Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Desenho, Tratamento de Superfícies, Cellular Galvanização e Cultura de modulares Neuronal de redes formadas por Circuitos Funcionalmente Inter-conectados

Published: April 15, 2015 doi: 10.3791/52572
* These authors contributed equally

Summary

Este manuscrito descreve um protocolo para crescer em redes modulares vitro que consistem em espacialmente confinados, circuitos neuronais funcionalmente inter-relacionados. Uma máscara polimérico é utilizado para uma camada de padrão de proteína para promover a adesão celular sobre o substrato de cultura. Neurônios Banhado crescer em áreas revestidas estabelecendo conexões espontâneas e exibem atividade eletrofisiológica.

Abstract

O cérebro opera por meio da ativação coordenada e comunicação dinâmica das assembléias neuronais. A questão em aberto é importante como um vasto repertório de motivos dinâmicos, que são a base mais diversas funções do cérebro, pode emergir de uma organização fixa topológico e modular dos circuitos cerebrais. Em comparação com estudos in vivo de circuitos neuronais que apresentam dificuldades experimentais intrínsecas, preparações in vitro oferece uma possibilidade muito maior para manipular e sondar as propriedades estruturais, dinâmicos e químicos de sistemas neuronais experimentais. Este trabalho descreve uma metodologia experimental in vitro que permite a cada vez maior de redes modulares compostos por, assembléias neuronais funcionalmente interligadas espacialmente distintas. O protocolo permite o controlo da arquitectura bidimensional (2D) da rede neuronal a diferentes níveis de complexidade topológica.

A padronização rede desejada pode serconseguido tanto em lamelas regulares e substrato incorporado matrizes micro eletrodos. Micromachined estruturas estão em alto relevo sobre uma bolacha de silício e utilizada para criar matrizes poliméricas biocompatíveis, que incorporam as características negativas do arquitectura de rede desejada. As matrizes são colocados sobre os substratos de cultura durante o processo de revestimento da superfície com uma camada molecular para promover a adesão celular. Após a remoção das matrizes, os neurónios são plaqueadas e eles espontaneamente redireccionado para as áreas revestidas. Diminuindo a distância entre o compartimento, é possível obter os circuitos neuronais isolados ou interligados. Para promover a sobrevivência celular, as células são co-cultivadas com uma rede neuronal de suporte, que está localizado na periferia da placa de cultura. Registros eletrofisiológicos e ópticas da atividade de redes modulares obtidos, respectivamente, utilizando substrato incorporado micro matrizes de eletrodos e de imagem de cálcio são apresentados. Enquanto cada módulo mostra espontsincronizações globais aneous, a ocorrência de sincronização entre módulos é regulada pela densidade de ligação entre os circuitos.

Introduction

Evidências experimentais e teóricas suporta a possibilidade de que o cérebro opera através da activação coordenada de conjuntos de células de 1-5, que pode ser considerado como unidades funcionais dinâmicos que transitoriamente interagem uns com os outros, para modelar e subjacentes estados cerebrais diferentes. Modularidade funcional também é dependente e associado com a organização estrutural de modular os circuitos cerebrais 6,7. Como a função e estrutura dos circuitos cerebrais mutuamente moldar o outro ainda é uma das principais questões em aberto na neurociência. Para fornecer uma compreensão mais profunda da questão, é importante para identificar estruturas experimentais ótimas, onde é possível resolver, pelo menos em parte, esses problemas. Desde a manipulação da dinâmica espaço-temporal de redes neuronais controlada em experimentos in vivo é um desafio, o desenvolvimento de modelos in vitro redes neuronais é de interesse significativo devido à sua acc fácilessibility, monitoramento, manipulação e modelagem de 8,9. Nos últimos anos, no domínio das tecnologias in vitro apoiados por métodos substrato padronização avançados têm permissão para induzir redes neuronais para desenvolver uma gama de estruturas modulares pré-definidos e 3 para estudar as propriedades funcionais das redes com topologias impostas 10. Em particular, os métodos foram recentemente usados ​​para organizar redes através da imposição de restrições físicas 4,11. Com efeito, para estudar a relação entre a estrutura e função em redes neuronais e para fornecer uma representação simplificada mas plausível de interagir conjuntos neuronais, em sistemas in vitro devem proporcionar sub-populações neuronais interligados. Culturas neuronais homogêneos 2D amplamente estudados não impor quaisquer restrições espaciais sobre a fiação emergente auto-organizada dos circuitos. Portanto, uma possível abordagem para modelar conjuntos de células artificialmente interconectadas é posicionar diferentes populações neuronais em brigaially áreas distintas. A distância entre estas áreas não impede que as inter conexões assembléias. Esta abordagem, assegurando ao mesmo tempo um controlo considerável sobre a complexidade da rede, tem sido mostrado para fornecer um repertório mais rica de modelos de sincronização 6,7,12.

A fim de facilitar a cultura reprodutível de assembléias neuronais modulares, um protocolo para montar a auto-organização das redes em agrupamentos neuronais ligados por axônios e dendritos é apresentado e descrito. A estrutura polimérica para o confinamento físico de culturas neuronais foi criado a partir de polydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS é um elastómero amplamente utilizado para aplicações biomédicas devido à sua biocompatibilidade, a transparência e a permeabilidade a gases 13. O PDMS é preparado e excluídos do SU8 microusinado 2075 14,15 estruturas por um PDMS líquido sobre um "mestre", como descrito anteriormente em Jackman et al-spin coating. 16 TEle alcançou modelado redes neuronais são compostos de módulos interligados de tamanho diferente e eles têm sido obtidos com êxito em ambas as lamelas e Microeletrodos Arrays (AMA) 17-20. A densidade das ligações entre os módulos podem alterar as características da rede de sincronização, a partir de uma rede totalmente sincronizados, típico das culturas uniformes, para estados transientes de sincronização entre os módulos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

O procedimento foi realizado em conformidade com as normas do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório e foi aprovado pelo cuidado e uso Comitê de Tel-Aviv University Animal (número de autorização - L-14-019).

1. Preparação de Instrumentos e PDMS

  1. Preparar a bolacha (Tabela de Materiais, ou encomendar a bolacha a partir de um laboratório de microfabricação), um bisturi, e um par de pinças - a esterilização não é necessária.
  2. Adicione solução de poli-D-lisina (PDL) de acordo com as seguintes condições: 4 mg / ml em tampão borato 0,1 M, pH 8, e armazenar a -20 ° C.
  3. Prepare stencils PDMS de acordo com o seguinte procedimento:
    1. Prepare de polidimetilsiloxano (PDMS, elastómero de silicone) misturando em conjunto a base e o agente de cura com um rácio de 10: 1, em seguida, agitar as duas substâncias de aproximadamente 5 min.
    2. Lugar na câmara de vácuo duas vezes durante 15 minutos de cada vez e verificar bolhas sumiram.
    3. Quandoo PDMS está pronto, preparar rotação revestidor: botões de azoto abertos para permitir o uso de gás, colocar a pastilha de silício (Figura 1A) na fieira, e usar a vácuo para impedi-lo de se mover.
    4. Verta sobre bolacha de PDMS e activar o botão rotativo durante 1 min a 1000 rpm (aproximadamente 100 pm cria altura).
    5. Coloque bolacha sobre uma placa quente a 100 ° C durante 30 min.
    6. Quando o PDMS tem endurecido, delinear as fronteiras do estêncil com PDMS, utilizando pipeta Pasteur. Coloque bolacha sobre uma placa quente a 100 ° C durante 30 min.
    7. Quando as fronteiras PDMS ter endurecido, usar um bisturi para cortar stencils de acordo com as fronteiras e retire o estêncil de silício do wafer (a PDMS quadrados contendo um único padrão).

2. Disco de Petri e tampa de deslizamento Preparação

  1. Prepare 23 milímetros lamelas de vidro quadrado e limpá-los de acordo com a seguinte ordem:
    1. Lava-se com água destilada, etanol a 70%, e acetona.
    2. Lavar com isopropanol e seca rápido com nitrogênio.
  2. Coloque estampados PDMS stencils na lamela, e pressione suavemente para verificar se eles estão firmemente ligado à superfície do vidro. Coloque na câmara de vácuo durante 15 min.
  3. Aplicar 1 ml da PDL em stencil. Inserir a lamela na câmara de vácuo duas vezes durante 20 min de cada vez, e deixar PDL O / N para secar.
  4. Prepare uma placa de Petri para criar uma rede de células de apoio:
    1. Cobrir a superfície do prato (3.5 cm) com 1 ml de PDL durante 2 horas em RT. Remover o PDL gota, usando uma pipeta.
    2. Lavar com água destilada e deixar secar. Colocar uma pequena gota de massa de silicone em cada canto da lamela.
  5. Coloque a lamela no centro da placa de Petri (ou seja, os PDMS deve estar voltado para cima) e pressione delicadamente para verificar anexo.
  6. Remova cuidadosamente PDMS de lamela usando uma pinça. Para a esterilização, expor a iluminação UV para 7 min.
le "> 3. multieletrodos Array (MEA) Preparação

  1. Limpe MEA nesta ordem (Tabela de Materiais):
    1. Lavar com água debaixo da torneira e sonicate em um detergente concentrado, enzimática 3 vezes.
    2. Sonicate em água destilada 3 vezes.
    3. Lavar com água destilada (na capa, 1.000 ul ponta) por 3 vezes e colocar sob UV por 30 min.
  2. Apoiar a preparação da rede:
    1. Prepare o molde rede de apoio projetado.
      1. Pour PDMS em uma placa de 12 poços (22 mm de diâmetro).
      2. Quando o PDMS é endurecido retirar o molde e, usando um bisturi, cortar um furo no meio para criar uma forma de anel.
      3. Coloque um molde de rede de suporte concebido em a centro da MEA (Figura 2A) e cobrir o resto da superfície com PDL durante 2 horas à temperatura ambiente.
    2. Remover PDL utilizando uma pipeta e lava-se com água destilada.
    3. Retirar o molde e deixar secar (Figura 2A). </ Li>
  3. Alinhar estêncil de MEA da seguinte forma:
    1. Coloque stencil sobre micro manipulador designado. Usar um microscópio invertido para alinhar com precisão a estrutura modelada eléctrodos, e diminuir o estêncil até que seja colocado na superfície MEA (Figura 2B).
      Nota: Entre em contato com um MEA bem limpo proporciona aderência de concorrência entre as PDMS e do próprio MEA.
    2. Levantar o micromanipulador e, se necessário, utilizar uma pinça para aplicar uma pequena quantidade de pressão acima do PDMS para evitar que desprendam do MEA.
    3. Pressione suavemente stencil à superfície MEA, e usar microscópio para verificar se ele está bem encaixada, e bem alinhados. (Figura 2C-D).
  4. Coloque MEA em câmara de vácuo durante 15 min; colocar uma gota 1 ml de PDL em stencil.
  5. Insira na câmara de vácuo 2 vezes por 20 min cada. Deixar secar PDL O / N na incubadora.
  6. Antes de chapeamento, retire as PDMS stencils da AAM e lavagem usando estéril water. Coloque sob iluminação UV para 7 min.

4. Dissecção e Cultura

  1. Prepare culturas como descrito na Herzog et al 2011 21..

5. Galvanização

  1. Calcular o número de células necessário para efeitos de revestimento, usando um hemocitómetro (densidade óptima de acordo com o tamanho do circuito como discutido nos resultados).
    1. Certifique-se que a câmara de contagem (hemocitômetro) é limpa e coloque uma lamínula sobre ele (o uso de álcool para limpar).
    2. Diluir 10 uL da suspensão de células em 190 ul de meio de plaqueamento (diluição de 1:20).
    3. Carregar 10 ml de células diluídas para a borda da câmara de contagem e lentamente pipetar as células para fora permitindo que a câmara encher-se.
    4. Usando um microscópio invertido, visualizar a grade hemocit�etro. Determinar o número de células na câmara através da contagem direta (células saudáveis ​​devem ser redondos). Contar as células dentro da grande witho quadradout aqueles que cruzam as bordas.
    5. Calcula-se a concentração de células:
      Número total de células / 1000 ul = Total de células contadas × fator de diluição × 10 4 (área da hemocitômetro).
      Nota: Por exemplo, se o factor de diluição foi de 20 e o total de células contadas foi de 100:
      100 × 20 × 10 4 = 0,1 x 10 7 células / ul ou 1 1,000 x 10 6/100 ul. A fim de placa de 0,75 x 10 6 células, tomar 75 ul para fora das células.
  2. Tirar o número de células necessário para o chapeamento por MEA único ou numa caixa de Petri, ressuspender as células para evitar a agregação e placa-los no centro, em cima da área do patternate (se necessário, é possível diluir as células no meio) . Para o MEA, colocar uma gota 100 uL no meio. Para tampa de deslizamento, coloque uma gota de 1.000 l no meio.
  3. Incubar as células plaqueadas a 37 ° C durante 40 min. Adicionar meio de plaqueamento para as células plaqueadas, até 1ml por MEA e 2 ml por tampa de deslizamento.
  4. Manter a 37 ° C e, a cada 4 dias, dilui-se com meio de crescimento fresco enriquecido com 0,5 Pen-Strep, 2% de B-27 e 0,75% glutamax.
  5. De 6/7 DIV, depois de ver ligações entre as ilhas, dilua com meio de 10 ul / ml de FUDR (25 mg desoxiuridina + 62,5 mg de uridina em 12,5 ml de MEM (Meio Mínimo Essencial de Eagle)) ou qualquer outro agente anti-mitótico para evitar glial supercrescimento.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

A SU8-2075 molde sobre uma pastilha de silício, com espessura característica de aproximadamente 100 mm foi utilizada para moldar as PDMS. O padrão foi composta por quadrados de várias dimensões, com um comprimento lateral e distância que varia entre 200 e 700 um (Figura 1B). O tamanho do quadrado foi escolhida para se adaptar ao campo de visão de um 10X (por ilhas com um comprimento lateral <800 um) e de uma objectiva de 20x (por ilhas com um comprimento lateral <400 um). Três parâmetros, nomeadamente a densidade de revestimento celular, a distância entre os circuitos, tamanho 'circuitos são determinantes para a obtenção de monocamadas ou circuitos em cluster, bem como impor e moldar sua conectividade. No entanto, estes parâmetros não são independentes uma vez que, dado uma distância fixa entre dois circuitos, a probabilidade de que eles espontaneamente estabelecer uma ligação com o aumento de tamanho dos circuitos. No exemplo discutido neste trabalho, para pequenos módulos neuronais de ~ 300 x 300 mm, conexõesForam estabelecidos quando a distância não é maior do que era ~ 300-400 mm, enquanto que para grandes módulos neuronais de ~ 700 x 700 mm, as ligações foram estabelecidas quando a distância era menor do que ~ 700? m. Em geral, aumentando a distância entre os quadrados, foi possível alterar a probabilidade de estabelecer espontaneamente geradas as inter-conexões entre os módulos, que passa a partir de módulos muito ligados para os isolados.

Módulos neuronais de ~ 600 x 600 mm são mostrados aos 4 dias in vitro (DIV; Figura 3A). Depois de alguns dias em neurônios in vitro estão localizados principalmente nas áreas revestidas enquanto não é possível observar processos neuronais desenvolvidos e conexões. Pelo contrário, a 14 DIV (Figura 3B-C) neurónios estabelecer ligações dentro e entre os módulos. Enquanto os circuitos neuronais maiores de ~ 600 x 600 mm poderiam auto-organizarem-se em monocamadas (Figura 3A-C), circuitos de smaller dimensões (por exemplo, ~ 300 x 300 mm na Figura 3D) tenderam a se agrupar. Por conseguinte, a fim de obter o melhor calibração para circuitos bidimensionais, as células foram plaqueadas com diferentes densidades variando de 0,25 x 06-1 outubro x 10 6 células / lamela de 23 mm instalada em uma placa de Petri de 35 mm. Para maiores circuitos de ~ 700 x 700 mm verificou-se que 0,75 x 10 6 células / 23 milímetros lamela de cobertura fixada a uma placa de Petri de 35 milímetros, é a densidade óptima que induz a formação de circuitos de monocamada não impedindo a sua inter-ligação espontânea (Figura 3C ). O mesmo resultado do circuito monocamada foi obtida em circuitos menores de ~ 300 x 300 mm por plaqueamento de 0,5 x 10 6 células / 23 milímetros deslizamento tampa instalada em uma placa de Petri de 35 mm. Em geral, quando se considera a densidade de plaqueamento de células, é importante salientar que, tal como anteriormente discutido 7, as células neuronais e gliais têm uma tendência inata para aglomerar, de modo algum grau de clustering é quase inevitável após algum tempo em cultura. No entanto, observou-se que o aumento da área destinada à rede de apoio contribuirá para aumentar a probabilidade de sobrevida dos circuitos e sua organização mono-camadas, provavelmente devido a maior concentração de nutrientes no espaço extracelular. Em qualquer caso, uma abordagem de tentativa e erro, é necessário para identificar a densidade de plaqueamento celular óptimo para criar circuitos mono-camadas para imagiologia de cálcio. A cada 4 dias o meio foi diluído com meio de crescimento fresco. De 6/7 DIV, depois de ver ligações entre as ilhas, 10 ul / ml de FUDR foi adicionado para evitar o crescimento excessivo da glia.

A Figura 4 mostra a dinâmica de uma rede modular gravado utilizando imagiologia de cálcio (realizada como descrito no Bonifazi et al. 2013 8). Imagens cálcio fluorescência foram adquiridas através de um objetivo a ampliação de 4X, o que permitiu a monitorização da actividade de toda a rede (Figure 4A). Análise da imagem de cálcio foi realizada como descrito no Bonifazi et al. 2013 8. Na Figura 4B raster trama dos acontecimentos cálcio início exibindo atividade espontânea é apresentada (cores correspondem aos módulos marcados na Figura 4A). Imagem de cálcio foi realizada em 30 Hz, e tamanho da imagem é de 1.000 x 1.000 pixels.

Os módulos de verde e rosa são altamente sincronizadas conforme mostrado no gráfico de varredura (Figura 4B), de acordo com os seus feixes de ligação de espessura, correspondendo possivelmente a um grande número de ligações (Figura 4A). Os módulos de azul e vermelho são fracamente ligados aos módulos de verde e rosa e, por conseguinte, que, ocasionalmente, sincronizado com elas (Figura 4B). Um vídeo da gravação está disponível online (filme M1).

A imagem de uma rede modular cultivado numa MEA em 21 DIV é mostrado na Figura 5A. EUordem n para obter a melhor calibração para circuitos bidimensionais, que plaqueadas células corticais com diferente densidade variando entre 250 x 10 3 a 500 x 10 3 células / por MEA. 250 x 10 3 células / por MEA (30 anel mm) deu os melhores resultados em termos de formação de circuitos em monocamada, o que não impede a sua inter-ligação espontânea. Redes neuronais Uma vez modelados foram alcançados em substrato AAM (Figura 5A), atividade eletrofisiológica foi monitorado usando um sistema comercial utilizado para a aquisição e registro de sinais eletrofisiológicos. Atividade espontânea de culturas é detectado usando o sincronismo preciso Detecção de Pico (PTSD) algoritmo 22.

Figura 5B mostra um gráfico raster correspondente a 5 min de atividade espontânea (apenas eletrodos ativos são visíveis), cor codificada de acordo com o número de cluster. Ao olhar para estas parcelas, é possível fazer avaliações qualitativasda actividade dos aglomerados individuais e de toda a rede, ao mesmo tempo. Em particular, é possível observar uma forte sincronização entre as actividades registadas no interior de cada aglomerado. Um vídeo de uma gravação representante de culturas estampados sobre MEA está disponível online (filme M2).

Figura 1
Figura 1. Silício bolacha. (A) A bolacha de silício (~ 4 polegadas de diâmetro) utilizado para moldar os stencils PDMS. Diferentes estruturas SU8 representam diferentes redes modulares. (B) projeto recurso Representante implementado em uma pastilha de silício para as redes modulares de construção. Cada mancha verde definir uma estrutura de pilares SU8 e, portanto, a área para um único módulo. Os projetos dentro do retângulo preto tracejado correspondem a três estênceis diferentes, que podem ser usados ​​em lamelas de cultura quadrados padrão de 23 milímetros len ladoGTH. Em cada stencil, um asterisco marca uma macro-região para a rede de apoio. Dependendo da distância entre os pontos, o circuito ou módulos de tamanho finito pode ser capaz de estabelecer ligações neuronais espontâneas entre eles. O design dos recursos foi escolhido para criar o tamanho do módulo diferente e inter-módulo à distância para alcançar circuitos neuronais isolados ou combinados entre si, que poderia caber o campo de visão em diferentes ampliações objetivas (4X, 10X e 20X; o campo de visão para cada ampliação é representados pelos quadrados vermelhos). Os recursos para fora do retângulo preto frustradas são projetados para caber a utilização simultânea de MEA e cálcio de imagem. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2.PDMS estruturas deposição sobre uma MEA. (A) PDMS molde com uma forma de anel (marcada com a seta vermelha) montado sobre uma MEA. O molde é utilizado para revestir a área destinada à rede neuronal e apoiando-se na periferia da área de cultura (isto é limitado pelo anel montado sobre a MEA e marcada pela seta verde). (B) Alinhamento de um estêncil PDMS no MEA usando um manipulador micro. (C) PDMS stencil depositado no no MEA após o alinhamento. (D) Imagem de um stencil PDMS em MEA usando uma ampliação de 10x (distância inter-eletrodo é de 500 mm). É possível notar os orifícios nos stencils em correspondência com os eletrodos. A camada adesiva favorecendo a adesão celular será depositado apenas nas áreas abertas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

ge = "always"> Figura 3
Figura 3. redes neuronais modulares na DIV diferente. Image Campo brilhante de módulos corticais de ~ 600 x 600μm (A) após 4 DIV e (B) após 14 DIV. (C) Observe as interconexões espontâneas entre os circuitos após 14 DIV. As células foram plaqueadas a uma densidade celular óptima para grandes circuitos de se organizar em monocamadas, ou seja, 750 x 10 3 células / 23 milímetros de deslizamento tampa colocada num prato de Petri 35 milímetros. (D) Utilização de PDMS características de metade do tamanho e mesma concentração de células, circuitos neuronais organizadas em estruturas em cluster. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

"width =" highres.jpg 700 "/>
Figura 4. O cálcio imagiologia de redes modulares. (A) As células corticais (18 DIV) carregadas com o indicador de cálcio OGB. Diferentes cores marcam diferentes módulos. O campo de visão é de 2 x 2 mm. (B) enredo Raster da atividade espontânea. As diferentes cores correspondem às células em diferentes módulos, como mostrado no painel A. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. gravação MEA de redes modulares. (A) da rede Modular (neurônios corticais, 21 DIV), composto por três circuitos distintos cultivadas em um MEA 4T. Circuitos neuronais são distantes ~ 600 mm interligado ao outro. (B) enredo Raster mostrando 5 min de electr espontâneagravação atividade ophysiological. C1, C2 e C3 correspondem, respectivamente, na parte superior esquerda, no canto inferior direito e às actividades do pólo inferior esquerdo, destaque em cores diferentes. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Um protocolo para crescer redes neuronais modulares 2D in vitro composto por circuitos funcionalmente interligadas é descrito. O procedimento baseia-se moldando uma camada adesiva celular. A padronização é conseguido com PDMS stencils reproduzindo a característica negativa da arquitectura da rede desejada. Stencils PDMS definir as áreas onde a camada adesiva celular é depositada. Uma vez que as células são banhados, eles se reúnem espontaneamente para as ilhas revestidos e auto-organizar-se em circuitos interligados ativos. Gravações de redes funcionais modulares gravados utilizando AMA e de imagem de cálcio foi apresentada.

O protocolo apresentado foi devidamente modificado em relação ao procedimento seguido inicialmente. Em primeiro lugar, os problemas com o alinhamento PDMS 'stencils tinha de ser resolvida. Uma vez que o alinhamento deve ser realizado na primeira tentativa (uma vez que o stencil tocou a superfície, não é recomendado para realocá-lo), esse problema foi superadoabandonando o procedimento manual e optar por um novo método que consiste em utilizar um micro-manipulador para deposição de estêncil precisas sobre a área de gravação MEA. Outra questão que teve de ser abordado consiste em impedir a queda PDL de passar por baixo do stencil alinhados (caso contrário, o projeto modelado não poderia ser obtido). Para fazê-lo, uma vez que o estêncil foi alinhada e antes de colocar a gota PDL sobre ele, o dispositivo considerado (MEA ou a lamela) tem de ser deixada na câmara de vácuo durante um período adequado de tempo, proporcionando assim uma boa fixação do mesmo na superfície. O mesmo foi feito uma vez que a queda de PDL é colocada na matriz, a fim de eliminar as bolhas de ar que se formam entre o dispositivo e a queda em si, permitindo assim o PDL para entrar em contacto com a superfície.

As etapas críticas do protocolo descrito são representados por: i) a fase de revestimento rotativo que deve garantir a ficar "réplicas abertas" ou, pelo menos, um sufficiSuavemente filme fino sobre as estruturas SU8 que podem ser facilmente removidos com uma pinça; ii) o tratamento da superfície de cultivo (lamela ou MEA); iii) a colocação dos stencils PDMS sobre ele; iv) a fase de revestimento desde há casos em que, se a máscara de PDMS não veda adequadamente contra o substrato sobre o qual é posicionado, pode acontecer que a proteína adesiva passa por debaixo da máscara comprometendo assim a padronização. Assim, o processo de limpeza das lamelas ou AAM é de primordial importância como também o alinhamento da matriz de PDMS. Performances adequada desses dois passos garantir melhores resultados de padronização.

As limitações desta técnica tem também a ver com ambos os eletrofisiológico e da aquisição de imagem de cálcio. No primeiro caso, uma resolução espacial muito baixo (4-8 eléctrodos estão incluídos em cada módulo) está presente, devido a ambas as dimensões do único circuito e o distanciamento entre eléctrodoe. No segundo caso, o risco consiste em não encontrar a densidade celular óptima que permite a obtenção de uma camada celular bidimensional, evitando assim que uma única célula aquisição resolução.

Esta estratégia, que exigia uma cuidadosa otimização do revestimento, montagem e procedimentos de esterilização e à criação de um sistema de micro-alinhamento costume, deu-nos algumas vantagens importantes em relação ao relatado anteriormente obras (por exemplo, a sobrevivência a longo prazo de nossas células, ou seja, até 8 semanas in vitro). Especificamente, ele nos forneceu um confinamento de longo prazo mais estável e confiável de 24 com relação a estratégias baseadas em padrões química 23-28.

O procedimento descrito baseia-se em cultivo de células corticais em módulos PDL-revestidos, o que garante a auto-organização das redes em assembléias neuronais ligados por feixes de axônios e dendritos. Para permitir que todo o campo de imagem de cálcio da rede modularfunciona com uma resolução de uma única célula, é essencial que o sistema neuronal organiza em uma camada 2D. Por isso, é crítica para optimizar a densidade de células plaqueadas tanto para evitar uma elevada densidade, agregados celulares ou em outros módulos de baixa densidade extremas que reduzem a probabilidade módulo inter-ligação.

Embora as redes neuronais-glial na cultura perdem a sua organização estrutural in-vivo, eles espontaneamente auto-organizar-se em circuitos funcionais ativos que oferecem a possibilidade de realizar estudos em condições experimentais bem controlados. As duas redes neuronais modulares dimensionais compostas de circuitos funcionalmente interligadas descritos neste protocolo de fornecer uma ferramenta poderosa para investigar a dinâmica da comunicação entre assembléias neuronais e da capacidade das redes neuronais estruturalmente definidas para gerar grande repertório de motivos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo BRIANBOW Projeto Europeia (FP7 Jovens Exploradores, Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Jacopo Tessadori para comentários úteis sobre o manuscrito, e Silvia Chiappalone por sua ajuda na produção dos gráficos usados ​​no vídeo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS, Sylgard 184 Dow Corning
Nalgene vacuum chamber Thermo 5305-0609
Poly-D-lysine PDL Sigma P7886
Silicone grease - SILICAID 1010 aidchim Ltd H3375
Spin coater Laurell - Technologies Corporation WS-650-23
12-well culture plate Sigma CLS3336
5-Fluoro-2’-deoxyuridine Sigma F0503
Uridine Sigma U3003
MEA1060-Inv-BC Multi Channel Systems
TC02 Multi Channel Systems
Pen Strep Biological Industries Beit Haemek 03-033-1c
B-27 Gibco 17504044
glutaMAX Gibco 35050-038
MEM Minimum Essential Medium-Eagle Biological Industries Beit Haemek 01-025-1B
Micro Electrode Arrays 4Q Multi Channel Systems 60-4QMEA1000iR-Ti-pr cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com
Silicon wafer microchem SU8-2075 Preparation protocol: http://www.microchem.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buzsaki, G. Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68, 362-385 (2010).
  2. Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. Modular and hierarchically modular organization of brain networks. Frontiers in Neuroscience. 4, 200 (2010).
  3. Levy, O., Ziv, N. E., Marom, S. Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons. European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).
  4. Berdondini, L., et al. A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons. Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).
  5. Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PloS One. 9, e107400 (2014).
  6. Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits. PloS One. 5, e14443 (2010).
  7. Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology. Frontiers in Neuroengineering. 4, 10 (2011).
  8. Bonifazi, P., et al. In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses. Front Neural Circuits. 7, 40 (2013).
  9. Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording. Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).
  10. Marconi, E., et al. Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology. PloS One. 7, e34648 (2012).
  11. Taylor, A. M., Jeon, N. L. Microfluidic and compartmentalized platforms for neurobiological research. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39, 185-200 (2011).
  12. Sorkin, R., et al. Compact self-wiring in cultured neural networks. J Neural Eng. 3, 95-101 (2006).
  13. Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems. Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).
  14. Campo, A. G. C. SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography. Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).
  15. Liu, G. T. Y. Kan Y Fabrication of high-aspect-ratio microstructures using SU8 photoresist. Microsystem Technologies. 11, 343-346 (2005).
  16. Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15, 2973-2984 (1999).
  17. Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 2, 19-31 (1980).
  18. Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro. Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).
  19. Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture. Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).
  20. Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74, 61-66 (1972).
  21. Herzog, N., Shein-Idelson, M., Hanein, Y. Optical validation of in vitro extra-cellular neuronal recordings. J Neural Eng. 8, 056008 (2011).
  22. Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177, 241-249 (2009).
  23. Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab Chip. 9, 404-410 (2009).
  24. Georger, J. H., et al. Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth. Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).
  25. Torimitsu, K., Kawana, A. Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture. Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).
  26. Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks. Medical & Biological Engineering & Computing. 36, 135-141 (1998).
  27. Petrelli, A., et al. Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays. Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).
  28. Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Hippocampal networks on reliable patterned substrates. Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).

Tags

Neurociência Edição 98, Padronização stencils PDMS SU8-2075 pastilha de silício a imagem latente de cálcio Micro Eletrodo Matriz
Desenho, Tratamento de Superfícies, Cellular Galvanização e Cultura de modulares Neuronal de redes formadas por Circuitos Funcionalmente Inter-conectados
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kanner, S., Bisio, M., Cohen, G.,More

Kanner, S., Bisio, M., Cohen, G., Goldin, M., Tedesco, M., Hanein, Y., Ben-Jacob, E., Barzilai, A., Chiappalone, M., Bonifazi, P. Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits. J. Vis. Exp. (98), e52572, doi:10.3791/52572 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter