Summary
この原稿は、空間的に閉じ込められた、機能的に相互接続された神経回路からなる生体外モジュラーネットワークで成長するプロトコルについて説明します。ポリマーマスクは、培養基材上に細胞接着を促進するために、パターンにタンパク質層が使用される。メッキニューロンは、被覆された領域自発的な接続を確立し、電気生理学的活性を示す上で成長。
Abstract
脳は協調活性化し、神経アセンブリの動的な通信を介して動作します。主要な未解決の問題は、最も多様な脳機能の基礎となる力学モチーフの膨大なレパートリーは、脳回路の固定されたトポロジカルとモジュラー組織の外に出てくることができる方法です。現在の本質的な実験的な困難神経回路のin vivoでの研究と比較して、in vitroでの製剤は、実験的なニューロン系の、構造的な力学的特性および化学的特性を操作し、プローブするための非常に大きな可能性を提供する。この作品は、空間的に異なる、機能的に相互接続された神経細胞の集合体で構成モジュラーネットワークの成長を可能インビトロ実験方法について説明します。プロトコルは、位相的複雑さの異なるレベルでの神経回路網の2次元(2D)アーキテクチャを制御することができる。
目的のネットワークパターニングが可能正規のカバースリップと基板埋め込みマイクロ電極アレイの両方を達成しました。微細加工された構造は、シリコンウエハ上にエンボス加工され、所望のネットワーク·アーキテクチャの負の特徴を含む生体適合性ポリマーステンシルを作成するために使用される。ステンシルは、細胞接着を促進するための分子層を有する表面コーティング手順中に培養基質上に配置される。ステンシルを除去した後、ニューロンは、めっきされ、それらは自然発生的に被覆された領域にリダイレクトする。インターコンパートメント距離を小さくすることにより、それが単離または相互接続されたいずれかの神経回路を得ることができる。細胞生存を促進するために、細胞を培養皿の周囲に配置され、支持神経回路網と共培養する。基板埋め込みマイクロ電極アレイおよびカルシウムイメージングを使用することによってそれぞれ得られたモジュラーネットワークの活性の電気生理学的および光学的記録が提示されている。各モジュールはSPONTを示しているがaneousグローバル同期は、モジュール間の同期の発生は回路間の接続の密度によって調節される。
Introduction
実験と理論の証拠は、脳が一過お互い、シェーピング、基礎となる別の脳の状態と対話ダイナミック機能ユニットとみなすことができるセルアセンブリ1-5、の協調活性化を介して動作している可能性を支持している。機能モジュール性にも依存すると脳回路6,7の構造的なモジュラー組織に関連付けられている。どの機能と脳回路の構成は相互に形状がまだ神経科学の主要な未解決の問題の一つである。この問題のより深い理解を提供するために、それは対処することが可能であり、少なくとも部分的に、これらの問題に最適な実験的なフレームワークを同定することが重要である。 in vivo実験で神経回路網の時空間的動態の制御された操作が困難であるので、 インビトロでの神経回路網モデルの開発は、その容易なaccのに重要な関心事であるessibility、監視、操作とモデリング8,9。近年では、高度な基板のパターニング方法でサポートされているインビトロの技術は、事前定義されたモジュラー構造体3の範囲を開発するために、神経細胞のネットワークを誘導し、課せられたトポロジ10とのネットワークの機能的特性を研究することができました。特に、本 発明の方法は、最近、物理的な制約を課すことにより4,11ネットワークを編成するために使用された。実際に、神経回路網における構造と機能との間のリンクを研究し、ニューロンアセンブリを相互作用の簡略化したが、妥当な表現を提供するために、in vitro系は、相互接続された神経細胞の亜集団を提供するべきである。広く研究されている2D均質なニューロン培養は、回路の自己組織創発配線上の任意の空間的な制約を課さない。そのため人工的に相互接続された電池アセンブリを形成するための可能なアプローチは、スパッツの異なるニューロン集団を配置することであるially異なる領域。これらの領域間の距離は、インターアセンブリの接続を防ぐことはできません。このアプローチは、ネットワークの複雑性を超えるかなりの制御を確保しつつ、同期モデル6,7,12の豊かなレパートリーを提供することが示されている。
モジュラー神経アセンブリの再現性の培養を容易にするために、軸索および樹状突起によって連結されたニューロンのクラスタにネットワークの自己組織化を組み立てるためのプロトコルを提示し、説明する。神経細胞培養の物理的閉じ込めのためのポリマー構造がpolydimtheylsiloxane(PDMS)から作成されました。 PDMSは広くガス13に、その生体適合性、透明性及び透過性のために、生物医学的用途に使用されるエラストマーである。 PDMSをスピンコートジャックらに以前に記載されている「マスター」に液体PDMSを16 Tによって2075 14,15の構造を作製し、マイクロマシンSU8から除外される彼は、異なるサイズの相互接続されたモジュールで構成され、それらが成功したカバーガラスと微小電極アレイ(MEAの)17-20の両方で得られたパターン化された神経回路網を達成しました。モジュール間の接続の密度は、モジュール間の同期の過渡状態に、均一な培養の典型的な、完全に同期化ネットワークから、ネットワーク同期の機能を変更することができます。
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Protocol
手順は、実験動物の管理と使用に関するNIHの基準に準拠して行われていたし、テルアビブ大学動物実験委員会(許可番号 - L-14から019)によって承認された。
楽器とPDMSの作製
- ウェハ( 材料の表を 、または微細加工研究室からウェハを注文)の準備、外科用メス、およびピンセット-殺菌は必要ありません。
- 以下の条件に従って、ポリ-D-リジン(PDL)溶液を作る:4ミリグラム/ 0.1 Mホウ酸緩衝液中に加え、pHを8、店舗-20℃。
- 以下の手順に従って、PDMSのステンシルを準備します。
- 10の割合と共にベースと硬化剤を混合することにより、ポリジメチルシロキサン(PDMS、シリコーンエラストマー)を調製:1、次に約5分間2物質をかき混ぜる。
- 15分間二回真空チャンバー内の各時間を置き、気泡がなくなっていることを確認します。
- いつガスの使用を可能にするオープン窒素ノブスピナー上のシリコンウェハ( 図1A)を配置し、移動するのを防ぐために真空を使用しPDMSをスピンコーターを準備する、準備ができている。
- ウエハ上にPDMSを注ぎ、1000rpmで1分間スピナーをアクティブ(約100μm、高さが作成されます)。
- 30分間、100℃のホットプレート上でウェハを置きます。
- PDMSが硬化した場合には、パスツールピペットを用いて、PDMSとステンシルの国境を概説。 30分間、100℃のホットプレート上でウェハを置きます。
- PDMSの境界線が硬化したら、国境に応じてステンシルをカットし、ウエハからシリコンステンシルを剥離し、メスを使用します(単一のパターンを含む二乗PDMS)。
2.ペトリ皿とカバースリップの準備
- 次の順序に従って、23ミリメートル角のガラスカバースリップを準備し、それらをきれいに:
- 蒸留水、70%エタノール、及びアセトンで洗浄する。
- 窒素でイソプロパノールと速乾性で洗うこと。
- カバースリップ上にパターン化されたPDMSのステンシルを置き、優しく、彼らはしっかりとガラス表面に付着していることを確認するために押してください。 15分間の真空チャンバ内に配置する。
- ステンシル上のPDLの1ミリリットルをドロップします。二回20分毎の時間のための真空チャンバー内にカバースリップを挿入し、乾燥させるために、PDL O / Nを残す。
- 支持細胞のネットワークを作成するためにペトリ皿を準備します。
- RTで2時間PDL 1mlでディッシュ(3.5センチ)の表面を覆う。ピペットを用いてPDLドロップを削除します。
- 蒸留水で洗浄し、乾燥さのまま。カバースリップの各コーナーにシリコーングリースの非常に小さなドロップを置きます。
- 添付ファイルを確認するために優しくペトリ皿( すなわち、PDMSを上にする必要があります)、Enterキーを押しの中央にカバースリップを置きます。
- 静かにピンセットを用いてカバースリップからPDMSを取り除く。殺菌のために、7分間UV照射にさらす。
- この順序( 材料の表 )のクリーンMEA:
- 濃縮酵素の洗剤でタップし、超音波処理下に水で3回洗浄する。
- 蒸留水中で超音波処理3回。
- 30分間のUV下で3回と場所のために(フード、千μlの先端に)蒸留水で洗ってください。
- ネットワークの準備をサポートする:
- 設計されたサポートネットワーク金型を準備します。
- 12ウェルプレート(直径22mm)にPDMSを注ぐ。
- PDMSが硬化されると、金型を取り出し、メスを用いて、リング状を作成するために真ん中に穴をカット。
- MEA( 図2A)の中心に設計されたサポートネットワーク型を置き、室温で2時間、PDLで表面の残りの部分をカバーしています。
- ピペットを用いてPDLを削除し、蒸留水で洗浄する。
- 金型を外し、( 図2A)を乾燥させるために残す。</ LI>
- 設計されたサポートネットワーク金型を準備します。
- 以下の方法でMEAにステンシルを揃える:
- 指定されたマイクロマニピュレータにステンシルを置きます。正確に電極にパターン化された構造を合わせ、そしてそれは、MEA面( 図2B)上に置かれるまで、ステンシルを下げるために倒立顕微鏡を使用してください。
注:よく洗浄MEAとの接触は、PDMSとMEA自体の間で競争力のある接着性を提供します。 - マイクロマニピュレーターを持ち上げ、必要に応じて、それはMEAから取り外し防ぐために、PDMSの上に少量の圧力を適用するためにピンセットを使用しています。
- 静かにMEA表面にステンシルを押して、それがしっかりと取り付けられており、十分に整列されていることを確認するために顕微鏡を使用しています。 ( 図2C、D)。
- 指定されたマイクロマニピュレータにステンシルを置きます。正確に電極にパターン化された構造を合わせ、そしてそれは、MEA面( 図2B)上に置かれるまで、ステンシルを下げるために倒立顕微鏡を使用してください。
- 15分間の真空チャンバ内にMEAを配置する。ステンシル上のPDLの1ミリリットル降下を置く。
- 真空チャンバ内に20分間ずつ2回を挿入します。インキュベーター内でO / Nを乾燥させるために、PDLのままにしておきます。
- メッキ前に、多国間環境協定からPDMSのステンシルを削除し、wは、滅菌使用して洗う試合開始。 7分間UV照明の下に配置します。
4.解剖と文化
- ヘルツォークら 2011 21で説明したように文化を準備します。
5.めっき
- (結果で述べたように、回路の大きさに応じて最適な濃度)を、血球計数器を用いて、めっきに必要な細胞の数を計算する。
- (きれいにアルコールを使用)、計数室(血球計)がクリーンであることを確認し、その上にカバースリップを配置。
- 培地(希釈1:20)メッキの190μlの細胞懸濁液10μlを希釈する。
- 負荷希釈した細胞の10μlの計数チャンバーの端の上にゆっくりとチャンバーがそれ自体を充填することができた細胞をピペット。
- 倒立顕微鏡を用いて、血球計算グリッドを視覚化。 (健康な細胞がラウンドであるべき)直接計数によってチャンバ内のセルの数を決定します。大きな正方形コーティングしていない内のセルを数えるエッジを横切るものをUT。
- 細胞の濃度を計算する。
細胞/ 1000 10 4×希釈係数×カウントμL=総細胞(血球計の面積)の合計数。
注:例えば、希釈倍率が20であり、計数した全細胞は100であった場合。
100×20×10 4 = 0.1×10 7細胞/ 1,000μlの1×10 6 /100μlの。 0.75×10 6細胞をプレーするためには、細胞外に75μlのを取る。
- 単一のMEAまたはペトリ皿当たりめっきに必要な細胞の数を取る凝集を防止するために細胞を再懸濁し、そしてpatternate領域の上に、中央にそれらをプレート(必要であれば、それは培地で細胞を希釈することが可能である) 。 MEAの場合、途中で100μlの低下を置く。カバースリップの場合は、途中で千μlの低下を置く。
- 40分間37℃で平板培養した細胞をインキュベートします。 1まで、播種した細胞をプレーティング培地を追加MEAあたりミリリットル、カバースリップあたり2ミリリットル。
- 37℃で維持し、4日ごとに、0.5ペニシリン - ストレプトマイシン、2%B-27及び0.75%グルタマックスに富む新鮮な増殖培地で希釈する。
- DIV 6/7からは、島々の間の接続を見た後、10μL/ mlのFUDR(25 mgのデオキシウリジン+ 62.5 mgの12.5ミリリットルMEM(最小必須培地イーグル)におけるウリジン)またはグリアを防ぐために、他の抗有糸分裂剤を含む培地を希釈異常増殖。
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Representative Results
約100μmの特徴厚さを有するシリコンウェハ上SU8-2075モールドはPDMSを成形するために使用した。パターンは、辺長との距離は200との間に700ミクロン( 図1B)を変化させて、いくつかの寸法の正方形で構成された。正方形のサイズは(辺の長さ<800ミクロンとの島々のための)10Xのと(辺の長さ<400ミクロンとの島々のための)20Xの目的の視野に合うように選ばれました。三つのパラメータ、すなわち、細胞播種密度、回路間の距離が、回路は「サイズが単層またはクラスタ化された回路を取得するだけでなく、その接続性を課すと整形するための決定要因である。しかしながら、これらのパラメータは、それらが自然に回路」サイズとの接続の増加を確立する確率、2つの回路間の固定距離を考えると、以降独立していない。 〜300×300μmの小さなニューロンのモジュール、接続のために、この作品で説明した例では、距離は〜300より大きくはなかったときに確立された - 400μmの間に〜700の大ニューロンのモジュール用X 700程度、距離は〜700μmのより小さかったとき、接続が確立された。一般的には、正方形の間の距離を増加させることによって、それは、単離されたものに非常に接続されたモジュールから渡し、モジュール間の自然に生成された相互接続を確立する確率を変更することが可能であった。
〜600×600程度をin vitroで 4日目に示されているのニューロンモジュール(DIV; 図3A)。 in vitroで神経細胞の数日は主に被覆された領域内に配置された後、それは、先進神経突起との接続を観察することは不可能であるが。逆に、14 DIV( 図3B-C)でニューロンがモジュール内および間の接続を確立します。 〜600×600程度の大きな神経回路は、( 図3A-C)、回路smalleの単層に自己組織化することもできますがR寸法( 図3Dにおいて例えば、〜300×300μm)は、クラスタに傾向があった。したがって、二次元の回路のための最良の較正を得るために、細胞を35mmのペトリ皿に付着した0.25×10 6細胞/ 23 6〜1×10 mmのカバースリップの間を変動する異なる密度でプレーティングした。 〜の大きな回路700のx700μmのために我々を35mmペトリ皿に付着した0.75×10 6細胞/ 23 mmのカバースリップが自発的相互接続( 図3Cを防止しない単層回路の形成を誘導する最適な濃度であることがわかっ)。単層回路の同じ結果を35mmペトリ皿に付着した0.5×10 6細胞/ 23 mmのカバースリップをめっきすることによってxは300ミクロン〜300の小さい回路で得られた。一般に、細胞播種密度を考慮した場合、以前に7を説明するように、それは、それを強調することが重要であり、ニューロンおよびグリア細胞は、クラスタに対する自然の傾向があるので、ある程度のclusteringは、培養中のいくつかの時間後にはほぼ避けられない。しかし、我々はサポートするネットワーク宛ての面積を大きくすると、おそらく、細胞外空間での栄養素のより大きな濃度などにより、回路の生存とその単層組織の確率を高めるであろうことを観察した。いずれの場合においても、試行錯誤のアプローチは、カルシウムイメージングのための単層回路を生成するために最適な細胞播種密度を特定するために必要とされる。 4日ごとに培地を新鮮な増殖培地で希釈した。 6/7 DIVからは、島々の間の接続を見た後、10μL/ mlのFUDRは、グリアの異常増殖を防ぐために追加されました。
図4は 、モジュラーネットワークの動的(Bonifazi ら。2013 8に記載のように行っ)カルシウムイメージングを使用して記録を示しています。カルシウムフルオロuorescence画像がFIGUR(ネットワーク全体の活動を監視する有効4X倍率の対物レンズを用いて得た電子の4A)。 Bonifazi ら。2013 8で説明したようにカルシウムイメージングの分析を行った。カルシウムイベントの図4Bラスタープロットでは自発的な活性を示す発症(色は、図4Aにマークされたモジュールに対応)提示されている。カルシウムイメージングは、30Hzで行い、画像サイズ1000×1000ピクセルである。
おそらく多数の接続( 図4A)に対応し、それらの厚い接続束と一致するラスタプロット( 図4B)に示すように、緑とピンクのモジュールは非常に同期化される。青と赤のモジュールが弱く緑とピンクのモジュールに接続され、したがって、それらは時々それら( 図4B)と同期される。記録のビデオがオンラインで入手可能(動画M1)である。
21 DIVでのMEA上に成長させたモジュラーネットワークの画像が図5Aに示されている。私nは2次元の回路のための最良の較正を得るために、我々は、500×10 250×10 3からMEAあたり3細胞/を変え、異なる密度を有する皮質細胞を播種した。彼らの自発的相互接続を妨げないが250×10 3細胞/ MEA当たり(30 mmのリング)、単層回路の形成の面でより良い結果を与えた。パターン化された神経回路網は、MEAの基板( 図5A)上で達成された後、電気生理学的活性は、電気生理学的信号を取得して記録するために使用商用システムを用いて監視されている。培養物の自発的活動は、正確なタイミングスパイク検出(PTSD)アルゴリズム22を使用して検出される。
図5Bは、クラスタの数に応じて符号化された着色された自発的活動の5分(唯一の活性電極が見える)に対応するラスタープロットを示している。これらのプロットを見ることによって、定性的な評価を行うことが可能である単一クラスターのと同時に、ネットワーク全体の活性。特に、各クラスタ内に記録活動の間には強い同期を観察することが可能である。 MEA上のパターン化された培養からの代表記録のビデオがオンラインで入手可能(動画M2)である。
1.シリコンウェハ図。 (A)は、シリコンウェハ(〜4インチ径)PDMSステンシルを成形するために使用される。異なるSU8構造が異なるモジュラーネットワークを表す。モジュラーネットワーク構築のためのシリコンウェーハ上に実装(B)の代表的な特徴の設計を。各緑色のスポットは、単一のモジュールのためのSU8ピラー構造、したがって、領域を定義します。黒い破線矩形内の設計は、23ミリメートル側のlenの標準二乗培養カバーガラス上で使用できる3つの異なるステンシルに対応GTH。各ステンシルでは、アスタリスクがサポートするネットワークのためのマクロ領域をマーク。スポット間の距離に応じて、有限の大きさの回路またはモジュールは、それらの間の自発的なニューロンの接続を確立することができるかもしれない。特徴の設計は、異なる目的の倍率で(4X、10X及び20Xの視野に合うことができる単離された、または相互接続された神経回路を実現するために別のモジュールのサイズとモジュール間の距離を作成するために選択された、各倍率のビューのフィールドである赤い四角で表される)。破線の黒い長方形の外の特徴は、MEAとカルシウムイメージングの同時使用に適合するように設計されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2。PDMS構造は、MEAに堆積。 (赤い矢印でマーク)は、リング状の(A)PDMSモールドは、MEAに搭載された。モールドは、支持領域神経ネットワーク宛て培養領域の周辺に位置するコーティングするために使用される(これは、リングによって制限されるMEAに装着され、緑色の矢印で表示)。PDMSステンシルの(B)のアライメント整列した後、MEA上の上に堆積(C)PDMSステンシル。マイクロマニピュレーターを用いて、MEAに。10倍の倍率を使用して、MEA上のPDMSステンシルの(D)画像(電極間距離が500μmである)。これは、電極の対応してステンシルの穴に注意することは可能です。細胞接着を好む接着剤層のオープンのみの領域の上に堆積されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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別のDIV 3.モジュラー神経回路網図。〜600のx600μmの(A)の皮質モジュール14 DIV。(C)後4 DIVおよび(B)の後の明視野像は、14 DIV後に回路間の自発的な相互接続を注意してください。細胞は、大規模な回路が単層に編成するための最適な細胞密度、 すなわち、750×10 3細胞/ 35ミリメートルのペトリ皿に付着した23ミリメートルのカバースリップに播種した。(D)の半分の大きさと同じ細胞濃度のPDMS機能を使用して、クラスタ化された構造に組織化神経回路。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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モジュラーネットワーク4.カルシウムイメージングを図。カルシウム指示薬OGBを負荷(A)皮質細胞(18 DIV)。異なる色が異なるモジュールをマーク。視野は2×2mmである。自発運動の(B)ラスタプロット。パネルAに示すように異なる色が異なるモジュール内のセルに対応して、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
モジュラーネットワークの図5. MEA記録。 (A)モジュラーネットワーク(皮質ニューロン、21 DIV)は4QのMEA上に成長させた3つの異なる回路で構成。神経回路は、自発的な電動式の5分を示す〜お互いに相互接続さ600μmの。(B)ラスタープロット離れているophysiological活動記録。 C1、C2、C3は異なる色で強調表示、左上、右下、左下、クラスタのアクティビティを、それぞれ、対応しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
機能的に相互接続された回路からなる、in vitroでの2Dモジュラー神経ネットワークを成長させるためのプロトコルについて説明する。手順は、細胞の接着層をパターニングに基づいています。パターニングは、所望のネットワーク·アーキテクチャの負の特徴を再現するPDMSのステンシルを用いて達成される。 PDMSのステンシルは、細胞接着層が堆積される領域を定義する。細胞がメッキされていると、それらは自然発生的にコーティングされた島々に集合し、アクティブインター接続された回路に自己組織化する。 MEAのカルシウムイメージングを使用して記録機能的モジュラーネットワークの録音を提示した。
提示プロトコルは、正式に最初に続く手順に比べて変更されています。まず、PDMSステンシル」アラインメントの問題が対処されなければならなかった。アライメントが最初の試み(ステンシルが表面に触れた後、それはそれを再配置することは推奨されません)で達成する必要があるため、この問題が克服されている手動の手順を放棄し、MEAの記録領域上の正確なステンシル蒸着用マイクロマニピュレータを使用することからなる新規な方法を選ぶことができる。対処されなければならなかった他の問題は、整列ステンシル(そうでなければ、パターン化デザインを得ることができなかった)の下を通過するからPDLの低下を防止することにある。ステンシルが整列されており、それにPDL降下を入れる前に、と考えデバイス(MEAまたはカバーガラス)は、したがって上での良い添付ファイルを提供する適当な時間のための真空チャンバー内に残されるようにしたら、これを行うには表面。 PDL降下従ってPDLが表面と連絡を取ることを可能デバイス、ドロップ自体の間に形成する気泡を除去するために、ステンシル上に配置されると、同じことが行われている。
i)の保証すべきであるスピンコーティング相は「オープンレプリカ」を取得するか、少なくとも、suffici:記載されたプロトコルの重要なステップは次式で表され培養表面のii)の処理(カバースリップまたはMEA);その上にPDMSステンシルのiii)の配置は、容易にピンセットを用いて除去することができるSU8構造上ently薄膜iv)のコーティング相場合があるのでPDMSマスクに配置された基板に対して適切にシールしていない場合、ここで、接着タンパク質は、このようにパターニングを損なうマスクの下を通過することが起こる可能性がある。そのように、カバースリップまたはMEAの洗浄工程は、最も重要ならびにPDMSステンシルのアラインメントである。この2つのステップの適切な性能は、最高のパターニングの結果を保証する。
この技術の制限は、電気生理学およびカルシウムイメージング取得の両方を行うこともあります。最初のケースでは、非常に低い空間分解能(4 - 電極8は、各モジュールに含まれる)は、単一の回路の寸法と電極間distancの両方に存在するE。後者の場合、リスクは、このように単一細胞の解像度取得を防止する、二次元の細胞層を得ることができ、最適な細胞密度が見つからないことにある。
コーティング、組み立ておよび滅菌手順やカスタムマイクロアライメントシステムの構築の慎重な最適化を必要としたこの戦略は、以前の作品( 例えば、我々の細胞の長期生存が報告に関して私たちにいくつかの主要な利点を与えた、 すなわち、最大in vitroでの 8週間)。具体的には、化学的パターニング23-28に基づく戦略に関してより安定した信頼性の高い長期閉じ込め24を提供してくれ。
説明する手順は、軸索と樹状突起の束で連結され、ニューロンのアセンブリにネットワークの自己組織化することを保証し、PDLでコーティングされたモジュールの皮質細胞をプレーティングに依存しています。モジュラーネットの広視野カルシウムイメージングを可能にするために単細胞の解像度で動作するには、神経系が2D層内に編成することが重要である。したがって、プレートされた細胞の密度を最適化するために、両方の高密度、セルラクラスタまたはモジュール間接続確率を低減する他の極端な低密度のモジュールでは回避することが重要である。
培養中のニューロングリアネットワークは、それらの生体内の構造組織を失ったが、それらは、自然によく制御された実験条件下で研究を実施する可能性を提供する能動機能回路に自己組織化する。このプロトコルに記載されて機能的に相互接続された回路で構成される2次元のモジュラー神経回路網は、モチーフの大規模なレパートリーを生成するために、神経細胞の集合体間の通信のダイナミクスと構造的に定義された神経回路網の能力を調査するための強力なツールを提供する。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
この作品は、欧州プロジェクトBRIANBOW(FP7-ヤング探検家によってサポートされていました、著者は、ビデオで使用されるグラフィックスの生産に彼女の助けのための原稿上の有益なコメント博士ヤコポTessadori、そしてシルビアChiappaloneに感謝したいと思います。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
Nalgene vacuum chamber | Thermo | 5305-0609 | |
Poly-D-lysine PDL | Sigma | P7886 | |
Silicone grease - SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
Spin coater | Laurell - Technologies Corporation | WS-650-23 | |
12-well culture plate | Sigma | CLS3336 | |
5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma | F0503 | |
Uridine | Sigma | U3003 | |
MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
TC02 | Multi Channel Systems | ||
Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
B-27 | Gibco | 17504044 | |
glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com |
Silicon wafer | microchem | SU8-2075 | Preparation protocol: http://www.microchem.com |
References
- Buzsaki, G. Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68, 362-385 (2010).
- Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. Modular and hierarchically modular organization of brain networks. Frontiers in Neuroscience. 4, 200 (2010).
- Levy, O., Ziv, N. E., Marom, S. Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons. European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).
- Berdondini, L., et al. A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons. Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).
- Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PloS One. 9, e107400 (2014).
- Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits. PloS One. 5, e14443 (2010).
- Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology. Frontiers in Neuroengineering. 4, 10 (2011).
- Bonifazi, P., et al. In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses. Front Neural Circuits. 7, 40 (2013).
- Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording. Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).
- Marconi, E., et al. Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology. PloS One. 7, e34648 (2012).
- Taylor, A. M., Jeon, N. L. Microfluidic and compartmentalized platforms for neurobiological research. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39, 185-200 (2011).
- Sorkin, R., et al. Compact self-wiring in cultured neural networks. J Neural Eng. 3, 95-101 (2006).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems. Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).
- Campo, A. G. C. SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography. Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).
- Liu, G. T. Y. Kan Y Fabrication of high-aspect-ratio microstructures using SU8 photoresist. Microsystem Technologies. 11, 343-346 (2005).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15, 2973-2984 (1999).
- Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 2, 19-31 (1980).
- Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro. Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).
- Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture. Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).
- Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74, 61-66 (1972).
- Herzog, N., Shein-Idelson, M., Hanein, Y. Optical validation of in vitro extra-cellular neuronal recordings. J Neural Eng. 8, 056008 (2011).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177, 241-249 (2009).
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab Chip. 9, 404-410 (2009).
- Georger, J. H., et al. Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth. Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).
- Torimitsu, K., Kawana, A. Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture. Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).
- Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks. Medical & Biological Engineering & Computing. 36, 135-141 (1998).
- Petrelli, A., et al. Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays. Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).
- Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Hippocampal networks on reliable patterned substrates. Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).