Abstract
Både transkription och posttranskriptionell reglering har en djupgående inverkan på gener uttryck. Men vanligen antagits cellbaserade screeninganalyser fokuserar på transkriptionsreglering, som i huvudsak syftar till att identifiera promotor-målsökande molekyler. Som ett resultat, är post-transkriptionella mekanismer till stor del otäckt av genuttryck riktad läkemedelsutveckling. Här beskriver vi en cellbaserad analys som syftar till att undersöka den roll som den otranslaterade 3'-regionen (3 'UTR) i moduleringen av ödet av dess mRNA, och vid identifiering av föreningar som kan modifiera den. Analysen är baserad på användningen av en luciferasrapportör konstruktion innehållande 3 'UTR av en gen av intresse integreras stabilt i ett sjukdoms relevant cellinje. Protokollet är uppdelad i två delar, med initialt fokus på den första undersökningen som syftar till att identifiera molekyler som påverkar luciferasaktivitet efter 24 timmar av behandling. Den andra delen av protokolletbeskriver kontra screening nödvändigt att diskriminera föreningar som modulerar luciferasaktivitet specifikt genom 3 'UTR. Utöver den detaljerade protokoll och representativa resultat, vi ger viktiga överväganden om analysutveckling och validering av träffen (s) på endogena målet. Den beskrivna cellbaserade reportergenanalys tillåter forskarna att identifiera molekyler modulerproteinnivåer via post-transkription mekanismer beroende på en 3 'UTR.
Introduction
Under en lång period transkriptionell reglering av gen-expression tros spela en viktig, om inte exklusiv roll i kontrollen proteinproduktion. Ackumulerande bevis tyder emellertid på att posttranskriptionell reglering bidrar lika mycket som, om inte mer än, transkriptionsreglering för att bestämma cellulärt protein överflöd 1,2. Posttranskriptionell kontroll av genuttryck är mycket mer komplex och genomarbetade än var vid första tanken. I själva verket har alla de olika stadierna av posttranskriptionell kontroll framkom att regleras, inklusive mRNA bearbetning, lokalisering, omsättning, översättning 3 samt den nyligen beskrivna reversibla RNA metylering 4. Från ett antal post-transkriptionell reglering processer kan beröras, beskrev analysen nedan fokuserar på de som involverar mRNA 3 'otranslaterad region (3' UTR). 3 'UTR påverkar i stort sett mRNA öde främst via specifik interaktion av RNA-bindande proteins och icke-kodande RNA till dess reglerande sekvenser och / eller sekundära strukturer 5. Därför kommer små molekyler som förändrar dessa interaktioner eller störa uppströms signaltransduktionsvägar skifta balansen som reglerar protein överflöd. Denna terapeutiska tillvägagångssätt är av särskild betydelse för mänskliga sjukdomar för vilka belägg som visar att sjukdomsrelevanta generna utsätts för posttranskriptionell reglering, som därmed utgör ett potentiellt mål för farmakologisk intervention. Därför kan system som möjliggör screening av mRNA nivåer "modulatorer genom interferens med post-transkription kontrollmekanismer i en hög genomströmning format blir värdefulla verktyg i identifieringen av potentiella nya behandlingar.
Den beskrivna cellbaserad reportergen analysen möjliggör identifiering av föreningar som kan modulera mRNA öde via mekanismer som är beroende på dess 3 'UTR. Den består av flera huvud components (Figur 1) och kräver några inledande steg för att validera genomförbarheten av analysen. Först av allt, är reporterkonstruktionen konstruerad att inkludera 3'-ITR från en gen av intresse. Den 3 'UTR smälts till änden av en reportergen såsom eldflugeluciferas (Figur 1). Eventuella ändringar i posttranskription kontrollmekanismer som utövas genom den införda 3 'UTR kommer att förändra stabilitet och / eller effektivitets översättning av denna chimär transkript, vilket resulterar i varierande luciferas nivåer. Därför, förändringar i luciferasaktivitet tjäna som indirekt mått på drabbade post-transkriptionell reglering av genen av intresse. Den andra komponenten i systemet är en styrreporterkonstruktion, en identisk expressionsplasmid som uttrycker samma reportergenen men som inte innehåller någon 3 'UTR. De två reporterplasmider kan utformas i labbet med hjälp av konventionella molekylärbiologiska protokoll eller köpas från kommersiella källor.
Valet av en lämplig cellinje är kritisk för analysen konstruktion. Vilken cellinje är den optimala modellen beror på flera faktorer som sträcker sig från kliniska krav som maximal likhet med patologi att bara praktiska frågor som tillgänglighet, transfectability och tillväxtegenskaper. Viktigt före vidare en bör se till att fusion av 3 'UTR till reportergenen har en förväntad effekt på nivån av den chimära transkriptet. Frånvaron av signifikant skillnad i luciferas signal från 3 'UTR bärande och kontroll reporter konstruktioner transient i de markerade cellerna skulle indikera att 3' UTR fungerar inte i denna cellulära modell, fråga efter jakt efter alternativa sådana. För hög genomströmning format, bör de 3 'UTR bärande och luciferas kontroll reporter konstruktioner stabilt integreras i den valda cellinje. Med hjälp av en stabilt integrerad över transient transfekteradecellinje är att föredra av flera skäl. Detta kommer att bredda valet av en cellulär modell inkluderande svår transfektera cellinjer, minska variationen i uppgifterna på grund av fluktuationer i transfektionseffektivitet, avta kostnaderna. Dessutom, efter transient transfektion celler mycket ofta överbelastade med en DNA-plasmid som leder till mättnad av systemet. I dessa inställningar en ytterligare ökning av reportern uttrycket kan vara utmanande, vilket resulterar i minskad känslighet för potentiella upregulating föreningar.
Slutligen när alla analyskomponenter sätts upp, är det viktigt för flyttning till hög genomströmning format för att avgöra om det är möjligt för analysen, dvs om luciferasaktivitet kan vara verkligen upp- och nedregleras specifikt via insatt 3 ' UTR. De bästa kontrollerna skulle vara små molekyler rapporterats att modulera stabiliteten eller översättbarhet av mRNA genom 3 'UTR av intresse. Om att ha dessa ärinte är möjligt, är surrogat kontroller imiterar den önskade effekten accepteras. Dessa kan vara miRNA eller RNA-bindande proteiner som är kända för att utöva sina effekter via bindning till den 3 'UTR av intresse. Utvärdering av sådana kontroller innan den första undersökningen visar inte bara funktionalitet utvecklade analysen, men också tillåter uppskattning av dess dynamiska omfång, känslighet och prestanda i hög genomströmning format.
Använda beskrivna protokollet vi skärmad en 2.000-förening bibliotek 6. Neuroblastom är den vanligaste extrakraniella fast tumör av linda, användes som en biologisk modell och 3 'UTR av MYCN onkogenen, vars förstärkning förutsäger starkt negativt utfall av neuroblastom, såsom en målgen 7. Figur 2 skisserar experimentella layouten. Screeningen delades i tre körningar med satsstorlek på 27 plattor screenade i en körning. Satsen av 27 plattor ingår Spectrum Collection bibliotekplattor n.1-n.8 + n.25 (första körningen), n.9-n.16 + n.25 (andra åket) och n.16-n.24 + n.25 (tredje körning), vardera platta skärmad i tre exemplar. Således var ett bibliotek platta (n.25) analyseras inom alla tre körningar gör möjligt inter run jämförelse. Protokollet nedan beskriver en enda körning av nio biblioteksplattor testade i tre exemplar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Genomströmningen av sådana analyssystem beror på den tillgängliga HTS labbutrustning. Detta protokoll underlättas av en Tecan Freedom EVO 200 robot, som utför vätskehanteringen i 96-brunnsformat. Miniatyrisering till 384-brunnsformat är också möjlig. Vätskehantering robotsystemet är placerad under ett laminärt flöde huva för att upprätthålla aseptiska förhållanden under alla försökssteg. Om ingen vätskehanterings automatisering är tillgänglig, kan protokollet lätt anpassas till låg genomströmning formatet.
Primär screening
1. Dag 1: Förbered och Seed celler
OBS: Seed celler för att ge 80% konfluens vid tidpunkten för analys av luciferasaktivitet, dvs, 48 h efter sådd.
- Resuspendera trypsiniserades CHP134-mycn3UTR neuroblastomceller till en koncentration av 2 x 10 5 celler / ml i RPMI innehållande 10% FBS och 1% L-glutamin. För 27 plattor förbereda minst 250 ml cellsuspension med hänsyn vätskehanterande, tråg dödvolymer och upprepade pipetteringssteg. Häll cellsuspensionen i sterilt reservoar och placera den på roboten skrivbordet.
- Placera 9 streckkodade vita flatbottnade 96-hålsplattor och en låda med 200 mikroliter sterila pipettspetsar på robotdisken. Blanda cellsuspensionen genom pipettering före varje dispens steg för att undvika celler lösa under gravitation. Dispensera 75 | il celler till varje brunn i nio plattor för att få en slutlig densitet av 1,5 x 10 4 celler per brunn.
- Täck plattorna med locken och lämna dem utanför inkubatorn under 30 min för att tillåta cellerna att sedimentera till botten av brunnen. Detta minimerar kanteffekter.
- Upprepa steg 1,2 och 1,3 gånger i syfte att framställa ett totalt antal av 27 plattor.
- Placera plattorna vid 37 ° C och 5% CO2 och inkubera i 24 h.
2. Dag 2: Behandla cellerna med Library Föreningar
ntent "> OBS! Spectrum Collection liten molekyl bibliotek består av 2.000 föreningar arrangerade i åtta rader och 10 kolumner i 25 96-brunnar vid en koncentration av 10 mM i DMSO Brunnarna på första och sista kolumnerna lämnas tomma för kontroller. . Förening screenings analyser vanligen utförs vid 1-10 iM förening koncentration 8. Screeningen protokoll som beskrivs här fixar 2 iM som arbetskoncentrationen och 24 timmar som analys slutpunkt.- Tina 9 förening biblioteksplattor vid rumstemperatur.
- Förbered två tråg med steril PBS och PBS-0,5% DMSO-lösningar och placera dem på roboten skrivbordet. För varje bibliotek platta, förbereda och märka följaktligen en utspädningsplatta - en polypropylen U-botten 96-brunnar med en arbetsvolym på minst 400 l. Fyll varje brunn kolumner 2-11 av utspädningsplattor med 398 l sterilt PBS använder vätskehanteraren fasta tips. Fyll kolumnerna 1 och 12 med 50 l sterilt PBSmed 0,5% DMSO i syfte att återge fordonets koncentrationen i kontrollbrunnarna (0,02%).
- Placera två biblioteksplattorna, motsvarande märkta utspädningsplattor, två lådor med 50 pl sterilt pipettspetsar och sex celler plattor på roboten disken. Avslöja celler plattor.
- Pipettera 2 ^ il av 10 mM stamlösning från en av två biblioteksplattor i motsvarande utspädningsplattan och blanda väl. Detta kommer att resultera i ett mellanliggande föreningar koncentration av 50 pM. Med samma uppsättning tips, dosera 3 pl 50 iM utspädning i 3 streckkodade vita plattor med 96 brunnar med celler. Denna utspädning schema resulterar i 2 ^ M arbetar koncentration av varje testad förening.
OBS: För att undvika onödiga manipulationer med tips, använd en full uppsättning av 96 tips från början, även om biblioteket plattorna innehåller endast 80 föreningar. Detta är möjligt eftersom det första och sista kolumnerna i biblioteket plattorna är tomma. - Byt pipettspetsar och upprepa Step 2.4 för det andra biblioteket plattan.
- Täck celler plattorna och återlämna dem till inkubatorn i 24 timmar.
- Upprepa steg 2,3-2,6 två gånger för de återstående biblioteksplattorna.
3. Dag 3: Utför Luciferase Assay
Obs! Innan kontroll luciferasanalysen, är det möjligt att multiplexera den med en cellviabilitet analys baserad på reduktion av resazurin för att erhålla en cell-viabilitet från varje brunn 9. Multiplexing luciferas och viabilitetsanalys analyser leder till en minskning av luciferas signal som dock kan ignoreras om cellerna ger tillräckligt hög luciferasaktivitet. Luciferasaktivitet kan detekteras genom en mängd olika kommersiella och hemgjorda 10,11 luciferas analysreagens med stabil lysande signal.
- Jämvikta rekonstituerade luciferas reagenset till rumstemperatur. Kontrollera att volymen är tillräckligt för alla de prövade plåtar. För 27 plattas 170 ml luciferasreagens kommer att krävas med hänsyn vätskehantering, tråg död volym och upprepade pipetteringssteg. Häll luciferasreagens in i en reservoar och placera den på roboten skrivbordet.
- Ta bort 9 plattor med celler från inkubatorn, placera dem på robot skrivbord, avslöja och vänta tills jämvikt vid rumstemperatur. Lägg 50 ul av luciferas reagens per brunnsplatta genom plattan. Mellan plattorna, introducera en fördröjning som är lika med tiden för en platta luminiscens läsning. Detta kommer att försäkra att alla plattorna mäts inom samma tidsintervall från reagenstillsats.
- Efter en 30 minuters inkubation, placera den första plattan i luminometer och mäta luminiscens efter en kort skakning steg. Upprepa för alla plåtar. Anteckna streckkod på varje platta och associera den till den motsvarande datafilen för att undvika misstag till följd av ett stort antal hanterade plattor.
- Upprepa steg 3,2-3,3 gånger för de återstående 18 plattor med celler. Samla resterande luciferasreagens och förvara den vid -20 ° C.
4. Dag 4: Dataanalys
- Bearbeta experimentella data med hjälp av normalisering av alla prover till genomsnittet av på-platta vehikelbehandlade kontroller. För varje bibliotek förening, beräkna medelvärdet X och SD över tre exemplar.
- Välj upp reglerande och nedreglera hits genom att sätta en tröskel på X ± k × SD, där medelvärdet X och SD beräknas över alla analys bearbetade värden, och k är en definierad konstant.
- Välj en godtycklig tröskel cut-off <20% av vehikelbehandlade kontroller när en reduktion av luciferas signal troligen förknippade med förening toxicitet. Kassera de träffar under denna tröskel kommer att avsevärt minska ett antal falska positiva träffar i kontra screening.
OBS: I stället för kontroll baserade normalisering, kan experimentella data behandlas tillämpa Z poäng eller dess robusta analog B skärna 12. Dessutom alternativa statistiska metoder för träff val finns tillgängliga 12.
5. Counter-screening
OBS: Föreningar som identifierats i den primära skärmen (märkt "hits") bekräftas och utvärderas för specificitet av en räknare-screening.
- Cherry plocka utvalda hits från de portioner som lagras i enstaka 2D streckkodade tuber och skapa nya "hit plattor", spara motsvarande layout. Glöm inte att lämna fria positioner för kontroller.
OBS: I avsaknad av en effektiv cherry-picking systemet, kan man testa både kontrollen och 3 'UTR-bärande celler parallellt i primärscreening. I detta fall kommer specifikt val av föreningar med effekter beroende enbart infört 3 'UTR vara möjlig efter det primära screeningen eliminerar behovet av räknare-screening. Emellertid kommer den parallella rastrering i två cellinjer fördubbla analysenkostnader. - Efter protokollet för den första undersökningen (avsnittet "Dag 1: Förbered och Seed Cells"), för varje "träff platta" förbereda tre 96-hålsplattor av varje CHP134-mycn3UTR och CHP134-CTRL stabila celler.
- Efter protokollet för den första undersökningen (avsnittet "Dag 2: Behandla cellerna med Bibliotek Föreningar"), använd varje träff platta för att behandla tre CHP134-mycn3UTR och tre CHP134-CTRL-plattor vid 2 ^ M arbetar koncentration.
OBS: Medan kontra skärmen beskrivs här utförs i tre exemplar vid engångsdos av 2 ^ M, kan det vara fördelaktigt att ersätta standardreplik och testa träffarna i 3 koncentrationer som 10-faldiga utspädningar från 2 ^ M till 20 nM. Att tillämpa detta synsätt skulle inte bara göra det möjligt att bekräfta de som i den primära skärmen, men också att få preliminära dos-responsdata på de primära hits, minimerar falskt positiva skattesatser. I detta fall bör en annan analys pipeline vara tillämped att bearbeta experimentella data och bekräfta träffar. - Efter protokollet för den första undersökningen (avsnittet "Dag 3: Utför Luciferase Assay"), mäter luciferasaktivitet i alla CHP134-mycn3UTR och CHP134-CTRL-plattor.
- Efter protokollet för den första undersökningen (avsnittet "Dag 4: Data Analysis"), normalisera experimentella data från behandlade brunnar med genomsnittet av på-platta vehikelbehandlade kontroller och beräkna medelvärdet och SD över replikat. För varje testad förening, beräkna faldig förändring av luciferasaktivitet i CHP134-mycn3UTR vs CHP134-CTRL-celler. Välj godtyckliga faldig förändring cut-off av> 1,5 och betydelse p-värden av <0,01.
OBS: I de beskrivna analys inställningar avgörande parameter för träff specificitet är en betydande faldig förändring av luciferasaktivitet i CHP134-mycn3UTR vs CHP134-CTRL-celler. Vid behov kan man också bedöma förening toxicitet genom att utföra samtidigt en cellviabiliteten analys på sigkerat föreningar. Detta kan vara särskilt fördelaktigt om de primära hits är kontra silas i en dos-responsanalys. För en enda dos, vår erfarenhet visar ett starkt samband med minskad luciferasaktivitet med minskad cell 6 livskraft. Därför minskade luciferasaktiviteten i målceller liksom kontrollceller kan betraktas som en indikator på förening toxicitet vid den testade koncentrationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med användning av den beskrivna tillvägagångssätt, skärmad vi en 2000-föreningsbibliotek för potentiella modulatorer av post-transkriptionella kontrollmekanismer som utövas genom den 3 'UTR av MYCN genen. Figur 3 visar resultaten av den primära screeningen exemplifieras av ett enda bibliotek platta. Luciferas-signal visas som procentandel av vehikelbehandlade kontroller erhölls genom mätning av luciferasaktivitet i tredubbla plattor av CHP134-mycn3UTR celler behandlade med föreningar med en enda bibliotek platta. Som förväntat, de flesta föreningar hade ingen effekt på luciferasaktivitet såsom indikeras av värden nära baslinjen 100%. De träffar (tydliga fyrkanter) valdes sätta en tröskel på X ± 2 SD, där medelvärdet X och SD beräknas över alla analysvärden. Föreningar som minskar luciferasaktivitet under 20% (den som är märkt med asterisk) bör tas bort från övervägande som detekterade hämningen leder troligtvis från pronounced cellulär toxicitet av föreningen.
Figur 4 illustrerar några representativa exempel på data som erhållits i kontra screening av cirka 100 föreningar. Som kan bedömas från normaliserad luciferas signal i CHP134-CTRL-celler, förening W vid 2 ^ M koncentration har ingen effekt på cellviabiliteten, medan föreningen X visar viss cytotoxisk aktivitet. Båda föreningarna W och X, dock orsaka MYCN 3 'UTR specifik uppreglering av luciferasaktivitet, såsom indikeras av flerfaldsförändringen skillnad och t-test. Förening Y vid 2 ^ M koncentration verkar kompromissa livskraft CHP134 celler; i termer av specificitet är det ingen skillnad i luciferasaktivitet i CHP134-mycn3UTR och CHP134-CTRL-celler. Slutligen, är ökningen av luciferasaktivitet detekterats i den primära screeningen för förening Z som inte riktigt beroende MYCN 3 'UTR, eftersom en motsvarande uppreglering observeras i CHP134-CTRL-celler. Vi upptäckte inte någon träff som resulterar i MYCN 3 'UTR-specifik nedreglering av luciferasaktivitet.
Figur 1:. Komponenter i den cellbaserade reportergenanalys visar Den övre panelen schematiskt diagram av MYCN genen. Den MYCN avskrift (NM_005378.4) dras till skalan. Boxar representerar exoner med skuggade områden motsvarande de CDS, linjerna representerar introner. Reportern konstruerar Luc-CTRL och Luc-3UTR-mycn är schematiskt nedan. CMV, cytomegalovirus; SV40, apvirus 40. CHP134 neuroblastomcellinjen valdes för att tillverka stabilt transfekterade celler genom att använda de ovan nämnda plasmider. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Disposition av den primära screeningen Varje enskild föreningsbibliotek plåt användes för att behandla trefaldiga plattor av CHP134-mycn3UTR celler. Luciferasaktivitet mättes efter 24 h av behandling.
Figur 3: Plate-väl punktdiagram av normaliserade värden som representerar en enda 96-brunnar från den primära screeningen CHP134-mycn3UTR celler som växer i 96-brunnars plattor behandlades med biblioteksföreningar vid 2 ^ M koncentration.. Varje punkt motsvarar luciferasaktivitet detekterats för en enda förening efter 24 timmar av behandling och normaliserade till medelvärdet luciferas signalen detekteras i vehikelbehandlade kontroller inom samma platta. Datapunkter visas efter föreningar position inom en 96-brunnsplatta (10 föreningar i kolumnerna 2-10 från rå A tillG). Medelvärde över tre replikat ± SD visas. De träffar visas som tydliga rutor. En träff som kännetecknas av minskad luciferasaktivitet under 20% är märkt med asterisk.
Figur 4:. Representativa exempel på kontra screening CHP134-mycn3UTR och CHP134-CTRL stabila celler behandlades parallellt med föreningar förväg vald i den första undersökningen. Luciferasanalysen utfördes efter 24 timmar av behandling vid 2 ^ M koncentration. Grafen visar representativa resultat för fyra utvalda föreningar betecknade W, X, Y och Z. Varje stapel motsvarar luciferasaktivitet detekterats för en enda förening och normaliserades till medelvärdet luciferas signalen av vehikelbehandlade kontroller i de angivna stabila celler. Faldig förändring skillnad och statistisk signifikans i två-tailed t-test visas, ** p <0,01,*** P <0,001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50 μl Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200 μl Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1x, w/o Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200 mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
References
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (1), 220 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3’ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).
- Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3’ UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene. Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).
- Cheung, N. -K. V., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Herbst, J., et al. Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies. Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).
- van Olst, E. S. iebring-, et al. Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening. J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Hitti, E., et al. A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control. RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).
- Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. Systematic identification of regulatory elements in conserved 3’ UTRs of human transcripts. Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J. Vis. Exp. (87), (2014).
- Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. The 3’ untranslated region of messenger RNA: A molecular “hotspot” for pathology. Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).
- Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention. J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).
- Pascale, A., Govoni, S. The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins. Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).
- Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3’ untranslated regions contribute to the development of human disorders. Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).
- Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. Mining the GEMS--a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms. Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).
- Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. Targeting post-transcriptional control for drug discovery. RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).
