Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Design, ytbehandling, Cellular Plating och Odling av Modular neurala nätverk bestående av Funktionellt Inter-anslutna kretsar

Published: April 15, 2015 doi: 10.3791/52572
* These authors contributed equally

Summary

Detta manuskript beskriver ett protokoll för att växa in vitro modulära nätverk bestående av rumsligt begränsade, funktionellt sammankopplade neuronala kretsar. Ett polymert mask används för att mönstra ett proteinskikt för att främja cellulär adhesion över odlingssubstrat. Pläterade nervceller växer på belagda områden upprättande spontana kontakter och uppvisar elektrofysiologiska aktivitet.

Abstract

Hjärnan fungerar genom samordnade aktivering och den dynamiska kommunikation av neuronala församlingar. En stor öppen fråga är hur en stor repertoar av dynamiska motiv, som ligger till grund mest skiftande hjärnfunktioner, kan växa fram ur en fast topologisk och modulär organisation av hjärnkretsar. Jämfört med in vivo-studier av neuronala kretsar som utgör inneboende experimentella svårigheter, in vitro förberedelser erbjuder en mycket större möjlighet att manipulera och sondera de strukturella, dynamiska och kemiska egenskaper experimentella neuronala system. Detta arbete beskriver ett in vitro experimentell metodik som tillåter odling av modulära nätverk som består av rumsligt distinkta, funktionellt sammankopplade neuronala församlingar. Protokollet tillåter styrning av tvådimensionella (2D) arkitektur av neuronala nätverket på olika nivåer av topologisk komplexitet.

Ett önskat nätverk mönstring kan varauppnås både på vanliga täckglas och substrat inbäddade mikroelektrod matriser. Mikrobearbetade strukturer är präglade på en kiselskiva och används för att skapa biokompatibla polymera schabloner, som inkorporerar de negativa särdragen hos den önskade nätverksarkitektur. De schabloner som är placerade på odlingssubstrat under ytbeläggningsförfarande med en molekylskikt för att främja cellulär adhesion. Efter avlägsnande av schablonerna är neuroner pläterade och de spontant omdirigeras till de belagda områdena. Genom att minska den interutrymmet avstånd, är det möjligt att erhålla antingen isolerade eller sammankopplade neuronala kretsar. För att främja cellöverlevnad, cellerna är samodlade med en stödjande neuronala nätverket som ligger vid periferin av odlingsskålen. Elektrofysiologiska och optiska inspelningar av aktiviteten av modulära nät erhålls respektive genom substrat inbäddade mikroelektrod arrayer och kalcium avbildning presenteras. Medan varje modul visar spontuttalanden, globala synkroniseringar, är förekomsten av synkronisering mellan moduler regleras av tätheten av anslutningen bland kretsarna.

Introduction

Experimentella och teoretiska bevis stöder möjligheten att hjärnan fungerar genom samordnad aktivering av cellaggregat 1-5, vilket kan betraktas som dynamiska funktionsenheter som övergående interagerar med varandra, formning och underliggande olika hjärntillstånd. Funktionell modularitet är också beroende av och i samband med den strukturella modulära organisationen av hjärnkretsarna 6,7. Hur funktion och struktur av hjärnkretsar ömsesidigt forma varandra är fortfarande en av de viktigaste öppna frågorna i neurovetenskap. För att ge en djupare förståelse av denna fråga är det viktigt att identifiera optimala experimentella ramar där det är möjligt att ta itu med, åtminstone delvis, dessa frågor. Eftersom kontrollerad manipulation av spatio-temporala dynamik neuronala nätverk i in vivo-försök är utmanande, utvecklingen av in vitro neuronala nätverk modeller är av stort intresse på grund av deras enkla accessibility, övervakning, manipulation och modellering 8,9. Under de senaste åren, in vitro teknik som stöds av avancerade substrat mönstring metoder har tillåtit att förmå neuronala nätverk för att utveckla en rad fördefinierade modulstruktur 3 och studera de funktionella egenskaperna hos nät med ålagts topologier 10. I synnerhet har metoder som nyligen använts för att organisera nätverk genom att införa fysiska begränsningar 4,11. Faktum att studera sambandet mellan struktur och funktion i neuronala nätverk samt att ge en förenklad men trolig representation av samverkande neuronala församlingar bör in vitro-system ger sammankopplade neuronala delpopulationer. Brett studerade 2D homogena neuronala kulturer inte införa några rumsliga begränsningar på självorganiserade emergent ledningar av kretsarna. Därför en möjlig strategi för att forma ett konstlat sätt sammankopplade cell församlingar är att placera olika neuronala populationer i spatially olika områden. Avståndet mellan dessa områden hindrar inte de inter församlingar anslutningar. Detta tillvägagångssätt, samtidigt som en betydande kontroll över nätverks komplexitet, har visat sig ge en rikare repertoar av synkroniseringsmodeller 6,7,12.

För att underlätta en reproducerbar odling av modulära neuronala församlingar, för att ett protokoll montera självorganisering av nätverk i neuronala kluster sammanbinds av axoner och dendriter presenteras och beskrivs. Den polymera strukturen för den fysiska begränsningen av neuronala kulturer har skapats från polydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS är en elastomer i stor utsträckning för biomedicinska applikationer på grund av sin biokompatibilitet, öppenhet och permeabilitet för gaser 13. PDMS är beredd och undantas från mikrobearbetade SU8 2075 14,15 strukturer genom spin-beläggning en flytande PDMS på en "master" som tidigare beskrivits i Jackman et al. 16 THan uppnådde mönstrade neuronala nätverk består av sammankopplade moduler av olika storlek och de har framgångsrikt fått både täck och Micro Elektrod Arrays (MEA) 17-20. Densiteten av förbindelser mellan modulerna kan ändra funktionerna i nätverkssynkroniseringen, från en fullt synkrona nätet, typiskt av enhetliga kulturer, för att transienta tillstånd av synkronisering bland modulerna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Proceduren utfördes enligt NIH standarder för skötsel och användning av försöksdjur och godkändes av Tel-Aviv University Djurvård och användning kommittén (tillståndsnummer - L-14-019).

1. Beredning av instrument och PDMS

  1. Förbered rånet (Table of Materials, eller beställa skivan från ett mikrofabrikation lab), en skalpell och en pincett - behövs inte sterilisering.
  2. Gör poly-D-lysin (PDL) lösning enligt följande villkor: 4 mg / ml i 0,1 M boratbuffert, pH 8, och förvara vid -20 ° C.
  3. Förbered PDMS stenciler enligt följande förfarande:
    1. Förbered polydimetylsiloxan (PDMS, silikon elastomer) genom att blanda ihop basen och härdaren med ett förhållande på 10: 1, rör sedan de två ämnen för ca 5 min.
    2. Placera i vakuumkammare två gånger under 15 minuter varje gång och kontrollera bubblor är borta.
    3. NärPDMS är klar, förbereda spinnbeläggare: öppna kväve rattar för att tillåta gas användning, placera kiselskivan (Figur 1A) på spinner, och använda vakuum för att hindra den från att röra.
    4. Häll PDMS över skivan och aktivera spinnaren under 1 min vid 1000 rpm (skapar cirka 100 ^ m höjd).
    5. Placera brickan på en varm platta vid 100 ° C under 30 minuter.
    6. När PDMS har hårdnat, beskriva stencil gränser med PDMS, använder pasteurpipett. Placera brickan på en varm platta vid 100 ° C under 30 minuter.
    7. När PDMS gränserna har hårdnat, använd en skalpell för att skära stenciler enligt gränserna och dra av kisel stencilen från skivan (en fyrkantig PDMS innehåller ett enda mönster).

2. petriskål och Cover Slip Förberedelse

  1. Förbered 23 mm fyrkant täckglas och rengör dem enligt följande ordning:
    1. Tvätta med destillerat vatten, 70% etanol, och aceton.
    2. Tvätta med isopropanol och snabb torr med kväve.
  2. Placera mönstrade PDMS schabloner på täck, och tryck försiktigt att kontrollera att de är ordentligt fäst vid glasytan. Placera i vakuumkammaren under 15 min.
  3. Drop 1 ml PDL på stencilen. Sätt i täckglas in i vakuumkammaren två gånger under 20 min varje gång, och lämnar PDL O / N för att torka.
  4. Förbered petriskål för att skapa ett stödjande cellnätverk:
    1. Täck ytan på skålen (3,5 cm) med 1 ml PDL för 2 timmar i RT. Ta ut PDL släppa med hjälp av en pipett.
    2. Tvätta med destillerat vatten och låt torka. Placera en mycket liten droppe av silikonfett på varje hörn av täckglas.
  5. Placera täckglas på mitten av petriskålen (dvs., bör PDMS vara vänd uppåt) och tryck lätt att verifiera fastsättning.
  6. Försiktigt bort PDMS från täck med pincett. För sterilisering, utsättas för UV-belysning för 7 min.
le "> 3. Multi-elektrod Array (MEA) Förberedelse

  1. Ren MEA i denna ordning (Table of Materials):
    1. Tvätta med vatten under kranen och låt ligga i en koncentrerad, enzymatisk 3 gånger.
    2. Sonikera i destillerat vatten tre gånger.
    3. Tvätta med destillerat vatten (i huva, 1000 l spets) för 3 gånger och placera under UV i 30 min.
  2. Stöd förberedelse nätverk:
    1. Förbered utformade stödnätverk mögel.
      1. Häll PDMS i en 12-brunnsplatta (22 mm diameter).
      2. När PDMS härdas ta ut formen och med hjälp av en skalpell, skär ett hål i mitten för att skapa en ringform.
      3. Placera en utformad stödnätverk mögel på mitten av MEA (Figur 2A) och täcka resten av ytan med PDL under 2 h vid RT.
    2. Ta bort PDL använder pipett och tvätta med destillerat vatten.
    3. Ta bort mögel och låt torka (Figur 2A). </ Li>
  3. Rikta stencil till MEA på följande sätt:
    1. Placera schablonen på utsedda mikro manipulator. Använd ett inverterat mikroskop för att exakt anpassa mönstrad struktur elektroder, och sänk stencilen tills den är placerad på MEA ytan (Figur 2B).
      Obs: Kontakt med en väl rengjord MEA ger konkurrens vidhäftning mellan PDMS och MEA själv.
    2. Lyft mikromanipulator och om det behövs, använder pincett för att använda en liten mängd av tryck ovanför PDMS för att förhindra den lossnar från MEA.
    3. Tryck försiktigt stencil till MEA ytan, och använda mikroskop för att verifiera att det sitter fast ordentligt, och väl i linje. (Figur 2C-D).
  4. Placera MEA i vakuumkammare i 15 min; sätta en 1 ml droppe PDL på stencilen.
  5. Sätt in vakuumkammare 2 gånger under 20 minuter vardera. Lämna PDL torka O / N i inkubatorn.
  6. Innan plätering, ta bort PDMS stenciler från MEA och tvätta med steril water. Placera under UV-belysning för 7 min.

4. Dissektion och kultur

  1. Förbered kulturer som beskrivs i Herzog et al. 2011 21.

5. Plating

  1. Beräkna antalet celler som krävs för plätering, med användning av en hemocytometer (optimal densitet i enlighet med storleken av kretsen, såsom diskuterats i resultatet).
    1. Se till att räknekammaren (hemocytometer) är ren och placera ett täckglas på den (använd alkohol för att rengöra).
    2. Späd 10 pl av cellsuspensionen i 190 pl plätering medium (utspädning 1:20).
    3. Belastning 10 | il av de utspädda celler på kanten av räknekammare och långsamt pipettera cellerna ut tillåter kammaren att fylla sig själv.
    4. Med användning av ett inverterat mikroskop, visualisera hemocytometer rutnät. Bestäm antalet celler i kammaren genom direkt räkning (friska celler skall vara runda). Räkna cellerna i stora fyrkantiga utan but dem korsar kanterna.
    5. Beräkna koncentrationen av celler:
      Totalt antal celler / 1000 ul = totala räknade celler x utspädningsfaktor x 10 4 (område i hemocytometer).
      Obs: Om exempelvis utspädningsfaktorn var 20 och de totala cellerna räknades var 100:
      100 × 20 × 10 4 = 0,1 x 10 7 celler / 1000 l eller 1 x 10 6/100 pl. För att plattan 0,75 x 10 6 celler, ta 75 ul av cellerna.
  2. Ta det antal celler som behövs för plätering per enkel MEA eller en petriskål, återsuspendera cellerna för att förhindra aggregation, och plattan dem i centrum, på toppen av patternate området (om det behövs, är det möjligt att späda ut cellerna i mediet) . För MEA, placera en 100 l droppe i mitten. För täckglas, placera en 1.000 l droppe i mitten.
  3. Inkubera de strukna cellerna vid 37 ° C under 40 minuter. Lägg plating medium till de pläterade cellerna, upp till 1ml per MEA och 2 ml per täckglas.
  4. Förvara vid 37 ° C och, var 4 dagar, späd med färskt tillväxtmedium berikat med 0,5 Pen-Strep, 2% B-27 och 0,75% glutamax.
  5. Från 6/7 DIV, efter att ha sett kopplingar mellan öarna, späd medium med 10 pl / ml FUDR (25 mg deoxyuridin + 62,5 mg uridin i 12,5 ml MEM (Minimum Essential Medium Eagle)) eller något annat anti-mitotiska medel för att förebygga gliaceller överväxt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En SU8-2075 mögel på en kiselskiva med en funktion tjocklek av ungefär 100 | im användes för att forma PDMS. Mönstret var sammansatt av kvadraterna av flera dimensioner, med en sidolängd och avstånd som varierar mellan 200 och 700 ^ m (Figur 1B). Storleken på torget valdes för att passa synfältet av en 10X (till öar med en sidolängd <800 nm) och en 20X objektiv (till öar med en sidolängd <400 nm). Tre parametrar, nämligen cell plätering densitet, avstånd mellan kretsar, kretsar "storlek är avgörande för att få monolager eller klustrade kretsar samt att införa och forma sin anslutning. Emellertid är dessa parametrar är inte oberoende, eftersom, givet ett fast avstånd mellan två kretsar, sannolikheten för att de spontant upprätta en anslutning ökning med kretsarna 'storlek. I exemplet som diskuteras i detta arbete, för små neuronala moduler av ~ 300 x 300 nm, anslutningaretablerades när avståndet inte var större än ~ 300-400 nm, medan för stora neuronala moduler av ~ 700 x 700 pm, var anslutningar upprättas när avståndet var mindre än ~ 700 nm. I allmänhet, genom att öka avståndet mellan rutorna var det möjligt att ändra sannolikheten att etablera spontant genererade inbördes kopplingar mellan modulerna, som passerar från högt anslutna moduler till isolerade sådana.

Neuronala moduler av ~ 600 x 600 ^ m visas vid 4 dagar in vitro (DIV; figur 3a). Efter några dagar in vitro nervceller ligger huvudsakligen inom de belagda områdena medan det inte är möjligt att observera utvecklade neuronala processer och anslutningar. Tvärtom, vid 14 DIV (Figur 3B-C) neuroner upprätta anslutningar inom och mellan modulerna. Medan större neuronala kretsar i ~ 600 x 600 pm kunde själv organisera sig i monolager (Figur 3A-C), kretsar av smaller dimensioner (t.ex. ~ 300 x 300 nm i figur 3D) tenderade att klustra. Därför, i syfte att erhålla den bästa kalibrering för två-dimensionella kretsar, ströks cellerna med olika densitet som varierar från 0,25 x 06-1 oktober x 10 6 celler / 23 mm täckglas fäst i en 35 mm petriskål. För större kretsar av ~ 700 x 700 um fann vi att 0,75 x 10 6 celler / 23 mm täckglas fäst i en 35 mm petriskål är den optimala tätheten som inducerar bildandet av monolagerkretsar inte förhindra deras spontana sammankoppling (Figur 3C ). Samma resultat av monolager kretsen erhölls i mindre kretsar i ~ 300 x 300 um genom plätering 0,5 x 10 6 celler / 23 mm täckglas fäst i en 35 mm petriskål. I allmänhet, när man överväger cell plätering tätheten, är det viktigt att lyfta fram att, som tidigare diskuterats 7, neuronala och gliaceller har en medfödd tendens att kluster, så en viss grad av clustering är nästan oundviklig efter en tid i odling. Emellertid observerade vi att öka ytan avsedd för den stödjande nätverket skulle öka sannolikheten för kretsar "överlevnad och deras mono-skiktad organisation, förmodligen på grund av en större koncentration av näringsämnen i det extracellulära utrymmet. I varje fall är en trial and error metod som krävs för att identifiera den optimala cell plätering tätheten att skapa monoskiktade kretsar för kalcium avbildning. Var 4 dagar mediet späddes med färskt tillväxtmedium. Från 6/7 DIV, efter att ha sett kopplingar mellan öarna, 10 pl / ml FUDR har lagts för att förhindra gliaceller överväxt.

Figur 4 visar den dynamiska av en modulär nätverk som spelats in med kalcium avbildning (utförd såsom beskrivits i Bonifazi et al. 2013 8). Kalcium- fl uorescence bilder förvärvades med hjälp av en 4X förstoring mål, vilket möjlig övervaka aktiviteten hos hela nätverket (Figure 4A). Analys av kalcium avbildning utfördes såsom beskrivits i Bonifazi et al. 2013 8. I figur 4B raster tomt på kalcium händelserna debut visar spontan aktivitet presenteras (färgerna motsvarar moduler markerade i figur 4A). Kalcium imaging utfördes vid 30 Hz, och bildstorleken är 1000 x 1000 pixlar.

De gröna och rosa modulerna är mycket synkroniserade som visas i raster tomten (Figur 4B) i samförstånd med sina tjocka anslutnings buntar, möjligen motsvarande ett stort antal anslutningar (Figur 4A). De blå och röda moduler är svagt kopplad till de gröna och rosa moduler och därför ibland synkroniseras med dem (Figur 4B). En video av inspelningen finns online (film M1).

Bilden av en modulär nätverk odlas på ett MEA vid 21 DIV visas i figur 5A. Jagn för att få den bästa kalibrering för tvådimensionella kretsar, pläterade vi kortikala celler med olika densitet varierar från 250 x 10 3-500 x 10 3 celler / per MEA. 250 x 10 3 celler / per MEA (30 mm ring) gav bättre resultat när det gäller bildandet av monolager kretsar, utan förhindra deras spontana sammankoppling. När mönstrade neuronala nätverk har uppnåtts på MEA substrat (Figur 5A), elektrofysiologiska aktivitet har övervakats med hjälp av ett kommersiellt system som används för att förvärva och inspelning elektrofysiologiska signaler. Spontan aktivitet av kulturer detekteras med hjälp av Precise Timing Spike Detection (PTSD) algoritm 22.

Figur 5B visar ett raster plot motsvarande 5 min av spontan aktivitet (endast aktiva elektroder är synliga), färgade kodade i enlighet med klusternummer. Genom att titta på dessa tomter är det möjligt att göra kvalitativa bedömningarav aktiviteten hos enstaka kluster och hela nätverket på samma gång. I synnerhet är det möjligt att observera en stark synkronisering bland de verksamheter som registrerats inom varje kluster. En video av en representativ inspelning från mönstrade kulturer över MEA är tillgänglig online (filmen M2).

Figur 1
Figur 1. Kiselskiva. (A) Den kiselskiva (~ 4 tums diameter) som används för att forma PDMS stenciler. Olika SU8 strukturer representerar olika modulära nätverk. (B) representant inslag designen implementeras på en kiselskiva för modulära nät konstruktion. Varje grön fläck definiera en struktur SU8 pelaren och därmed området för en enda modul. De mönster inom den streckade svarta rektangeln motsvarar tre olika schabloner som kan användas på vanliga kvadratodlingstäck av 23 mm sido length. I varje stencil, markerar en asterisk en makroregion för stödjande nätverk. Beroende på avståndet mellan fläckarna, kanske den ändliga storleken krets eller moduler kunna etablera spontana neuronala anslutningar bland dem. Utformningen av de funktioner valdes för att skapa olika modulstorlek och inter modul avstånd för att uppnå isolerade eller sammankopplade neuronala kretsar som skulle kunna passa synfältet i olika objektiva förstoringar (4X, 10X och 20X, synfältet för varje förstoringen är representeras av röda kvadrater). Funktionerna av den streckade svarta rektangeln är utformade för att passa samtidig användning av MEA och kalcium avbildning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2.PDMS strukturer avsättning på en MEA. (A) PDMS formen med en ringform (märkt med röd pil) monterad på en MEA. Formen används för att belägga det område som är avsett att den stödjande neuronala nätverket och belägen vid periferin av odlingsområde (detta begränsas av ringen monterad på MEA och markeras av en grön pil). (B) Inriktning av en PDMS stencil på MEA med hjälp av en mikro manipulator. (C) PDMS stencil deponeras på den MEA efter uppriktning. (D) Bild på en PDMS stencil på MEA med hjälp av en 10x förstoring (inter-elektrodavståndet är 500 nm). Det är möjligt att notera hålen på schablonerna i motsvarighet av elektroderna. Adhesivskiktet gynnar cellulär adhesion kommer endast deponeras på de öppnade områdena. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

GE = "always"> Figur 3
Figur 3. Modulära neuronala nätverk på olika DIV. Ljusa fält bild av kortikala moduler av ~ 600 x 600 um (A) efter 4 DIV och (B) efter 14 DIV. (C) Notera de spontana sammankopplingar mellan kretsarna efter 14 DIV. Celler ströks vid den optimala celltätheten för stora kretsar att organisera sig i monolager, dvs 750 x 10 3 celler / 23 mm täckglas fäst i en 35 mm petriskål. (D) Använda PDMS funktioner i halv storlek och samma cell koncentration, neuronala kretsar organiserade i klustrade strukturer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

highres.jpg "width =" 700 "/>
Figur 4. Kalcium avbildning av modulära nätverk. (A) kortikala celler (18 DIV) laddade med kalciumindikatorn OGB. Olika färger markerar olika moduler. Synfältet är 2 x 2 mm. (B) Raster tomt på spontan aktivitet. De olika färgerna motsvarar cellerna i olika moduler som visas i panelen A. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. MEA inspelning av modulära nätverk. (A) Modular nätverk (kortikalneuroner, 21 DIV) består av 3 olika kretsar som odlas på en 4Q MEA. Neuronala kretsar är avlägsen ~ 600 ^ m sammankopplade till varandra. (B) Rasterdiagram visande 5 min av spontan elektrophysiological aktivitet inspelning. C1, C2 och C3 motsvarar, respektive att det övre vänstra, nedre högra och nedre vänstra klustrets verksamhet, lyfts fram i olika färger. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ett protokoll för att växa 2D modulära neuronala nätverk in vitro består av funktionellt sammankopplade kretsar beskrivs. Förfarandet bygger på mönstring en cellulär vidhäftningsskikt. Mönstring uppnås med PDMS stenciler reproducera den negativa inslag i den önskade nätverksarkitektur. PDMS stenciler definierar de områden där det cellulära klisterskiktet deponeras. När cellerna är pläterade, de spontant samlas för att de belagda öarna och själv organisera sig i aktiva sammankopplade kretsar. Inspelningar av funktionella modulära nätverk som spelats in med MEA och kalcium avbildning presenterades.

Den presenterade protokollet blivit behörigen ändrats jämfört med den ursprungligen följde förfarandet. För det första måste åtgärdas problem med PDMS stenciler "anpassning. Eftersom inriktningen måste uppnås i första försöket (när schablonen har berört ytan, är det inte rekommenderat att flytta den), har denna fråga löstsgenom att överge den manuella förfarandet och väljer en ny metod som består av att använda en mikro manipulator för exakt stencil avsättning på MEA inspelningsområdet. En annan fråga som måste åtgärdas är att hindra PDL droppe från att passera under den linje schablonen (annars mönstrade designen kunde inte erhållas). För att göra detta, när schablonen har anpassats och innan PDL droppe på den, den anses enheten (MEA eller täck) måste lämnas i vakuumkammare för en ordentlig tid vilket ger en bra infästning av det på yta. Samma sak har gjorts när PDL droppe placeras på stencilen för att eliminera luftbubblorna som bildas mellan enheten och släpp sig därmed tillåta PDL att komma i kontakt med ytan.

De kritiska stegen i den beskrivna protokollet representeras av: i) spinnbeläggning fas som bör garantera att få "öppna repliker" eller, åtminstone, en sufficilunda tunn film över SU8 strukturer som lätt kan avlägsnas med hjälp av pincett, ii) behandling av odlingsytan (täckglas eller MEA), iii) placeringen av PDMS stenciler på det, iv) beläggningsfasen eftersom det finns fall i vilken, om PDMS masken inte tätar ordentligt mot substratet på vilket är positionerat, kan det hända att det vidhäftande proteinet passerar under masken sålunda äventyra mönstringen. Så, är rengöringsprocess av täckglas eller MEA av primär betydelse liksom anpassningen av PDMS schablonen. Korrekt föreställningar av dessa två steg säkerställa bästa mönstring resultat.

Begränsningarna av denna teknik har också att göra med både elektrofysiologiska och kalcium avbildning förvärvet. I det första fallet, en mycket låg rumslig upplösning - är (4 8 elektroder ingår i varje modul) närvarande på grund av både dimensioner enda krets och mellan elektrod distance. I det andra fallet, risken består i att inte hitta den optimala celltätheten som möjliggör att erhålla en tvådimensionell cellskiktet, vilket förhindrar en enda cell upplösning förvärvet.

Denna strategi, som krävde en noggrann optimering av beläggningen, montering och steriliseringsförfaranden och skapandet av en anpassad mikroinriktningssystemet, gav oss några stora fördelar med avseende på tidigare rapporterade arbeten (t.ex. den långsiktiga överlevnad i våra celler, dvs upp till 8 veckor in vitro). Specifikt, förutsatt att vi med en mer stabil och pålitlig långsiktig förlossningen 24 med avseende på strategier baserade på kemisk mönstring 23-28.

Det beskrivna förfarandet bygger på plätering kortikala celler på PDL-belagda moduler, som försäkrar den självorganisering av nätverk i neuronala församlingar förenade genom axoner och dendriter buntar. För att möjliggöra brett fält kalcium avbildning av modulära nätetarbetar med en enda cell upplösning, är det väsentligt att det neuronala systemet organiserar in i en 2D-skikt. Därför är det viktigt att optimera densiteten av pläterade celler både för att undvika hög densitet, cellkluster eller vid andra extrema låg densitet moduler som minskar mellanmodul anslutning sannolikhet.

Även neuronala-gliaceller nätverk i kulturen förlorar sin in-vivo organisationsstruktur, de självorganisation till aktiva funktionella kretsar som erbjuder möjligheten att genomföra studier under väl kontrollerade experimentella förhållanden. De tvådimensionella modulära neuronala nätverk som består av funktionellt sammankopplade kretsar som beskrivs i detta protokoll ger ett kraftfullt verktyg för att undersöka dynamiken i kommunikationen mellan neuronala församlingar och kapacitet strukturellt definierade neuronala nätverk för att generera stora repertoar av motiv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Europeiska Project BRIANBOW (FP7 Young Explorers skulle Författarna tacka Dr Jacopo Tessadori för värdefulla synpunkter på manuskriptet, och Silvia Chiappalone för hennes hjälp i att producera de bilder som används i videon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS, Sylgard 184 Dow Corning
Nalgene vacuum chamber Thermo 5305-0609
Poly-D-lysine PDL Sigma P7886
Silicone grease - SILICAID 1010 aidchim Ltd H3375
Spin coater Laurell - Technologies Corporation WS-650-23
12-well culture plate Sigma CLS3336
5-Fluoro-2’-deoxyuridine Sigma F0503
Uridine Sigma U3003
MEA1060-Inv-BC Multi Channel Systems
TC02 Multi Channel Systems
Pen Strep Biological Industries Beit Haemek 03-033-1c
B-27 Gibco 17504044
glutaMAX Gibco 35050-038
MEM Minimum Essential Medium-Eagle Biological Industries Beit Haemek 01-025-1B
Micro Electrode Arrays 4Q Multi Channel Systems 60-4QMEA1000iR-Ti-pr cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com
Silicon wafer microchem SU8-2075 Preparation protocol: http://www.microchem.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buzsaki, G. Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68, 362-385 (2010).
  2. Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. Modular and hierarchically modular organization of brain networks. Frontiers in Neuroscience. 4, 200 (2010).
  3. Levy, O., Ziv, N. E., Marom, S. Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons. European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).
  4. Berdondini, L., et al. A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons. Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).
  5. Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PloS One. 9, e107400 (2014).
  6. Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits. PloS One. 5, e14443 (2010).
  7. Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology. Frontiers in Neuroengineering. 4, 10 (2011).
  8. Bonifazi, P., et al. In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses. Front Neural Circuits. 7, 40 (2013).
  9. Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording. Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).
  10. Marconi, E., et al. Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology. PloS One. 7, e34648 (2012).
  11. Taylor, A. M., Jeon, N. L. Microfluidic and compartmentalized platforms for neurobiological research. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39, 185-200 (2011).
  12. Sorkin, R., et al. Compact self-wiring in cultured neural networks. J Neural Eng. 3, 95-101 (2006).
  13. Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems. Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).
  14. Campo, A. G. C. SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography. Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).
  15. Liu, G. T. Y. Kan Y Fabrication of high-aspect-ratio microstructures using SU8 photoresist. Microsystem Technologies. 11, 343-346 (2005).
  16. Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15, 2973-2984 (1999).
  17. Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 2, 19-31 (1980).
  18. Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro. Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).
  19. Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture. Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).
  20. Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74, 61-66 (1972).
  21. Herzog, N., Shein-Idelson, M., Hanein, Y. Optical validation of in vitro extra-cellular neuronal recordings. J Neural Eng. 8, 056008 (2011).
  22. Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177, 241-249 (2009).
  23. Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab Chip. 9, 404-410 (2009).
  24. Georger, J. H., et al. Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth. Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).
  25. Torimitsu, K., Kawana, A. Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture. Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).
  26. Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks. Medical & Biological Engineering & Computing. 36, 135-141 (1998).
  27. Petrelli, A., et al. Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays. Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).
  28. Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Hippocampal networks on reliable patterned substrates. Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).

Tags

Neurovetenskap , Mönstring PDMS stenciler SU8-2075 kiselskiva kalcium bildbehandling Micro elektrod Array
Design, ytbehandling, Cellular Plating och Odling av Modular neurala nätverk bestående av Funktionellt Inter-anslutna kretsar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kanner, S., Bisio, M., Cohen, G.,More

Kanner, S., Bisio, M., Cohen, G., Goldin, M., Tedesco, M., Hanein, Y., Ben-Jacob, E., Barzilai, A., Chiappalone, M., Bonifazi, P. Design, Surface Treatment, Cellular Plating, and Culturing of Modular Neuronal Networks Composed of Functionally Inter-connected Circuits. J. Vis. Exp. (98), e52572, doi:10.3791/52572 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter