Summary
توضح هذه المخطوطة بروتوكول لتنمو في الشبكات وحدات المختبر يتكون من محصورة مكانيا، وظيفيا المترابطة الدوائر العصبية. ويستخدم قناع البوليمرية لنمط طبقة البروتين لتعزيز التصاق الخلايا على الركيزة زراعة. الخلايا العصبية مطلي تنمو على المناطق المغلفة إقامة صلات عفوية وعرض النشاط الكهربية.
Abstract
يعمل الدماغ من خلال تفعيل التنسيق والتواصل الديناميكي المجالس العصبية. سؤال مفتوح الرئيسي هو كيف ذخيرة واسعة من الزخارف الديناميكية، التي تكمن وراء وظائف المخ الأكثر تنوعا، يمكن أن يخرج من منظمة الطوبوغرافية وحدات ثابتة من الدوائر الكهربائية في المخ. مقارنة في الدراسات المجراة الدوائر العصبية التي تمثل الصعوبات التجريبية الجوهرية، والأعمال التحضيرية في المختبر توفر إمكانية أكبر بكثير للتلاعب وتحقيق خصائص الهيكلية، والديناميكية والكيميائية للأنظمة العصبية التجريبية. يصف هذا العمل منهجية تجريبية في المختبر الذي يسمح متزايد من الشبكات وحدات ألحان متميزة مكانيا، والجمعيات الخلايا العصبية المترابطة وظيفيا. بروتوكول يسمح السيطرة على ثنائية الأبعاد (2D) الهندسة المعمارية للشبكة العصبية على مستويات مختلفة من التعقيد الطوبوغرافية.
والزخرفة الشبكة المطلوبة يمكن أن يكونحقق كل من زلات غطاء العادية والركيزة جزءا لا يتجزأ من صفائف الكهربائي الصغير. وتنقش الهياكل مجهريا على رقاقة السيليكون وتستخدم لخلق الإستنسل البوليمرية حيويا، التي تتضمن الميزات السلبية للبنية الشبكة المطلوبة. يتم وضع الإستنسل على ركائز زراعة أثناء إجراء طلاء السطح بطبقة الجزيئية لتعزيز التصاق الخلوية. بعد إزالة الإستنسل، ومطلي الخلايا العصبية، وأنها توجيهها تلقائيا إلى المناطق المغلفة. من خلال خفض المسافة بين المقصورة، فمن الممكن الحصول على الدوائر العصبية إما معزولة أو مترابطة. لتعزيز بقاء الخلية، الخلايا شارك في تربيتها مع شبكة الخلايا العصبية دعم الذي يقع في المحيط الخارجي للصحن الثقافة. وتعرض التسجيلات الكهربية والضوئية لنشاط الشبكات وحدات الحصول على التوالي باستخدام الركيزة جزءا لا يتجزأ من صفائف الكهربائي الصغير والتصوير الكالسيوم. بينما تظهر كل وحدة مذكورة عفوياتزامن العالمية aneous، وينظم وقوع المشتركة بين وحدة المزامنة كثافة اتصال بين الدوائر.
Introduction
الأدلة التجريبية والنظرية تدعم إمكانية أن الدماغ يعمل من خلال تفعيل منسقة المجالس خلية 1-5، والتي يمكن اعتبارها وحدات وظيفية الديناميكية التي تتفاعل بشكل عابر مع بعضها البعض لتشكيل والكامنة الدول الدماغ المختلفة. نمطية وظيفي هو أيضا يعتمد على والمرتبطة بتنظيم وحدات الهيكلية للدوائر الدماغ 6،7. كيف ظيفة وبنية الدوائر الكهربائية في المخ تشكيل كل منهما الآخر لا يزال واحدا من الأسئلة المفتوحة الرئيسية في علم الأعصاب. لتوفير فهم أعمق لهذا السؤال، فمن المهم تحديد الأطر التجريبية الأمثل حيث أنه من الممكن أن تتناول، جزئيا على الأقل، وتلك القضايا. منذ تسيطر التلاعب في ديناميات المكانية والزمانية للشبكات العصبية في التجارب في الجسم الحي هو التحدي، وتطوير شبكات الخلايا العصبية في المختبر نماذج ذات اهتمام بسبب سهولة لجنة التنسيق الإدارية الخاصةessibility، والرصد، والتلاعب والنمذجة 8،9. في السنوات الأخيرة، قد سمحت في تقنيات المختبر بدعم من أساليب الزخرفة الركيزة المتقدمة للحث على الشبكات العصبية لتطوير مجموعة من الهياكل وحدات محددة مسبقا 3 ودراسة الخصائص الفنية للشبكات مع طبولوجيا فرض 10. على وجه الخصوص، استخدمت أساليب مؤخرا لتنظيم شبكات من خلال فرض القيود المادية 4،11. في الواقع، لدراسة العلاقة بين البنية والوظيفة في الشبكات العصبية وتوفير تمثيل مبسط لكن معقول من التفاعل المجالس العصبية، يجب في المختبر النظم أن توفر مترابطة الخلايا العصبية السكان الفرعية. درس على نطاق واسع 2D الثقافات العصبية متجانسة لا تفرض أي قيود مكانية على التنظيم الذاتي الأسلاك الناشئة من الدوائر. لذلك نهجا الممكن تشكيل المجالس خلية مترابطة بشكل مصطنع هو موقف مختلف السكان العصبية في الخلافمجالات متميزة ially. المسافة بين هذه المناطق لا يمنع الاتصالات بين المجالس. هذا النهج، مع ضمان سيطرة كبيرة على تعقيد الشبكة، وقد تبين لتوفير ذخيرة غنية من النماذج تزامن 6،7،12.
من أجل تسهيل زراعة استنساخه المجالس العصبية وحدات، وبروتوكول لتجميع التنظيم الذاتي للشبكات في مجموعات الخلايا العصبية التي ربطها محاور عصبية والتشعبات يرد وصفها. تم إنشاء هيكل البوليمرية لالحبس المادي للثقافات العصبية من (PDMS) polydimtheylsiloxane. PDMS هو المطاط الصناعي تستخدم على نطاق واسع للتطبيقات الطبية الحيوية نظرا لفي توافق مع الحياة، والشفافية، والنفاذية للغازات 13. تم إعداد PDMS واستبعادها من SU8 مجهريا 2075 14،15 الهياكل من قبل PDMS السائلة إلى "سيد" كما هو موضح سابقا في جاكمان وآخرون طلاء زيادة ونقصان. 16 Tحقق نمط وتتكون من وحدات مترابطة من حجم مختلف الشبكات العصبية، وأنها قد تم الحصول عليها بنجاح على كلا coverslips ومايكرو الكهربائي صالحة (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) 17-20. كثافة الاتصالات بين وحدات يمكن أن تتغير ملامح تزامن الشبكة، من شبكة متزامنة تماما، نموذجية من الثقافات موحدة، إلى دول عابرة التزامن بين الوحدات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تم إجراء وفقا للمعايير المعاهد الوطنية للصحة للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة من قبل لجنة جامعة تل أبيب رعاية الحيوان واستخدام (رقم رخصة - L-14-019).
1. إعداد أدوات وPDMS
- إعداد الرقاقة (جدول المواد، أو تأمر رقاقة من مختبر التصنيع الدقيق)، مشرط، وزوج من ملاقط - ليست هناك حاجة التعقيم.
- جعل بولي-D-ليسين (PDL) الحل وفقا للشروط التالية: 4 ملغ / مل في 0.1 M عازلة بورات، ودرجة الحموضة 8، وتخزينها في -20 ° C.
- إعداد الإستنسل PDMS وفقا للإجراء التالي:
- إعداد ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS، سيليكون المطاط الصناعي) عن طريق خلط معا القاعدة وكيل المعالجة مع نسبة 10: 1، ثم تحريك المواد 2 لحوالي 5 دقائق.
- ولت مكان في فراغ الغرفة مرتين لمدة 15 دقيقة في كل مرة والتحقق من الفقاعات.
- متىوPDMS على استعداد، وإعداد تدور المغطي: المقابض النيتروجين مفتوحة للسماح باستخدام الغاز، ووضع رقاقة السيليكون (الشكل 1A) على الدوار، واستخدام الفراغ لمنعها من التحرك.
- صب PDMS على رقاقة وتفعيل الدوار لمدة 1 دقيقة في 1،000 دورة في الدقيقة (يخلق ما يقرب من 100 ميكرون الارتفاع).
- وضع رقاقة على طبق ساخن عند 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- عندما تصلب PDMS، الخطوط العريضة الحدود الاستنسل مع PDMS، وذلك باستخدام ماصة باستير. وضع رقاقة على طبق ساخن عند 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- عندما تصلب حدود PDMS، واستخدام مشرط لقطع الإستنسل وفقا للحدود وتقشر الاستنسل السيليكون من رقاقة (أ PDMS المربعة التي تحتوي على نمط واحد).
2. طبق بتري وتغطية إعداد زلة
- إعداد 23 ملم زلات مربع الغطاء الزجاجي وتنظيفها وفقا للترتيب التالي:
- يغسل بالماء المقطر، و 70٪ من الإيثانول، والأسيتون.
- يغسل مع الأيزوبروبانول والجافة سريع مع النيتروجين.
- وضع نمط PDMS الإستنسل على ساترة، ثم اضغط بلطف للتحقق من أنها ترتبط بقوة إلى السطح الزجاجي. ضع في فراغ الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- إسقاط 1 مل من PDL على الاستنسل. إدراج ساترة في فراغ الغرفة مرتين لمدة 20 دقيقة في كل مرة، وترك PDL O / N لتجف.
- إعداد طبق بيتري لإنشاء شبكة خلية دعم:
- تغطية سطح الطبق (3.5 سم) مع 1 مل من PDL لمدة 2 ساعة في RT. إزالة انخفاض PDL باستخدام ماصة.
- يغسل بالماء المقطر وتترك لتجف. وضع قطرة صغيرة جدا من الشحوم سيليكون على كل ركن من أركان ساترة.
- ضع ساترة في وسط طبق بيتري (أي PDMS يجب أن تواجه متابعة) واضغط برفق للتحقق من المرفق.
- بلطف إزالة PDMS من ساترة باستخدام الملقط. لتعقيم، فضح لإضاءة الأشعة فوق البنفسجية لمدة 7 دقائق.
- MEA نظيفة في هذا النظام (جدول المواد):
- يغسل بالماء تحت الصنبور ويصوتن في المركز، والمنظفات الأنزيمية 3 مرات.
- يصوتن في الماء المقطر 3 مرات.
- يغسل بالماء المقطر (في غطاء محرك السيارة، 1،000 ميكرولتر طرف) لمدة 3 مرات ومكان تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.
- دعم إعداد الشبكة:
- إعداد القالب شبكة دعم تصميم.
- صب PDMS في لوحة 12-جيدا (22 مم).
- عندما يتم تصلب PDMS إخراج القالب واستخدام مشرط، وقطع حفرة في الوسط لإنشاء شكل حلقة.
- وضع قالب شبكة دعم مصممة على وسط MEA (الشكل 2A)، وتغطي بقية السطح مع PDL لمدة 2 ساعة على RT.
- إزالة PDL باستخدام ماصة ويغسل بالماء المقطر.
- إزالة القالب وتترك لتجف (الشكل 2A). </ لى>
- إعداد القالب شبكة دعم تصميم.
- محاذاة الاستنسل لMEA بالطريقة التالية:
- ضع الاستنسل على مناور الصغير المعينة. استخدام مجهر مقلوب لمحاذاة بدقة هيكل منقوشة على الأقطاب، وخفض الاستنسل حتى يتم وضعها على سطح MEA (الشكل 2B).
ملاحظة: الاتصال مع MEA تنظيفها بشكل جيد ويوفر التصاق تنافسية بين PDMS وMEA نفسها. - رفع مياداة مجهرية وإذا لزم الأمر، استخدام ملاقط لتطبيق كمية صغيرة من الضغط فوق PDMS لمنع ذلك فصل من MEA.
- اضغط بلطف الاستنسل على سطح MEA، واستخدام المجهر للتحقق من ويرد عليه بقوة، والانحياز بشكل جيد. (الشكل 2C-D).
- ضع الاستنسل على مناور الصغير المعينة. استخدام مجهر مقلوب لمحاذاة بدقة هيكل منقوشة على الأقطاب، وخفض الاستنسل حتى يتم وضعها على سطح MEA (الشكل 2B).
- وضع MEA في فراغ الغرفة لمدة 15 دقيقة. وضع قطرة 1 مل من PDL على الاستنسل.
- إدراجها في فراغ الغرفة 2 مرات لمدة 20 دقيقة لكل منهما. ترك PDL لتجف O / N في الحاضنة.
- قبل الطلاء، وإزالة PDMS الإستنسل من الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف ويغسل باستخدام العقيمة ثالعاطر. وضع تحت إضاءة الأشعة فوق البنفسجية لمدة 7 دقائق.
4. تشريح والثقافة
- إعداد الثقافات كما هو موضح في هرتسوغ وآخرون 2011 21 من سورة.
5. تصفيح
- حساب عدد الخلايا اللازمة للطلاء، وذلك باستخدام عدادة الكريات (كثافة الأمثل وفقا لحجم الدائرة كما نوقش في النتيجة).
- تأكد من غرفة الفرز (عدادة الكريات) هو نظيفة ومكان زلة تغطية على ذلك (استخدام الكحول لتنظيف).
- تمييع 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في 190 ميكرولتر من الطلاء المتوسطة (تخفيف 1:20).
- تحميل 10 ميكرولتر من الخلايا المخفف على حافة غرفة العد وببطء ماصة الخلايا من السماح للغرفة لملء نفسها.
- باستخدام مجهر مقلوب، تصور الشبكة haemocytometer. تحديد عدد الخلايا في الغرفة عن طريق العد المباشر (يجب أن يكون الخلايا السليمة مستدير). عدد الخلايا داخل witho مربع كبيرالتحرير أولئك الذين يعبرون الحواف.
- حساب تركيز خلايا:
إجمالي عدد خلايا / 1000 ميكرولتر = مجموع خلايا عدها × عامل تخفيف × 10 4 (منطقة عدادة الكريات).
ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كان العامل التخفيف 20 وكان مجموع الخلايا عدها 100:
100 × 20 × 10 4 = 0.1 × 10 7 خلايا / 1،000 ميكرولتر أو 1 × 10 6/100 ميكرولتر. من أجل لوحة 0.75 × 10 6 خلايا، تأخذ 75 ميكرولتر من الخلايا.
- أخذ عدد من الخلايا اللازمة للطلاء في الشرق الأوسط وأفريقيا واحد أو طبق بتري، resuspend الخلايا لمنع التجميع، ولوحة منها في المركز، على رأس منطقة patternate (إذا لزم الأمر، فمن الممكن لتمييع الخلايا في المتوسط) . لMEA، وضع قطرة 100 ميكرولتر في الوسط. لتغطية زلة، وضع قطرة 1،000 ميكرولتر في الوسط.
- احتضان الخلايا مطلي عند 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة. إضافة المتوسطة تصفيح على الخلايا مطلي، وتصل إلى 1مل لكل MEA و 2 مل لكل زلة تغطية.
- تبقي على 37 درجة مئوية، وكل 4 أيام، وتمييع مع المتوسط نمو جديدة المخصب مع 0.5 القلم بكتيريا، 2٪ B-27 و 0.75٪ glutamax.
- من 6/7 DIV، بعد رؤية الروابط بين الجزر، وتمييع المتوسطة مع 10 ميكرولتر / مل FUDR (25 ملغ deoxyuridine + 62.5 ملغ يوريدين في 12.5 مل MEM (الحد الأدنى الضروري المتوسطة النسر)) أو أي عامل مضاد للالإنقسامية أخرى لمنع الدبقية فرط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم استخدام SU8-2075 العفن على رقاقة السيليكون مع سمك سمة من سمات ما يقرب من 100 ميكرون لتشكيل PDMS. وتألفت لنمط المربعات من عدة أبعاد، مع طول الجانب والمسافة تتراوح بين 200 و 700 ميكرون (الشكل 1B). وقد تم اختيار حجم مربع لتتناسب مع مجال الرؤية من 10X (للجزر بطول الجانب <800 ميكرون) وهدف 20X (للجزر بطول الجانب <400 ميكرون). ثلاث معلمات، وهي الخلية كثافة الطلاء، وبعد المسافة بين الدوائر، وحجم الدوائر "وحاسم للحصول على الطبقات الوحيدة أو الدوائر تتجمع وكذلك لفرض وشكل التواصل فيما بينها. ومع ذلك، هذه المعايير ليست مستقلة منذ نظرا مسافة ثابتة بين اثنين من الدوائر، واحتمال أنها عفوية إقامة اتصال مع زيادة حجم الدوائر ". في المثال مناقشتها في هذا العمل، لوحدات صغيرة من الخلايا العصبية ~ 300 × 300 ميكرون، اتصالاتأنشئت عندما كانت المسافة يست أكبر من ~ 300-400 ميكرون، في حين أن وحدات كبيرة من الخلايا العصبية ~ 700 X 700 ميكرون، تم إنشاء وصلات عندما كانت المسافة أقل من ~ 700 ميكرون. بشكل عام، من خلال زيادة المسافة بين المربعات كان من الممكن لتغيير احتمال لإقامة ولدت عفويا بين الاتصالات فيما بين الوحدات، ويمر من وحدات مرتبطة إلى حد كبير لتلك المعزولة.
وحدات الخلايا العصبية من ~ ترد 600 × 600 ميكرون في 4 أيام في المختبر (DIV، الشكل 3A). بعد أيام قليلة في الخلايا العصبية في المختبر وتقع معظمها في المناطق المغلفة في حين أنه من غير الممكن لمراقبة العمليات والوصلات العصبية المتقدمة. على العكس من ذلك، في 14 DIV (الشكل 3B-C) الخلايا العصبية تأسيس اتصالات داخل وبين الوحدات. بينما الدوائر العصبية أكبر من ~ 600 × 600 ميكرون يمكن تنظيم الذاتي في الطبقات الوحيدة (الشكل 3A-C)، والدوائر من smalleأبعاد ص (على سبيل المثال، ~ 300 × 300 ميكرون في الشكل 3D) تميل إلى التجمع. ولذلك، من أجل الحصول على أفضل معايرة للدوائر ثنائية الأبعاد، كانت مطلية الخلايا مع كثافة مختلفة تتراوح من 0.25 X 6-1 أكتوبر × 10 6 خلايا / 23 مم زلة تغطية المرفقة في طبق بيتري 35 ملم. للدوائر أكبر من ~ 700 X 700 ميكرون وجدنا أن 0.75 × 10 6 خلايا / 23 مم زلة تغطية المرفقة في طبق بيتري 35 ملم هو كثافة الأمثل الذي يدفع تشكيل الدوائر أحادي الطبقة لا تمنع من عفوية بين الاتصال (الشكل 3C ). تم الحصول على نفس النتيجة من دائرة أحادي الطبقة في الدوائر أصغر من ~ 300 × 300 ميكرون من الطلاء 0.5 × 10 6 خلايا / 23 مم زلة تغطية المرفقة في طبق بيتري 35 ملم. بشكل عام، عند النظر في كثافة الطلاء الخلية، فمن المهم التأكيد على أن، كما نوقش سابقا 7، والخلايا العصبية والدبقية لديها الميل الفطري إلى التجمع، وحتى بعض درجة من البنودustering أمر لا مفر منه تقريبا بعد مرور بعض الوقت في الثقافة. ومع ذلك، لاحظنا أن زيادة المساحة المخصصة لشبكة دعم من شأنه أن يعزز احتمال بقاء الدوائر "وتنظيم أحادية الطبقات، وربما يرجع ذلك إلى تركيز أكبر من المواد المغذية في الفضاء خارج الخلية. في أي حال، لا بد من نهج التجربة والخطأ لتحديد أفضل كثافة الطلاء الخلية لخلق الدوائر أحادية الطبقات للتصوير الكالسيوم. كل 4 أيام من المخفف المتوسطة مع المتوسطة النمو الطازجة. من 6/7 DIV، بعد رؤية الروابط بين الجزر، / تمت إضافة مل FUDR 10 ميكرولتر لمنع فرط الدبقية.
ويبين الشكل 4 ديناميكية شبكة وحدات سجلت باستخدام التصوير الكالسيوم (يؤديها كما هو موضح في Bonifazi وآخرون 2013 8). تم الحصول على الصور الكالسيوم فلوريدا uorescence باستخدام الهدف التكبير 4X، والتي مكنت رصد نشاط الشبكة بالكامل (شملت رقمالبريد 4A). تم إجراء تحليل التصوير الكالسيوم كما هو موضح في Bonifazi وآخرون 2013 8. في الشكل 4B النقطية مؤامرة من الأحداث الكالسيوم بداية عرض النشاط العفوي وتقدم (ألوان تتوافق مع وحدات ملحوظ في الشكل 4A). تم إجراء التصوير الكالسيوم في 30 هرتز، وحجم الصورة هو 1،000 خ 1،000 بكسل.
وتزامن عاليا وحدات الأخضر والوردي كما هو مبين في مؤامرة النقطية (الشكل 4B) في اتفاق مع حزم على ربط سميكة، وربما المقابلة لعدد كبير من الاتصالات (الشكل 4A). وترتبط وحدات زرقاء وحمراء ضعيفة إلى وحدات الأخضر والوردي وبالتالي فإنها أحيانا متزامنة معها (الشكل 4B). شريط فيديو للتسجيل متاح عبر الإنترنت (فيلم M1).
يتم عرض صورة من شبكة وحدات نمت على MEA في 21 DIV في الشكل 5A. أناالدرجة n للحصول على أفضل معايرة للدوائر ثنائية الأبعاد، ونحن مطلي الخلايا القشرية مع كثافة مختلفة تتراوح من 250 × 10 3-500 × 10 3 خلية / في الشرق الأوسط وأفريقيا. 250 × 10 3 خلية / في الشرق الأوسط وأفريقيا (30 ملم حلقة) أعطى نتائج أفضل من حيث تشكيل الدوائر أحادي الطبقة، في حين لا تمنع من عفوية بين الاتصال. وقد تحققت الشبكات العصبية مرة واحدة على نمط الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف الركيزة (الشكل 5A)، وقد تم رصد النشاط الكهربية باستخدام نظام تجاري المستخدمة لاكتساب وتسجيل الإشارات الكهربية. تم الكشف عن النشاط العفوي من الثقافات باستخدام التوقيت الدقيق كشف سبايك (PTSD) خوارزمية 22.
ويبين الشكل 5B مؤامرة النقطية الموافق 5 دقائق من النشاط العفوي (فقط الأقطاب الكهربائية النشطة مرئية)، ملونة مشفرة وفقا لعدد العنقودية. من خلال النظر في هذه المؤامرات، فمن الممكن لجعل التقييمات النوعيةلنشاط مجموعات واحدة وللشبكة كاملة في نفس الوقت. على وجه الخصوص، فمن الممكن أن نلاحظ تزامن قوي بين الأنشطة المسجلة ضمن كل مجموعة. شريط فيديو لتسجيل تمثيلي من ثقافات نقوش على MEA متاح عبر الإنترنت (فيلم M2).
الشكل 1. رقاقة السيليكون. (A) ورقاقة السيليكون (~ 4 بوصة قطر) تستخدم لالعفن الإستنسل PDMS. وتمثل الهياكل SU8 مختلفة شبكات وحدات مختلفة. (ب) تصميم ميزة الممثل تنفيذها على رقاقة السيليكون لبناء شبكات وحدات. كل بقعة خضراء تحدد بنية دعامة SU8 وبالتالي المنطقة لوحدة واحدة. التصاميم داخل مستطيل أسود متقطع تتوافق مع ثلاثة الإستنسل المختلفة التي يمكن استخدامها على القياسية coverslips الثقافة مربع من 23 ملم الجانب ليونGTH. في كل الاستنسل، وتمثل علامة النجمة أحد المناطق الكلي للشبكة الداعمة. اعتمادا على المسافة بين البقع، على حلبة حجم محدود أو وحدات قد تكون قادرة على إنشاء الوصلات العصبية عفوية فيما بينهم. وقد تم اختيار تصميم الميزات لخلق مختلف حجم وحدة وبين وحدة المسافة لتحقيق الدوائر العصبية معزولة أو المترابطة التي يمكن أن تناسب مجال الرؤية في مختلف تكبير موضوعية (4X، 10X 20X و، ومجال الرؤية لكل التكبير ممثلة في الساحات الحمراء). وقد صممت هذه الميزات من خارج المستطيل الأسود متقطع لتناسب الاستخدام المتزامن لMEA والكالسيوم التصوير. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. هياكل PDMS ترسب على MEA. (A) PDMS العفن مع شكل حلقة (ملحوظ مع السهم الأحمر) التي شنت على MEA. يتم استخدام قالب لمعطف المنطقة متجهة إلى الشبكة العصبية دعم وتقع في محيط منطقة زراعة (وهذا ما يحد من الحلبة التي شنت على MEA وتميزت السهم الأخضر). (ب) محاذاة استنسل PDMS على MEA باستخدام مناور الجزئي. (C) PDMS الاستنسل تترسب على MEA على بعد المحاذاة. (D) صورة من استنسل PDMS على MEA باستخدام التكبير 10x (المسافة بين القطب هو 500 ميكرون). ومن الممكن أن نلاحظ الثقوب على الإستنسل في المراسلات من الأقطاب الكهربائية. سيتم إيداع طبقة لاصقة لصالح التصاق الخلوية فقط على المناطق المفتوحة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
جنرال الكتريك = "دائما"> 
الشكل 3. الشبكات العصبية وحدات في DIV مختلفة. صورة حقل مشرق من وحدات القشرية من ~ 600 × 600μm (A) بعد 4 DIV و (B) بعد 14 DIV. (C) لاحظ الترابط عفوية بين الدوائر بعد 14 DIV. تم مطلي الخلايا في كثافة الخلية المثلى للدوائر كبيرة لتنظيم إلى الطبقات الوحيدة، أي 750 × 10 3 خلية / 23 مم زلة تغطية المرفقة في طبق بيتري 35 ملم. (D) استخدام ميزات PDMS من نصف حجم وتركيز خلية نفسه، الدوائر العصبية نظمت في الهياكل متفاوت المسافات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
highres.jpg "العرض =" 700 "/>
الشكل 4. التصوير الكالسيوم من الشبكات وحدات. (A) خلايا القشرية (18 DIV) محملة مؤشر الكالسيوم OGB. ألوان مختلفة علامة وحدات مختلفة. مجال الرؤية هو 2 × 2 مم. (B) مؤامرة النقطية من النشاط العفوي. ألوان مختلفة تتوافق مع الخلايا داخل وحدات مختلفة كما هو مبين في لوحة A. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. MEA تسجيل شبكات وحدات. (A) شبكة كاملة (العصبونات القشرية، 21 DIV) تتكون من 3 الدوائر متميزة نمت على MEA 4Q. الدوائر العصبية هي بعيدة ~ 600 ميكرون مترابطة مع بعضها البعض. (B) النقطية مؤامرة عرض 5 دقائق من إلكترونيات العفويتسجيل النشاط ophysiological. C1، C2 و C3 تتوافق، على التوالي، إلى اليسار العلوي، وانخفاض الحق والأنشطة الكتلة اليسرى السفلى، وسلط الضوء في ألوان مختلفة. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوصف بروتوكول لتنمو 2D الشبكات العصبية في المختبر وحدات تتألف من الدوائر مترابطة وظيفيا. ويستند هذا الإجراء على الزخرفة طبقة لاصقة الخلوية. ويتحقق الزخرفة مع PDMS الإستنسل استنساخ ميزة سلبية للبنية الشبكة المطلوبة. الإستنسل PDMS تحدد المناطق التي يتم فيها إيداع طبقة لاصقة الخلوية. مرة واحدة ومطلي الخلايا، التي تجمع بشكل عفوي إلى الجزر المغلفة وتنظيم الذات في دوائر مترابطة النشطة. وقدم تسجيلات لشبكات وحدات وظيفية المسجلة باستخدام الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف والتصوير الكالسيوم.
تم تعديل بروتوكول المعروضة حسب الأصول مقارنة الإجراء المتبع في البداية. أولا، كان مشاكل مع محاذاة PDMS الإستنسل "لمعالجتها. منذ المحاذاة لابد من تحقيقها في المحاولة الأولى (مرة واحدة الاستنسل لمست السطح، فمن غير المستحسن للانتقال ذلك)، وقد تم التغلب على هذه المسألةمن خلال التخلي عن الإجراء اليدوي واختياره لأسلوب الجديد الذي يتكون من استخدام مناور الجزئي لترسب الاستنسل الدقيق على منطقة تسجيل MEA. تتكون قضية أخرى كان لا بد من معالجتها في منع انخفاض PDL من المرور تحت الاستنسل الانحياز (وإلا فإن تصميم منقوشة تعذر الحصول). للقيام بذلك، مرة واحدة وقد تم محاذاة الاستنسل وقبل وضع قطرة PDL على ذلك، فإن الجهاز يعتبر (MEA أو ساترة) لابد من تركها في فراغ الغرفة لفترة مناسبة من الوقت وبالتالي توفير التعلق جيدة منه على السطح. والأمر نفسه تم القيام به مرة واحدة يتم وضع قطرة PDL على الاستنسل من أجل القضاء على فقاعات الهواء التي تشكل بين الجهاز وانخفاض نفسها وبالتالي السماح للPDL للحصول على اتصال مع السطح.
وتتمثل الخطوات الحاسمة للبروتوكول وصفها: أ) مرحلة طلاء تدور التي ينبغي أن يضمن للحصول على "النسخ المتماثلة مفتوحة" أو، على الأقل، sufficiرقيقة مستديم على الهياكل SU8 التي يمكن إزالتها بسهولة باستخدام الملقط؛ الثاني) والمعالجة السطحية زراعة (تغطية زلة أو MEA)؛ الثالث) موضع الإستنسل PDMS على ذلك؛ الرابع) مرحلة الطلاء لأن هناك حالات والتي، إذا قناع PDMS لا ختم صحيح ضد الركيزة التي يتم وضع، فإنه يمكن أن يحدث أن البروتين لاصقة يمر تحت قناع مما يؤدي إلى تقويض والزخرفة. لذا، فإن عملية التنظيف من زلات غطاء أو الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف ذات أهمية قصوى، وكذلك المواءمة بين الاستنسل PDMS. العروض المناسبة من هاتين الخطوتين ضمان أفضل النتائج الزخرفة.
القيود المفروضة على هذه التقنية لها أيضا أن تفعل مع كل من الكهربية واكتساب التصوير الكالسيوم. في الحالة الأولى، وهو القرار المكانية منخفضة جدا (4 - يتم تضمين 8 الأقطاب في كل وحدة) موجود بسبب كل من أبعاد دائرة واحدة وdistanc بين القطبه. في الحالة الثانية، ويتكون من خطر في عدم العثور على الكثافة الخلوية المثلى التي تسمح بالحصول على طبقة الخلوية ثنائية الأبعاد، وبالتالي منع اقتناء واحد قرار الخلية.
هذه الاستراتيجية، التي تتطلب التحسين دقيق للطلاء، والتجمع، وإجراءات التعقيم وإنشاء نظام المحاذاة الدقيقة العرف، وقدم لنا بعض المزايا الرئيسية فيما يتعلق بالمصنفات عنها سابقا (على سبيل المثال، والبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل من خلايانا، أي ما يصل إلى 8 أسابيع في المختبر). على وجه التحديد، أنها قدمت لنا مع الحبس أكثر استقرارا وموثوقية على المدى الطويل 24 فيما يتعلق استراتيجيات تقوم على الزخرفة الكيميائية 23-28.
يعتمد الإجراء الموضح على خلايا الطلاء القشرية على وحدات PDL المغلفة، والذي يؤكد التنظيم الذاتي للشبكات في التجميعات العصبية التي ربطها محاور عصبية والتشعبات حزم. للسماح التصوير الكالسيوم واسعة المجال لتدخل المرمى وحداتيعمل مع قرار خلية واحدة، فمن الضروري أن نظام الخلايا العصبية ينظم في طبقة 2D. ولذا فمن الأهمية بمكان لتحسين كثافة الخلايا مطلي وذلك لتجنب الكثافة العالية، مجموعات الخلوية أو في غيرها من الوحدات منخفضة الكثافة القصوى التي تقلل المشتركة بين وحدة احتمال الاتصال.
على الرغم من أن الشبكات العصبية-الدبقية في الثقافة تفقد المنظمة في الجسم الحي على الهيكلية، وبشكل عفوي تنظيم الذاتي في الدوائر الوظيفية الفعالة التي تقدم إمكانية لإجراء دراسات تحت ظروف تجريبية تسيطر عليها بشكل جيد. وهما الأبعاد الشبكات العصبية وحدات تتألف من الدوائر مترابطة وظيفيا وصفها في هذا البروتوكول توفر أداة قوية للتحقيق في ديناميات الاتصالات بين المجالس العصبية وقدرة الشبكات العصبية المحددة هيكليا لتوليد ذخيرة كبيرة من الزخارف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل مشروع BRIANBOW الأوروبي (FP7- يونغ المستكشفين، فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور جاكوبو Tessadori لتعليقات مفيدة على المخطوطة، وسيلفيا Chiappalone لمساعدتها في إنتاج الرسومات المستخدمة في الفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Nalgene vacuum chamber | Thermo | 5305-0609 | |
| Poly-D-lysine PDL | Sigma | P7886 | |
| Silicone grease - SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| Spin coater | Laurell - Technologies Corporation | WS-650-23 | |
| 12-well culture plate | Sigma | CLS3336 | |
| 5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
| TC02 | Multi Channel Systems | ||
| Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
| B-27 | Gibco | 17504044 | |
| glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
| Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com |
| Silicon wafer | microchem | SU8-2075 | Preparation protocol: http://www.microchem.com |
References
- Buzsaki, G. Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68, 362-385 (2010).
- Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. Modular and hierarchically modular organization of brain networks. Frontiers in Neuroscience. 4, 200 (2010).
- Levy, O., Ziv, N. E., Marom, S. Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons. European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).
- Berdondini, L., et al. A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons. Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).
- Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PloS One. 9, e107400 (2014).
- Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits. PloS One. 5, e14443 (2010).
- Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology. Frontiers in Neuroengineering. 4, 10 (2011).
- Bonifazi, P., et al. In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses. Front Neural Circuits. 7, 40 (2013).
- Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording. Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).
- Marconi, E., et al. Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology. PloS One. 7, e34648 (2012).
- Taylor, A. M., Jeon, N. L. Microfluidic and compartmentalized platforms for neurobiological research. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39, 185-200 (2011).
- Sorkin, R., et al. Compact self-wiring in cultured neural networks. J Neural Eng. 3, 95-101 (2006).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems. Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).
- Campo, A. G. C. SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography. Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).
- Liu, G. T. Y. Kan Y Fabrication of high-aspect-ratio microstructures using SU8 photoresist. Microsystem Technologies. 11, 343-346 (2005).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15, 2973-2984 (1999).
- Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 2, 19-31 (1980).
- Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro. Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).
- Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture. Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).
- Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74, 61-66 (1972).
- Herzog, N., Shein-Idelson, M., Hanein, Y. Optical validation of in vitro extra-cellular neuronal recordings. J Neural Eng. 8, 056008 (2011).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177, 241-249 (2009).
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab Chip. 9, 404-410 (2009).
- Georger, J. H., et al. Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth. Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).
- Torimitsu, K., Kawana, A. Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture. Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).
- Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks. Medical & Biological Engineering & Computing. 36, 135-141 (1998).
- Petrelli, A., et al. Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays. Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).
- Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Hippocampal networks on reliable patterned substrates. Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).
