Zの一次スクリーニングで検出されたルシフェラーゼ活性の増加は、MYCN 3 'UTRに真に依存しない。私たちは、Mに起因するいかなるヒットを検出しなかったYCN 3 'UTR特異的ダウンレギュレーションルシフェラーゼ活性の。
図1：細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイの成分は、上のパネルは、MYCN遺伝子の概略図を表示する。 MYCN転写産物（NM_005378.4）は縮尺で描かれている。ボックスが影付きの領域がCDSに対応するエクソンを表す、行はイントロンを表す。レポーターは、リュック·CTRLとリュック·3UTR-MYCNは以下に概略的に表現され構築します。 CMV、サイトメガロウイルス。 SV40、シミアンウイルス40はCHP134神経芽腫細胞株は、上記のプラスミドを使用して安定的にトランスフェクトされた細胞を生成するように選択した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：一次スクリーニングの概要各単一化合物ライブラリープレートをCHP134-mycn3UTR細胞の三連のプレートを治療するために使用した。ルシフェラーゼ活性は、処置の24時間後に測定した。
図3：一次スクリーニングからの単一の96ウェルプレートを表す正規化された値のプレートウェルの散布図は、96ウェルプレート中で増殖CHP134-mycn3UTR細胞を2μMの濃度で、ライブラリー化合物で処理した。各点は、24治療の時間と同じプレート内における車両処置対照で検出された平均ルシフェラーゼシグナルに正規化した後、単一の化合物のために検出ルシフェラーゼ活性に対応している。データ点は、96ウェルプレート内の化合物の位置（原料Aから列2-10 10の化合物の次の表示されているG）。 SDが表示されている±3回の反復にわたる平均。ヒットは明確な正方形として表示されます。 20パーセント以下に減少し、ルシフェラーゼ活性を特徴とするヒットはアスタリスクでマークされている。
図4：カウンタースクリーニングの代表例 CHP134-mycn3UTRとCHP134-CTRL安定細胞を、一次スクリーニングにおいて、予め選択された化合物と並行して処理した。ルシフェラーゼアッセイを、2μMの濃度での処理の24時間後に行った。グラフは、各バーは、示された安定した細胞における、ビヒクル処置対照の平均ルシフェラーゼシグナルの単一の化合物と、正規化のために検出されたルシフェラーゼ活性に対応するW、X、Y、およびZを指定された選択された4つの化合物についての代表的な結果を示している。表示されている両側t検定で変化差と統計的有意性を折る、** はp <0.01、*** P <0.001。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50 μl Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200 μl Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1x, w/o Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200 mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
References
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