Summary
Diese Handschrift beschreibt ein Protokoll, um in vitro modulare Netzwerke aus räumlich beschränkt, funktionell miteinander verbundenen neuronalen wachsen. Eine Polymermaske zum Strukturieren einer Proteinschicht verwendet, um die zelluläre Adhäsion über die Kultivierungssubstrat zu fördern. Vernickelt Neuronen wachsen auf beschichteten Bereiche Gründung spontane Verbindungen und elektrophysiologische Aktivität zeigen.
Abstract
Das Gehirn funktioniert durch die koordinierte Aktivierung und der dynamischen Kommunikation von Neuronenverbände. Eine wichtige offene Frage ist, wie ein riesiges Repertoire an dynamische Motive, die die verschiedensten Funktionen des Gehirns zugrunde liegen, kann aus einem festen topologischen und modulare Organisation des Gehirns Schaltungen entstehen. Im Vergleich zu in-vivo-Studien der neuronalen Schaltkreise, die intrinsische experimentellen Schwierigkeiten bereitet, bieten in vitro Präparate eine viel größere Möglichkeit zur Manipulation und Sonde die strukturelle, dynamische und chemische Eigenschaften von experimentellen neuronalen Systemen. In dieser Arbeit wird ein in vitro experimentellen Methodik, die den Anbau von modularen Netzwerke von räumlich getrennten, funktionell miteinander verbundenen Neuronenverbände zusammensetzt ermöglicht. Das Protokoll ermöglicht die Steuerung der zweidimensionalen (2D) Architektur des neuronalen Netzwerks auf verschiedenen Ebenen der topologische Komplexität.
Eine gewünschte Netzwerk Strukturieren kannsowohl auf den regulären Deckgläser und Substrat eingebettet Mikroelektrodenarrays erreicht. Mikrobearbeiteten Strukturen werden auf einem Siliziumwafer geprägt und verwendet, um biokompatiblen polymeren Matrizen, die die negativen Eigenschaften der gewünschten Netzarchitektur einzubeziehen erstellen. Die Schablonen werden an die Kultivierungssubstraten während des Oberflächenbeschichtungsverfahren mit einer Molekülschicht zur Förderung der Zelladhäsion platziert. Nach dem Entfernen der Schablonen werden Neuronen plattiert und sie spontan auf den beschichteten Bereichen umgeleitet. Durch Verringern des Zwischenraums entfernt, ist es möglich, entweder isoliert oder miteinander verbundenen neuronalen erhalten. Überleben der Zelle zu fördern, sind Zellen co-kultiviert mit einem Stütz neuronalen Netzwerk, das an der Peripherie der Kulturschale angeordnet ist. Elektrophysiologischen und optischen Aufnahmen der Aktivität von modularen Netze jeweils unter Verwendung Substrat eingebettet Mikroelektrodenarrays und Calcium-Bildgebung erhalten werden vorgestellt. Während jedes Modul zeigt spontaneous globalen Synchronisierung, wird das Auftreten von Zwischenmodul-Synchronisation durch die Dichte der Verbindung zwischen den Schaltungen geregelt.
Introduction
Experimentelle und theoretische Beweise unterstützen die Möglichkeit, dass das Gehirn arbeitet durch koordinierte Aktivierung von Zellenanordnungen 1-5, die als dynamische Funktionseinheiten, die vorübergehend miteinander, Formgebung und darunterliegende verschiedene Gehirnzustände in Wechselwirkung angesehen werden kann. Funktionale Modularität ist auch abhängig von und mit der strukturellen modulare Organisation des Gehirns Schaltungen 6,7 verbunden. Wie Funktion und Struktur des Gehirns Schaltungen gegenseitig prägen immer noch eine der wichtigsten offenen Fragen in den Neurowissenschaften. Um ein tieferes Verständnis für diese Frage, ist es wichtig, um eine optimale Versuchs Rahmenbedingungen zu identifizieren, wo es möglich ist, anzugehen, zumindest teilweise, diese Probleme. Da gesteuerte Manipulation der raumzeitlichen Dynamik neuronaler Netzwerke in in vivo Experimenten ist eine Herausforderung, die Entwicklung von in vitro Modellen neuronaler Netzwerke von großem Interesse wegen ihrer einfachen accessibility, Überwachung, Manipulation und Modellierung 8,9. In den letzten Jahren, in von fortgeschrittenen Substratstrukturierungsmethoden unterstützt vitro Technologien erlaubt neuronaler Netze zu veranlassen, eine Reihe von vordefinierten modularen Strukturen 3 zu entwickeln und die funktionellen Eigenschaften von Netzen mit auferlegt Topologien 10 zu studieren. Insbesondere wurden Verfahren vor kurzem verwendet, um Netzwerke von imposanten physischen Beschränkungen 4,11 organisieren. In der Tat, den Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion der neuronalen Netze zu untersuchen und eine vereinfachte, aber plausible Darstellung der Interaktion Neuronenverbände bieten, sollten in vitro-Systeme miteinander verbundenen neuronalen Subpopulationen werden. Weitgehend untersucht 2D homogene neuronalen Kulturen keine räumliche Zwänge auferlegen selbstorganisierten emergent Verdrahtung der Schaltkreise. Daher wird ein möglicher Ansatz, um künstlich miteinander verbundenen Zellverbände zu gestalten ist, um verschiedene neuronale Populationen in spuckte positionierenmathematisch verschiedene Bereiche. Der Abstand zwischen diesen Bereichen verhindert nicht, dass die inter-Baugruppen-Verbindungen. Dieser Ansatz, der gleichzeitig ein beträchtliche Kontrolle über die Netzwerkkomplexität, wurde gezeigt, dass eine reichere Repertoire Synchronisationsmodellen 6,7,12 bereitzustellen.
Um eine reproduzierbare Kultivierungs modularer Neuronenverbände zu erleichtern, ein Protokoll, die Selbstorganisation von Netzwerken in neuronale Cluster von Axonen und Dendriten verbunden zu montieren vorgestellt und beschrieben. Die Polymerstruktur zur physikalischen Begrenzung des neuronalen Kulturen aus polydimtheylsiloxane (PDMS) erstellt. PDMS ist ein Elastomer häufig für biomedizinische Anwendungen aufgrund ihrer Biokompatibilität, Transparenz und Durchlässigkeit für Gase 13 verwendet. Das PDMS wird durch Schleuderbeschichtung eine Flüssigkeit PDMS auf einen "Master", wie vorher in Jackman et al. 16 T vorbereitet und von der mikro SU8 ausgeschlossen 2075 14,15 StrukturenEr erreichte gemusterten neuronalen Netzwerke von miteinander verbundenen Modulen unterschiedlicher Größe zusammengesetzt ist, und diese erfolgreich auf beiden Deckgläser und Mikroelektrodenanordnungen (MEAs) 17-20 erhalten wurden. Die Dichte der Verbindungen zwischen den Modulen kann die Eigenschaften der Netzwerksynchronisation zwischen den Modulen zu ändern, von einem vollständig synchronisierten Netzwerks typischen einheitlichen Kulturen, um Übergangszustände von Synchronisation.
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Protocol
Das Verfahren wurde in Übereinstimmung mit den NIH-Standards für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und von der Universität Tel-Aviv Animal Care und Verwenden Committee (Zulassungsnummer - L-14-019) zugelassen.
1. Vorbereitung der Instrumente und PDMS
- Bereiten Sie die Wafer (Tabelle der Materialien, oder bestellen Sie die Wafer aus einem Mikrolabor), ein Skalpell und einer Pinzette - Sterilisation ist nicht erforderlich.
- Make Poly-D-Lysin (PDL) Lösung gemäß den folgenden Bedingungen: 4 mg / ml in 0,1 M Boratpuffer, pH 8, und bei -20 ° C.
- Bereiten PDMS Schablonen nach dem folgenden Verfahren:
- Bereiten Polydimethylsiloxan (PDMS, Silikonelastomer) durch Mischen der Basis und das Härtungsmittel in einem Verhältnis von 10: 1, dann rühren die 2 Substanzen für ungefähr 5 min.
- Platzieren Sie in der Vakuumkammer zweimal für 15 Minuten jedes Mal, und überprüfen Sie Luftblasen verschwunden sind.
- Wanndie PDMS ist bereit, bereiten Spincoater: open Stickstoff Regler auf Gasverbrauch zu ermöglichen, legen Sie die Siliziumscheibe (1A) am Spinner, und verwenden Sie das Vakuum, um es mehr bewegen lässt.
- Gießen PDMS über Wafer und aktivieren Sie die spinner 1 min bei 1000 Umdrehungen pro Minute (erzeugt etwa 100 & mgr; m Höhe).
- Platzieren Wafer auf einer heißen Platte bei 100 ° C für 30 min.
- Wenn der PDMS ausgehärtet ist, einen Überblick über die Schablone Grenzen mit PDMS, mit Pasteurpipette. Platzieren Wafer auf einer heißen Platte bei 100 ° C für 30 min.
- Wenn die PDMS-Grenzen ausgehärtet, mit einem Skalpell, um Schablonen nach den Grenzen geschnitten und ziehen Sie die Silizium-Schablone aus dem Wafer (ein Quadrat PDMS mit einem einzelnen Muster).
2. Petrischale und Deckglas Vorbereitung
- Bereiten Sie 23 mm Quadratglasplättchen und reinigen Sie diese nach der folgenden Reihenfolge:
- Mit destilliertem Wasser, 70% Ethanol und Aceton zu waschen.
- Mit Isopropanol und schnell mit Stickstoff trocken waschen.
- Zeigen gemusterten PDMS Schablonen auf Deckglas, und drücken Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass sie fest an der Glasoberfläche angebracht. Platzieren Sie in der Vakuumkammer für 15 Minuten.
- 1 ml der PDL auf Schablone. Legen Sie das Deckglas in die Vakuumkammer zweimal für jeweils 20 min, und lassen Sie PDL O / N, um zu trocknen.
- Bereiten Petrischale auf eine unterstützende Zellennetz zu erstellen:
- Decken Sie die Oberfläche der Schale (3,5 cm) mit 1 ml PDL für 2 Stunden in RT. Nehmen Sie die PDL-Tropfen mit einer Pipette.
- Waschen mit destilliertem Wasser und trocknen lassen. Legen Sie einen sehr kleinen Tropfen Silikonfett an jeder Ecke des Deckglases.
- Legen Sie das Deckglas auf die Mitte der Petrischale (dh die PDMS sollte nach oben) und drücken Sie vorsichtig, um die Befestigung zu überprüfen.
- Entfernen Sie vorsichtig PDMS von Deckglas mit einer Pinzette. Zur Sterilisation aussetzen UV-Beleuchtung für 7 min.
- Saubere MEA in dieser Reihenfolge (Tabelle der Materialien):
- 3 Mal Waschen mit Wasser unter Wasserhahn und beschallen in konzentrierter, enzymatische Reinigungsmittel.
- Mit Ultraschall in destilliertem Wasser 3-mal.
- Waschen mit destilliertem Wasser (in der Kapuze, 1000 ul Spitze) für 3-mal und Ort unter UV für 30 min.
- Unterstützung Netzvorbereitung:
- Bereiten Sie die Support-Netzwerk entwickelt, Schimmel.
- Gießen PDMS in eine Platte mit 12 Vertiefungen (22 mm Durchmesser).
- Wenn der PDMS gehärtet nehmen Sie die Form und mit einem Skalpell, schneiden Sie ein Loch in der Mitte, um eine Ringform zu schaffen.
- Legen Sie ein Support-Netzwerk entwickelt Schimmel auf der Mitte der MEA (2A) und decken den Rest der Oberfläche mit PDL für 2 h bei RT.
- Entfernen PDL mit Pipette und wäscht mit destilliertem Wasser.
- Entfernen Sie die Form und trocknen lassen (Abbildung 2A). </ Li>
- Bereiten Sie die Support-Netzwerk entwickelt, Schimmel.
- Richten Schablone MEA auf die folgende Weise:
- Setzen Sie Schablone auf bezeichneten Mikromanipulator. Verwenden eines invertierten Mikroskops genau auszurichten gemusterten Struktur, um die Elektroden, und senken die Schablone bis sie auf der MEA Oberfläche (2B) angeordnet ist.
Hinweis: Kontakt mit einer gut gereinigt MEA bietet wettbewerbsfähige Haftung zwischen den PDMS und der MEA selbst. - Heben Sie den Mikromanipulator und, wenn nötig, mit Hilfe einer Pinzette, um eine kleine Menge von Druck über die PDMS anwenden Ablösen von der MEA zu verhindern.
- Drücken Sie vorsichtig Schablone MEA Oberfläche, und verwenden Sie Mikroskop zu überprüfen, es richtig angebracht ist und gut ausgerichtet sind. (2C-D).
- Setzen Sie Schablone auf bezeichneten Mikromanipulator. Verwenden eines invertierten Mikroskops genau auszurichten gemusterten Struktur, um die Elektroden, und senken die Schablone bis sie auf der MEA Oberfläche (2B) angeordnet ist.
- Zeigen MEA in der Vakuumkammer für 15 Minuten; legte eine 1 ml Tropfen PDL auf Schablone.
- Legen Sie in die Vakuumkammer 2 mal 20 min je. Lassen PDL zu O / N im Brutschrank trocknen.
- Vor der Beschichtung, entfernen Sie die PDMS-Schablonen von MEAs und waschen mit sterilen water. Platzieren Sie unter UV-Beleuchtung für 7 min.
4. Dissection und Kultur
- Bereiten Kulturen wie in Herzog et al. 2011 21 beschrieben.
5. Überzug
- Berechnung der Anzahl von Zellen zum Plattieren erforderlich ist, unter Verwendung eines Hämocytometers (optimale Dichte entsprechend der Größe des Schaltkreises, wie in der Folge beschrieben).
- Sicherstellen, dass die Zählkammer (Hämozytometer) ist sauber und setzen Sie ein Deckglas darauf (verwenden Sie Alkohol zu reinigen).
- Verdünne 10 & mgr; l der Zellsuspension in 190 ul Plattierungsmedium (Verdünnung 1:20).
- Last 10 ul der verdünnten Zellen auf den Rand der Zählkammer und langsam pipettiert die Zellen aus der Kammer ermöglicht, sich zu füllen.
- Mit einem inversen Mikroskop, visualisieren die Hämocytometer Netz. Bestimmen der Anzahl von Zellen in der Kammer, die durch direkte Zählung (gesunde Zellen sollen rund sein). Zählen Sie die Zellen im großen Platz without die Überquerung der Kanten.
- Berechnen der Konzentration der Zellen:
Gesamtzellzahl / 1000 & mgr; l = Gesamtzellen × Verdünnungsfaktor gezählt × 10 4 (Bereich der Zählkammer).
Hinweis: Zum Beispiel, wenn der Verdünnungsfaktor betrug 20, und die gesamten Zellen gezählt wurden 100:
100 × 20 × 10 4 = 0,1 × 10 7 Zellen / 1.000 & mgr; l oder 1 x 10 6/100 ul. Um die Platte 0,75 x 10 6 Zellen, nehmen 75 ul aus den Zellen.
- Mit der Anzahl der Zellen für die Plattierung pro Einzel MEA oder eine Petrischale erforderlich ist, die Zellen werden um eine Aggregation zu verhindern, und die Platte zu der Mitte, auf der Oberseite des patternate Bereich (falls nötig, ist es möglich, die Zellen in dem Medium verdünnt) . Für die MEA, legen eine 100 & mgr; l Tropfen in der Mitte. Für Deckglas, legen Sie ein 1.000 ul Tropfen in der Mitte.
- Der ausplattierten Zellen bei 37 ° C für 40 min. Hinzufügen Plattierungsmedium den plattierten Zellen, bis 1ml pro MEA und 2 ml pro Deckglas.
- Halten bei 37 ° C, und alle 4 Tage mit frischem Wachstumsmedium mit 0,5 Pen-Strep, 2% B-27 und 0,75% Glutamax angereichert verdünnen.
- Von 07.06 DIV, nachdem er Verbindungen zwischen den Inseln, verdünnte Medium mit 10 & mgr; l / ml FUDR (25 mg desoxyuridin + 62,5 mg Uridin in 12,5 ml MEM (Minimum Essential Medium Eagle)) oder eine andere antimitotische Mittel, um zu verhindern, Gliazellen Wucherung.
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Representative Results
A SU8-2075 Form auf einem Siliziumwafer mit einem Merkmal Dicke von etwa 100 um wurde verwendet, um die PDMS formen. Das Muster wurde der Quadrate der mehreren Dimensionen zusammengesetzt, mit einer Seitenlänge und der Abstand zwischen 200 und 700 um (1B). Die Größe des Platzes wurde gewählt, um das Sichtfeld eines 10X (für Inseln mit einer Seitenlänge <800 um) und einem 20x-Objektiv (für Inseln mit einer Seitenlänge <400 um) passen. Drei Parameter, nämlich Zell Beschichtungs-Dichte, zwischen den Stromkreisen, sind Größe Schaltungen "Determinante für den Erhalt von Monoschichten oder gruppierte Schaltungen sowie zur Verhängung und Form ihrer Anschlussmöglichkeiten. Allerdings sind diese Parameter nicht unabhängig, da, bei einem festgelegten Abstand zwischen zwei Schaltungen, die Wahrscheinlichkeit, dass sie sich spontan eine Verbindung Zunahme mit der Größe der Schaltungen. Bei dem in dieser Arbeit diskutiert, für kleine neuronale Module von ~ 300 Beispiel x 300 um, Verbindungenwurden festgestellt, wenn der Abstand nicht größer als ~ 300 bis 400 & mgr; m, während für große neuronale Module von ~ 700 x 700 um, wurden Verbindungen hergestellt, wenn der Abstand kleiner als ~ 700 & mgr; m. In der Regel, indem der Abstand zwischen den Quadraten war es möglich, die Wahrscheinlichkeit, sich spontan erzeugten Querverbindungen zwischen den Modulen zu schaffen ändern, indem sie von hoch angeschlossenen Module, isolierte diejenigen.
Neuronal Module von ~ 600 x 600 um werden nach 4 Tagen in vitro (DIV; 3A). Nach einigen Tagen in vitro Neuronen sind meist innerhalb der beschichteten Bereiche befindet, während es nicht möglich ist, den entwickelten neuronalen Prozesse und Verbindungen zu beobachten. Im Gegenteil, bei 14 DIV (3B-C) Neuronen stellen Verbindungen in und zwischen den Modulen. Während größere neuronaler Schaltkreise von ca. 600 x 600 um durch Selbstorganisation in Monoschichten (3A-C), Kreise smaller Dimensionen (zB ~ 300 x 300 um in 3D) neigte dazu, zu gruppieren. Daher, um die beste Kalibrierungs für zweidimensionale Schaltungen zu erhalten, wurden die Zellen mit unterschiedlicher Dichte variiert zwischen 0,25 × 10 6 bis 1 x 10 6 Zellen / 23 mm Deckglas in eine 35 mm Petrischale befestigt plattiert. Für größere Schaltkreise von ~ 700 x 700 um haben wir festgestellt, daß 0,75 x 10 6 Zellen / 23 mm Deckglas in eine 35 mm Petrischale angebracht ist die optimale Dichte, die die Bildung von Monolayer-Schaltungen nicht ihre spontane Zusammenschalten verhindert induziert (3C ). Das gleiche Ergebnis Mono Schaltung wurde in kleinere Schaltungen von ~ 300 & times; 300 & mgr; m durch Plattieren 0,5 x 10 6 Zellen / 23 mm Deckglas in eine 35 mm Petrischale angebracht erhalten. Im allgemeinen, wenn man Zelle Plattierungsdichte, ist es wichtig hervorzuheben, dass, wie zuvor diskutiert 7 haben neuronale und gliale Zellen eine angeborene Neigung zu gruppieren, so dass ein gewisser Grad von clustering ist nach einiger Zeit in der Kultur fast unvermeidlich. Wir beobachteten jedoch, dass die Vergrößerung der Fläche an der Stütz Netzwerk bestimmt würde die Wahrscheinlichkeit von Schaltungen das Überleben und ihre Mono-Schichtorganisation erhöhen, vermutlich wegen einer größeren Konzentration der Nährstoffe in den extrazellulären Raum. In jedem Fall wird ein Trial-and-Error-Methode erforderlich, um die optimale Zell Beschichtungs-Dichte zu identifizieren, um einschichtigen Kreise für Calcium Imaging erstellen. Alle 4 Tage wurde das Medium mit frischem Wachstumsmedium verdünnt. Von 6/7 DIV, nachdem er Verbindungen zwischen den Inseln, 10 ul / ml FUDR wurde hinzugefügt, um Gliazellen Wucherung zu verhindern.
Abbildung 4 zeigt die dynamische eines modularen Netzwerk mit Calcium imaging (durchgeführt wie in Bonifazi et al. 2013 8 beschrieben) aufgezeichnet. Calcium- Fluoreszenzbilder wurden mit einem 4-fach vergrößerndes Objektiv, die Überwachung der Aktivität des gesamten Netzwerks aktiviert erworben (Figure 4A). Analyse der Calcium Bildgebung wurde wie in Bonifazi et al. 2013 8 beschrieben durchgeführt. In 4B Raster Grundstück der Calcium Veranstaltungen Beginn Anzeige spontane Aktivität vorgestellt (Farben entsprechen Module in 4A markiert). Calcium-Bildgebung wurde bei 30 Hz durchgeführt wird, und die Bildgröße beträgt 1.000 x 1.000 Pixel.
Die grünen und rosa Module werden hoch synchronisiert, wie in der Raster Grundstück (4B) im Einvernehmen mit ihren dicken Verbindungsbündel gezeigt, was möglicherweise zu einer großen Anzahl von Verbindungen (4A) entspricht. Die blauen und roten Module schwach an den grünen und rosa Modulen verbunden und daher gelegentlich mit ihnen (4B) synchronisiert. Ein Video der Aufnahme ist online verfügbar (Film M1).
Das Bild von einem modularen Netzwerks auf einer MEA 21 DIV gewachsen ist in 5A gezeigt. Ichn, um die beste Kalibrierungs für zweidimensionale Schaltungen zu erhalten, plattiert wir kortikalen Zellen mit unterschiedlicher Dichte reicht von 250 x 10 3 bis 500 x 10 3 Zellen / pro MEA. 250 x 10 3 Zellen / pro MEA (30 mm Ring) ergab bessere Ergebnisse in Bezug auf die Bildung von Monoschicht-Schaltungen, die zwar nicht die spontane Zusammenschalten verhindert wird. Sobald gemusterten neuronalen Netzwerke auf MEAs Substrat (5A) erzielt wurden, elektrophysiologische Aktivität wurde unter Verwendung eines kommerziellen Systems zum Erfassen und Aufzeichnen elektrophysiologischer Signale verwendet wird überwacht. Spontane Aktivität der Kulturen wird mit der Precise Timing Spike-Erkennung (PTSD) Algorithmus 22 erfasst.
5B zeigt eine Raster Grundstück entsprechend 5 min von Spontanaktivität (nur aktive Elektroden sichtbar sind), farbig nach der Cluster-Nummer codiert. Mit Blick auf diesen Parzellen, ist es möglich, qualitative Einschätzungen machender Aktivität einzelner Cluster und für das gesamte Netz gleichzeitig. Insbesondere ist es möglich, eine starke Synchronisierung zwischen den in jedem Cluster aufgezeichneten Aktivitäten zu beobachten. Ein Video von einem Vertreter Aufnahme von gemusterten Kulturen über MEA ist online verfügbar (Film M2).
Abbildung 1. Quarzscheibe. (A) Der Siliziumwafer (~ 4 cm Durchmesser) verwendet, die PDMS-Schablonen zu formen. Verschiedene SU8 Strukturen repräsentieren verschiedene modulare Netzwerke. (B) Vertreter Feature auf einem Siliziumwafer für modulare Aufbau Netzwerke implementiert Design. Jedes grüne Punkt definieren eine SU8 Säulenstruktur und damit den Bereich für ein einzelnes Modul. Die Entwürfe innerhalb der gestrichelten schwarzen Rechteck zu drei verschiedene Schablonen, die auf Standard-Quadrat Kultur Deckgläser von 23 mm Seiten len verwendet werden können, entsprechength. In jeder Schablone, ein Stern markiert eine Makroregion für die unterstützendes Netzwerk. Je nach Abstand zwischen den Flecken, kann die endliche Größe Schaltung oder Module in der Lage, spontane neuronalen Verbindungen zwischen ihnen aufzubauen. Die Ausführung der Funktionen wurde gewählt, um verschiedene Modulgröße und Abstand zwischen den Modulen zu erstellen, um isolierte oder verbundene neuronale Schaltkreise, die das Sichtfeld in verschiedenen Objektivvergrößerungen passen könnte (4x, 10x und 20x erreichen; das Sichtfeld für jede Vergrößerung durch die roten Quadrate dargestellt). Die Funktionen aus der gestrichelten schwarzen Rechteck sind entworfen, um die gleichzeitige Verwendung von MEA und Kalzium-Imaging passen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 2.PDMS Strukturen der Abscheidung auf einer MEA. (A) PDMS-Form mit einer Ringform (mit dem roten Pfeil markiert), die an einer MEA. Die Form wird zur Beschichtung der Bereich mit dem Trag neuronalen Netzwerk bestimmt und an der Peripherie des Kultivierungsgebiet verwendet (dies wird durch den Ring begrenzt, auf der MEA angeordnet und der grüne Pfeil markiert). (B) Alignment der PDMS Schablonen auf der MEA mit einem Mikro-Manipulator. (C) PDMS-Schablone auf die auf MEA nach dem Ausrichten hinterlegt. (D) Bild eines PDMS Schablone auf MEA mit einem 10-facher Vergrößerung (Abstand zwischen den Elektroden beträgt 500 um). Es ist möglich, in Übereinstimmung mit den Elektroden beachten die Bohrungen auf den Schablonen. Die Klebeschicht begünstigt zelluläre Adhäsion wird nur auf die geöffneten Bereiche hinterlegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Abbildung 3. Modulare neuronale Netze mit unterschiedlichen DIV. Hellfeld Bild der kortikalen Module von ~ 600 x 600 um (A) nach 4 DIV und (B) nach 14 DIV. (C) Beachten Sie die spontane Verbindungen zwischen den Stromkreisen nach 14 DIV. Die Zellen wurden bei der optimalen Zelldichte für große Schaltungen in Monoschichten organisieren zogen, dh 750 x 10 3 Zellen / 23 mm Deckglas in einer 35 mm Petrischale angebracht. (D) Mit PDMS Merkmale der Hälfte Größe und gleichen Zellkonzentration, neuronale Schaltkreise in Cluster-Strukturen organisiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Abbildung 4. Calcium Imaging von modularen Netzwerke. (A) Kortikale Zellen (18 DIV) mit dem Calcium-Indikator OGB geladen. Unterschiedliche Farben kennzeichnen verschiedene Module. Das Sichtfeld ist 2 x 2 mm. (B) Raster Grundstück von Spontanaktivität. Die verschiedenen Farben entsprechen den Zellen in verschiedene Module wie in Panel A gezeigten Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 5. MEA Aufnahme von modularen Netzwerke. (A) Modulares Netzwerk (kortikalen Neuronen, 21 DIV) der 3 verschiedene Schaltungen auf einem 4Q MEA gewachsen zusammen. Neuronale Schaltkreise entfernten ~ 600 um miteinander verbunden zu einander. (B) Raster Auftragung, 5 Minuten von spontanen elektrophysiological Leistungserfassung. C1, C2 und C3 entsprechen jeweils in die linke obere, die untere rechte und die Aktivitäten der linken unteren Clusters, in verschiedenen Farben hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Ein Protokoll, um 2D modulare neuronale Netzwerke in vitro funktionell miteinander verbundenen Schaltungen zusammen wachsen beschrieben. Das Verfahren basiert auf Strukturieren einer zellulären Klebeschicht. Strukturierung mit PDMS Schablonen Wiedergabe der negativen Merkmal der gewünschten Netzwerkarchitektur erreicht. PDMS Schablonen definieren die Bereiche, in denen das zellulare Haftschicht abgeschieden wird. Sobald Zellen überzogen, sie spontan versammeln, um den überzogenen Inseln und Selbstorganisation aktiv miteinander verbundenen Schaltungen. Aufnahmen von funktionellen modularen Netzwerke aufgenommen mit MEAs und Kalzium-Imaging präsentiert.
Das vorgestellte Protokoll wurde ordnungsgemäß gegenüber dem zunächst gefolgt Verfahren geändert. Erstens hatte Probleme mit PDMS Schablonen "Ausrichtung angesprochen werden. Da die Ausrichtung muss im ersten Versuch erreicht werden (wenn die Schablone hat die Oberfläche berührt, ist es nicht empfehlenswert, es zu verlegen) wurde dieses Problem überwundendurch Verzicht auf die manuelle Verfahren und die Entscheidung für eine neue Methode, die der Verwendung eines Mikromanipulator für präzise Schablone Abscheidung auf dem MEA Aufnahmebereich besteht. Ein weiteres Problem, das angegangen werden musste besteht in der Verhinderung der PDL Tropfen aus, die unterhalb des ausgerichtet Schablone (sonst die strukturierte Design konnte nicht erhalten werden). Um dies zu tun, nachdem die Schablone ausgerichtet worden ist und bevor die PDL Tropfen darauf das betrachtete Gerät (MEA oder Deckglas) besitzt, um in der Vakuumkammer für eine angemessene Zeitspanne wodurch eine gute Befestigung auf der linken Oberfläche. Das gleiche getan wurde, wenn die PDL Abfall auf der Schablone, um die Luftblasen, die zwischen dem Gerät und dem Dropdown selbst so dass die PDL, um in Kontakt mit der Oberfläche zu bilden, zu beseitigen platziert.
I) das Spin-Coating-Phase, die gewährleisten soll, um "offene Repliken" oder zumindest einen genügend ange: Die kritischen Schritte des beschriebenen Protokoll werden dargestelltständig dünnen Film über die SU8 Strukturen, die leicht mit einer Pinzette entfernt werden kann, ii) die Behandlung der Kultivierungsfläche (Deckglas oder MEA); iii) die Platzierung der PDMS Schablonen darauf; iv) die Beschichtungsphase, da es Fälle gibt, in denen, wenn das PDMS-Maske nicht korrekt gegen das Substrat ein, auf der Dichtung, kann es passieren, dass die Klebstoffprotein führt unter die Maske somit die Strukturierung zu beeinträchtigen. So ist das Reinigen der Deckgläser oder MEAs von primärer Bedeutung, sowie die Ausrichtung des PDMS Schablone. Proper Leistungen dieser beiden Schritte gewährleisten beste Ergebnisse Musterung.
Die Einschränkungen dieser Technik müssen auch sowohl mit dem elektrophysiologischen und Calciumtomographie-Erfassung zu tun. Im ersten Fall wird ein sehr geringer räumlicher Auflösung (4 - 8 Elektroden sind in jedem Modul enthalten) vorhanden ist, was sowohl auf die Abmessungen der Einzelschaltung und dem Zwischenelektroden distance. Im zweiten Fall, die Gefahr besteht nicht, die optimale Zelldichte, die Gewinnung eines zweidimensionalen Zellschicht ermöglicht, wodurch eine Einzelzellauflösung Erfassung.
Diese Strategie, die eine sorgfältige Optimierung der Beschichtung, Montage und Sterilisationsverfahren und die Schaffung eines kundenspezifischen Mikroausrichtungssystem erforderlich, gab uns einige wichtige Vorteile gegenüber bereits berichtet Werke (zB das langfristige Überleben der Zellen, also bis zu 8 Wochen in vitro). Genauer gesagt, es hat uns eine stabiler und zuverlässiger Langzeithaft 24 in Bezug auf Strategien, die auf chemische Strukturierung 23-28.
Das beschriebene Verfahren beruht auf Plattieren kortikalen Zellen auf PDL beschichteten Modulen, die die Selbstorganisation von Netzwerken in neuronale Anordnungen von Axonen und Dendriten verbunden sichert Bündeln. Zur Weitfeld-Kalzium-Imaging des modularen Netto ermöglichenarbeitet mit einer einzigen Zelle Auflösung ist es wesentlich, daß das neuronale System organisiert in einer 2D-Ebene. Daher ist es wichtig, die Dichte der plattierten Zellen optimiert sowohl eine hohe Dichte, Zellhaufen zu vermeiden oder im anderen Extrem Dichte Module niedriger die Zwischenmodul-Verbindungswahrscheinlichkeit verringern.
Obwohl neuronale Gliazellen-Netzwerken in Kultur verlieren ihre in-vivo strukturelle Organisation, sie spontan durch Selbstorganisation aktiv Funktionskreise und bietet die Möglichkeit zur Durchführung von Studien unter kontrollierten Versuchsbedingungen. Die zweidimensionalen modularen neuronalen Netzwerken der in diesem Protokoll beschriebenen funktionell miteinander verbundenen Schaltkreisen zusammengesetzt ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der Dynamik der Kommunikation zwischen Neuronenverbände und die Kapazität von strukturell definierten neuronalen Netzen, um großes Repertoire an Motiven zu generieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Europäischen Projekt BRIANBOW (RP7 Young Explorers unterstützt, möchten die Autoren um Dr. Jacopo Tessadori für nützliche Kommentare zum Manuskript danken und Silvia Chiappalone für ihre Hilfe bei der Erstellung der im Video verwendeten Grafiken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Nalgene vacuum chamber | Thermo | 5305-0609 | |
| Poly-D-lysine PDL | Sigma | P7886 | |
| Silicone grease - SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| Spin coater | Laurell - Technologies Corporation | WS-650-23 | |
| 12-well culture plate | Sigma | CLS3336 | |
| 5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
| TC02 | Multi Channel Systems | ||
| Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
| B-27 | Gibco | 17504044 | |
| glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
| Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com |
| Silicon wafer | microchem | SU8-2075 | Preparation protocol: http://www.microchem.com |
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