Summary
Bu yazıda mekansal sınırlandırılmış işlevsel birbirine bağlı nöronal devrelerin oluşturduğu nitro modüler ağlarda büyümek için bir protokol açıklamaktadır. Bir polimerik maske kültürleme alt-tabaka üzerine hücresel yapışmayı teşvik etmek için model bir protein tabakası kullanılır. Kaplama nöronlar kaplı alanlarda kendiliğinden bağlantılarının kurulması ve elektrofizyolojik aktivite sergileyen üzerinde büyür.
Abstract
Beyin koordineli aktivasyonu ve nöronal meclisleri dinamik iletişim yoluyla çalışır. Büyük bir açık bir soru en farklı beyin fonksiyonları altında yatan dinamik motifler geniş bir repertuar, beyin devrelerinin sabit topolojik ve modüler organizasyon dışında ortaya nasıl olduğunu. Içsel deneysel zorluklar sunuyoruz nöronal devrelerin in vivo çalışmalar ile karşılaştırıldığında, in vitro hazırlıkları işlemek ve deneysel nöronal sistem, yapısal dinamik ve kimyasal özelliklerini araştırmak için çok daha büyük bir imkanı sunuyoruz. Bu eser uzamsal farklı, işlevsel birbirine nöronal meclisleri tarafından oluşan modüler ağların büyüyen sağlar bir in vitro deneysel yöntem anlatılmaktadır. protokol topolojik farklı karmaşıklık düzeylerinde nöronal ağ iki boyutlu (2D) mimarisini kontrol sağlar.
İstenilen ağ desenlendirme olabilirDüzenli kapak fişleri ve yüzey gömülü mikro elektrod dizileri hem elde etti. Mikroişlenmiş yapılar silikon gofret üzerinde kabartmalı ve istenen ağ mimarisinin özelliklerini olumsuz dahil biyouyumlu polimerik şablonlar oluşturmak için kullanılır. şablonlar hücresel yapışma teşvik etmek için bir molekül tabakası ile yüzey kaplama işlemi sırasında kültür substratlar üzerine yerleştirilir. Kalıpların çıkarılmasından sonra nöronlar plakalanır ve kendiliğinden kaplanmış bölgelere yönlendirilir. Ara bölmesi mesafeye bağlı olarak, bu izole edilmiş ya da birbirine bağlı ya da nöronal devreler elde etmek mümkündür. Hücre yaşamını destekleyen için, hücreler kültür kaplarına çevresine yerleştirilmiş olan bir destek nöronal ağ ile birlikte kültürlenmiştir. Yüzey gömülü mikro elektrot dizileri ve kalsiyum görüntüleme kullanarak sırasıyla elde edilen modüler ağların faaliyet Elektrofizyolojik ve optik kayıtlar sunulmaktadır. Her bir modül bir SPONT gösterirkenaneous küresel eşitleme arası modülü senkronizasyon oluşumu devreleri arasındaki bağlantı yoğunluğu ile düzenlenir.
Introduction
Deneysel ve teorik kanıtlar beyin geçici birbirlerine, şekillendirme ve altta yatan farklı beyin devletlerin etkileşim, dinamik, fonksiyonel birimler olarak kabul edilebilir hücre meclisleri 1-5 koordine aktivasyonu aracılığıyla faaliyet ihtimalini desteklemektedir. Fonksiyonel modülerlik de bağlıdır ve beyin devrelerinin 6,7 yapısal modüler organizasyonu ile ilişkilidir. Nasıl fonksiyonu ve beyin devrelerinin yapısı birbirini şekil hala nörobilim ana açık sorulardan biridir. Bu sorunun daha derin bir anlayış sağlamak için, o ele mümkün olduğu, en azından kısmen, bu sorunları en iyi deneysel çerçeveler belirlenmesi önemlidir. In vivo deneylerde nöronal ağların uzay-zamansal dinamikleri manipülasyon kontrollü yana in vitro nöronal ağlar modellerinin geliştirilmesi nedeniyle kolay acc önemli ilgi olduğunu, zorluessibility, izleme, manipülasyon ve 8,9 modelleme. Son yıllarda, gelişmiş alt tabaka desenlendirme yöntemleri ile desteklenen in vitro teknolojileri önceden tanımlanmış modüler yapılar 3 bir dizi geliştirmek ve dayatılan topolojilere 10 ile ağların fonksiyonel özelliklerini incelemek için nöron ağları teşvik sağladı. Özellikle, son zamanlarda yöntemler fiziksel kısıtlamaları 4,11 empoze ederek ağları düzenlemek için kullanıldı. Nitekim, nöronal ağlarda yapı ve fonksiyon arasındaki bağlantıyı incelemek ve nöronal meclisleri etkileşim basitleştirilmiş ama inandırıcı temsilini sağlamak üzere, in vitro sistemler birbirine bağlı nöronal alt-popülasyonların sağlamalıdır. Yaygın okudu 2D homojen nöronal kültürlerin devrelerin kendi kendine organize acil kablo üzerinde herhangi bir mekansal kısıtlamalar getirmez. Bu nedenle olası bir yaklaşım tükürdü farklı nöronal popülasyonlarının konumlandırmak için yapay birbirine hücre derlemeleri bir şekleially farklı alanlar. Bu alanlar arasında mesafe arası meclisleri bağlantıları engellemez. Ağ karmaşıklığını önemli bir kontrol sağlarken bu yaklaşım, senkronizasyon model 6,7,12 daha zengin bir repertuar temin etmek üzere gösterilmiştir.
Modüler nöronal düzeneklerinin tekrarlanabilir bir kültürlenmesini kolaylaştırmak için bir protokol verilmektedir ve açıklanan akson ve dendritlerin ile bağlantılı nöronal kümeler halinde ağların kendi kendine organizasyonu monte etmek. nöronal kültürler fiziksel hapsi için bir polimerik yapı polydimtheylsiloxane (PDMS) için oluşturuldu. PDMS yaygın gazların 13 olan biyouyumluluk, şeffaflık ve geçirgenlik nedeniyle biyomedikal uygulamalarda kullanılan bir elastomer. PDMS spin kaplama Jackman ve arkadaşları, daha önce tarif edildiği gibi, bir "ana" üzerine bir sıvı PDMS. 16 T 2075 14,15 yapı hazırlanmış ve Mikroişlenmiş SU8 hariç tutulmuşturO farklı boyuttaki birbirine bağlı modüllerden oluşmaktadır nöron ağları desenli başararak ve başarılı hem lamelleri ve Mikro Elektrot Diziler (ÇÇA'lar) 17-20 elde edilmiştir. modüller arasındaki bağlantıların yoğunluğu modülleri arasında senkronizasyon geçici devletlere, üniforma kültürlerin tipik bir tam senkronize ağdan, ağ senkronizasyon özelliklerini değiştirebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedür laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için NIH standartlarına uygun olarak yapıldığını ve Tel-Aviv Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (izin numarası - L-14-019) tarafından onaylandı.
Araçların ve PDMS 1. Hazırlık
- Gofret hazırlayın (Malzeme Tablo, ya da bir mikroimalat laboratuarından gofret sipariş), bir neşter ve bir cımbız - sterilizasyon gerekli değildir.
- Aşağıdaki koşullara göre poli-D-lisin (PDL) çözeltisi oluşturunuz: 4 mg / 0.1 M borat tamponu içinde mi, pH 8, ve mağaza -20 ° C'de ilave edildi.
- Aşağıdaki prosedüre göre PDMS kalıpları Hazırlama:
- Taban ve 10 bir oranı ile sertleştirme ajanı karıştırılarak bir polidimetilsiloksan (PDMS, silikon elastomer) hazırlanması: 1, daha sonra yaklaşık 5 dakika boyunca 2 maddeler karıştırılmıştır.
- 15 dakika boyunca iki kez vakum odasında her zaman yerleştirin ve doğrulamak kabarcıklar gitti.
- Ne ZamanGaz kullanımını sağlamak için açık azot düğmeleri döndürücü silikon gofret (Şekil 1A) yerleştirin ve hareket etmesini engellemek için vakum kullanın: PDMS Spin kaplayıcı hazırlamak, hazır.
- Gofret üzerinde PDMS dökün ve 1.000 rpm'de 1 dakika eğiren aktive (yaklaşık 100 mikron yükseklik oluşturur).
- 30 dakika boyunca 100 ° C'de bir sıcak plaka üzerinde gofret yerleştirin.
- PDMS sertleştikten sonra, Pasteur pipeti kullanarak, PDMS ile şablon sınırları özetlemektedir. 30 dakika boyunca 100 ° C'de bir sıcak plaka üzerinde gofret yerleştirin.
- PDMS sınırları sertleşmiş zaman, sınırları göre şablonlar kesmek ve gofret silikon şablon kalkmasına bir neşter kullanabilirsiniz (tek desen içeren bir kare PDMS).
2. Petri Dish ve Kapak Kayma Hazırlık
- Aşağıdaki sıraya göre 23 mm kare cam kapak fişleri hazırlayın ve bunları temizleyin:
- Damıtılmış su,% 70 etanol ve aseton ile yıkanır.
- Azot ile izopropanol ve hızlı kuru ile yıkayın.
- Lamel desenli PDMS şablonlar yerleştirin ve yavaşça onlar sıkıca cam yüzeye bağlı olduğunu doğrulamak için düğmesine basın. 15 dakika boyunca vakum odasına koyun.
- Şablonun üzerine PDL 1 ml bırakın. Iki kez 20 dakika her zaman için vakum odasına lamel yerleştirin ve kurumaya PDL O / N bırakın.
- Bir destekleyici hücre ağı oluşturmak için Petri kabı hazırlayın:
- RT, 2 saat boyunca PDL 1 ml çanak (3.5 cm) yüzeyini kaplar. Bir pipet kullanarak PDL damla çıkarın.
- Damıtılmış suyla yıkayın ve kurumaya bırakın. Lamel her köşesinde silikon gres çok küçük bir damla yerleştirin.
- Eki doğrulamak için yavaşça Petri kabındaki (yani, PDMS yukarı dönük olmalıdır) ve basın merkezine lamel yerleştirin.
- Yavaşça cımbız kullanarak lamel PDMS çıkarın. Sterilizasyon için, 7 dakika UV aydınlatma maruz.
- Bu düzenin (Malzeme Tablo) Temiz MEA:
- Konsantre, enzimatik deterjan içinde musluk ve sonikasyon altında su ile 3 kez yıkanır.
- Distile su 3 kez sonikasyon.
- 30 dakika UV altında distile 3 kez (kaput, 1.000 ul ucu), su ve yer ile yıkayın.
- Ağ hazırlanmasını desteklemek:
- Tasarlanmış destek ağı kalıp hazırlayın.
- 12 gözlü bir levha (22 mm çapında) içine PDMS dökün.
- PDMS kalıp çıkarmak ve bir neşter kullanılarak sertleştirilmiş zaman, bir halka şekli oluşturmak için ortasında bir delik kesti.
- MEA (Şekil 2A) ortasına tasarlanmış bir destek ağı kalıp yerleştirilir ve oda sıcaklığında 2 saat süre ile PDL yüzeyde geri kalan kapak.
- Pipet kullanılarak PDL çıkarın ve damıtılmış su ile yıkayın.
- Kalıp çıkarmak ve (Şekil 2A) kurumaya bırakın. </ Li>
- Tasarlanmış destek ağı kalıp hazırlayın.
- Şu şekilde MEA için şablonu hizalayın:
- Belirlenen mikro manipülatör üzerine şablonu yerleştirin. Doğru elektrotlara desenli yapısı hizalamak, ve MEA yüzeyine (Şekil 2B) üzerine yerleştirilir kadar şablonu düşürmek için bir ters mikroskop kullanın.
Not: Bir de temizlenmiş MEA ile irtibat PDMS ve MEA kendisi arasında rekabet yapışma sağlar. - Mikromanipülatör kaldırın ve gerekirse, bu MEA ayrılmakta önlemek için PDMS üzerindeki basıncın az miktarda uygulamak için cımbız kullanın.
- Yavaşça MEA yüzeyine şablonu basın ve sıkıca bağlanmış ve iyi hizalanmış doğrulamak için mikroskop kullanın. (Şekil 2C-D).
- Belirlenen mikro manipülatör üzerine şablonu yerleştirin. Doğru elektrotlara desenli yapısı hizalamak, ve MEA yüzeyine (Şekil 2B) üzerine yerleştirilir kadar şablonu düşürmek için bir ters mikroskop kullanın.
- 15 dakika boyunca vakum odasında MEA yerleştirin; şablonun üzerine PDL 1 ml damla koydu.
- 20 dakika her vakum odasına 2 kez yerleştirin. Inkübatör O / N kurumaya bırakın PDL.
- Kaplama öncesi, ÇÇA PDMS şablonlar kaldırmak ve w steril kullanarak yıkayınater. 7 dakika boyunca UV ışıması altında yerleştirin.
4. Diseksiyon ve Kültür
- Herzog ve ark. 2011 21 de tarif edildiği gibi kültür hazırlayın.
5. Kaplama
- Hemasitometre (sonuç olarak tartışıldığı gibi devrenin büyüklüğüne göre uygun yoğunluğu) kullanılarak, kaplama için gerekli olan hücre sayısını hesaplayın.
- Emin sayma odası (hemasitometre) Marka temiz ve bunun üzerine bir kapak kayma (temizlemek için kullanılması alkol) yerleştirin.
- Orta (seyreltme 1:20) kaplama 190 ul hücre süspansiyonu, 10 ul seyreltin.
- Yük 10 sayma odasının kenarına seyreltilmiş hücre ul ve yavaş yavaş kendini doldurmak için odasına izin hücreleri pipetle.
- Bir ters mikroskop kullanarak, hemositometre ızgara görselleştirmek. Direkt sayım ile bölme içindeki hücrelerin sayısı (sağlıklı hücreleri yuvarlak olmalı) belirler. Büyük kare witho içinde hücreleri saymakkenarları kapısı olan ut.
- Hücre konsantrasyonu hesaplanır:
Hücre sayısı / 1000 ul = seyreltme faktörü × 10 4 (hemasitometre alanı) sayılır Toplam hücreler.
Not: Örneğin, eğer seyreltme faktörü 20 ve sayılan toplam hücre 100 idi:
100 × 20 × 10 4 = 0.1 x 10 7 hücre / 1.000 ul veya 1 x 10 6/100 ul. 0.75 x 10 6 hücre plaka için, hücrelerin üzerinden 75 ul alır.
- Tek MEA ya da Petri kabı başına kaplama için gerekli hücrelerin sayısını alın toplanmasını önlemek için hücrelerin tekrar süspansiyon ve patternate alanının üstünde, merkezde bunları plaka (gerekirse, bu ortamda hücreleri sulandırmak için mümkün) . MEA için, ortasında bir 100 ul damla yerleştirin. Kapak kayma için, ortada bir 1.000 ul damla yerleştirin.
- 40 dakika boyunca 37 ° C'de kaplama hücreleri inkübe edin. 1 kadar, kaplama hücrelere kaplama orta ekleMEA başına ml kapak kayma başına 2 ml.
- 0.5 Pen-Strep,% 2 B-27 ve% 0.75 glutamax zenginleştirilmiş taze büyüme ortamı ile inceltilmiş, her 4 günde bir, 37 ° C'de tutun.
- Veya glial önlemek için herhangi bir diğer anti-mitotik ajan 6/7 DIV itibaren, adalar arasındaki bağlantıları gördükten sonra, 10 ul orta sulandırmak / ml FUDR (12.5 ml MEM (Minimum Essential Medium Kartal) 25 mg dezoksiuridin + 62.5 mg üridin) büyümesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yaklaşık 100 um bir özelliği kalınlığı olan bir silikon gofret üzerinde bir SU8-2075 kalıp PDMS şekillendirmek için kullanılmıştır. desen yan uzunluk ve mesafe 200 ila 700 um (Şekil 1B) değişen, birkaç boyutta karelerinin oluşmaktadır. meydanın büyüklüğü ve 20X objektif (yan uzunluğu <400 mikron olan adalar için) (bir kenar uzunluğu <800 mikron olan adalar için) 10X görüş alanını uyacak şekilde seçildi. Üç parametre, devre arasında yani hücre kaplama yoğunluğu, mesafe, devrelerin boyutu monokatmanlar veya kümelenmiş devreleri elde yanı sıra empoze ve bağlantı şekli için belirleyici olan. Bununla birlikte, bu parametreler kendiliğinden devrelerin boyutu olan bir bağlantı artış oluşturmak olasılık, iki devre arasında sabit bir mesafe verilen beri bağımsız değildir. ~ 300 küçük nöronal modülleri için, bu çalışmada ele alınan örnekte x 300 mm, bağlantılarımesafe ~ 300 den büyük olmayan zaman kuruldu - 400 mikron iken büyük nöronal modülleri için ~ mesafe küçük ~ 700 mikron iken 700 x 700 mm, bağlantı kuruldu. Genel olarak, kareler arasındaki mesafeyi artırarak İzole olanlar son derece bağlı modüllerden geçen modülleri arasında kendiliğinden üretilen arası bağlantıları kurmak için olasılık değiştirmek mümkün oldu.
~ 600 x 600 um, in vitro olarak 4 gün gösterilmektedir nöronal modülleri (DIV Şekil 3A). In vitro nöronlar birkaç gün çoğunlukla kaplı alanlar içinde bulunan sonra gelişmiş nöronal süreçleri ve bağlantıları gözlemlemek mümkün değil iken. 14 DIV de tersine, (Şekil 3B-C) nöronlar içinde ve modülleri arasındaki bağlantıları kurmak. ~ 600 x 600 mikron geniş nöronal devreler (Şekil 3A-C), devreleri Smalle tek tabakaları içine kendini organize etmiş olabilir amar boyutları (örneğin, ~ 300 Şekil 3D x 300 mm) küme eğiliminde. Bu nedenle, iki boyutlu devreler için en iyi kalibrasyon elde etmek için, hücreler farklı yoğunluk, bir 35 mm Petri kabı bağlanmış 0.25 x 10 6 6 hücre / 23 10 x 1 mm kapak astar arasında değişen ile kaplandı. ~ 700 x 700 mm daha büyük devreler için biz 35 mm Petri kabındaki bağlı 0.75 x 10 6 hücre / 23 mm kapak kayma tek tabakalı devreleri kendi spontane arası bağlantıyı engelliyor değil oluşumunu uyarır optimum yoğunluk (Şekil 3C olduğunu bulundu ). tek tabakalı devrenin aynı sonucu 35 mm'lik bir Petri tabağına bağlı 0.5 x 10 6 hücre / 23 mm kapak slip kaplama ile x 300 um ~ 300 daha küçük devre elde edilmiştir. Hücre kaplama yoğunluğu göz önüne alındığında, daha önce 7, nöronal ve glial hücreler kümelenme doğuştan gelen bir eğilimi var tartışıldığı gibi genel olarak, bu, vurgulamak cl nedenle bazı derecesi önemlidirustering kültüründe bir süre sonra hemen hemen kaçınılmazdır. Ancak, biz destek ağa mukadder alanı artan, muhtemelen dışı alanda besinlerin daha büyük bir konsantrasyon nedeniyle, devrelerin hayatta kalma ve mono-katmanlı örgüt olasılığını artıracağı görülmektedir. Herhangi bir durumda, deneme yanılma yaklaşımı, kalsiyum görüntüleme için tek tabakalı devreler oluşturmak için en uygun hücre kaplama yoğunluğu belirlemek için gereklidir. Her 4 günde bir ortamı, taze büyüme ortamı ile seyreltilmiştir. 6/7 itibaren DIV, adalar arasındaki bağlantıları gördükten sonra, 10 ul / ml FUDR glial büyümeyi engellemek için eklenmiştir.
Şekil 4, modüler ağının dinamik (Bonifazi ve ark. 2013 8'de tarif edildiği gibi gerçekleştirilir) kalsiyum görüntüleme kullanılarak kaydedildi gösterir. Kalsiyum fl uorescence görüntüleri Figur (tüm ağ etkinliği izleme etkin bir 4X büyütmeli objektif kullanılarak elde edilmiştirE 4A). Bonifazi ve ark. 2013 8'de tarif edildiği gibi kalsiyum görüntüleme analizi yapıldı. Kalsiyum olaylar Şekil 4B raster arsa spontan faaliyet gösteren (renk Şekil 4A işaretlenmiş modülleri karşılık) sunulmuştur başlangıçlı. Kalsiyum görüntüleme 30 Hz gerçekleştirildi ve görüntü boyutu 1,000 x 1,000 piksel.
muhtemelen bağlantıların çok sayıda (Şekil 4A) tekabül eden kendi kalınlığında bağlantı demetleri ile uyumlu raster arsa (Şekil 4B) 'de gösterildiği gibi, yeşil, pembe modülleri, son derece senkronize edilir. mavi ve kırmızı modülleri zayıf, yeşil ve pembe modüllere bağlı ve bu nedenle zaman zaman onları (Şekil 4B) ile senkronize edilir. Kayıt bir video online (film M1) 'dir.
21 DIV bir MEA üzerinde büyümüş olan modüler bir ağ görüntüsü Şekil 5A'da gösterilmiştir. Benİki-boyutlu devreler için iyi kalibrasyon elde etmek n emri, farklı yoğunluk MEA başına / 500 x 10 3 hücrelerine 250 x 10 3 arasında değişen ile kortikal hücreler kaplama. Onların kendiliğinden arası bağlantıyı engelliyor değil ise 250 x 10 3 hücre / MEA başına (30 mm halka), tek tabaka devrelerin oluşumu açısından daha iyi sonuçlar vermiştir. Bir kez desenli nöronal ağlar elektrofizyolojik aktivite edinme ve elektrofizyolojik sinyaller kayıt için kullanılan bir ticari sistem kullanılarak izlenir olmuştur ÇÇA'lar substrat (Şekil 5A) üzerinde elde edilmiştir. Kültürlerin spontan aktivite kesin zamanlama başak Algılama (PTSD) algoritması 22 kullanılarak tespit edilir.
Şekil 5B, küme sayısına göre kodlanmış renkli spontan aktivite, 5 dakika (yalnızca aktif elektrotlar görebilir) karşılık gelen bir tarama grafiğini göstermektedir. Bu araziler bakarak, niteliksel değerlendirmeler yapmak mümkündürTek kümelerin ve aynı zamanda tüm ağ aktivitesinin. Özellikle, her küme içinde kaydedilen faaliyetler arasında güçlü bir senkronizasyon gözlemlemek mümkündür. MEA üzerinde desenli kültürlerden gelen bir temsilci kayıt bir video online (film M2) 'dir.
1. Silikon gofret Şekil. (A) silikon gofret (~ 4 inç çaplı) PDMS şablonlar kalıp kullanılır. Farklı SU8 yapılar, farklı modüler ağları temsil eder. Modüler ağlar yapımı için bir silikon gofret üzerinde uygulanan (B) Temsilcisi özellik tasarımı. Her yeşil nokta, tek bir modül için bir SU8 ayağı yapısını ve dolayısıyla bölgeyi tanımlar. kesik siyah dikdörtgen içinde tasarımlar 23 mm yan len standart kare kültür lamelleri kullanılabilir üç farklı şablonlar karşılıkgth. Her şablon olarak, bir yıldız destek ağı için bir makro-bölge işaretler. Noktalar arasındaki uzaklığa bağlı olarak, sonlu boyutlu devre veya modüller aralarında spontan nöronal bağlantıları kurmak mümkün olabilir. özellikler tasarım farklı objektif büyütme içinde (4X, 10X ve 20X görüş alanını sığabilir izole veya birbirine nöronal devreleri ulaşmak için farklı modül boyutu ve inter-modül mesafe yaratmak için seçildi, her büyütme için görüş alanı Kırmızı kareler ile temsil edilir). kesik siyah dikdörtgenin dışında özellikleri MEA ve kalsiyum görüntüleme eş zamanlı kullanımını uyacak şekilde tasarlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2.PDMS yapılar MEA üzerinde birikme. (Kırmızı ok ile işaretli) bir halka şekli ile (A) PDMS kalıp MEA üzerine monte edilmiş. PDMS şablonun kalıp destek nöronal ağa gönderilen ve kültür alanının çevresinde bulunan alanı kaplamak için kullanılan (bu halkalar ile sınırlıdır MEA üzerine monte edilir ve yeşil bir ok ile gösterilmiştir) edilir. (B) Hizalama MEA bir mikro manipülatör kullanarak. yönlendirmeden sonra MEA tevdi (C) PDMS şablon. 10x büyütme kullanarak MEA bir PDMS şablon (D) Resmi (inter-elektrot mesafesi 500 mikron). Bu elektrotların yazışmalarda şablonlar üzerinde delikler dikkat etmek mümkündür. Hücresel yapışma lehine yapışkan tabaka sadece açılan alanlarda yatırılacaktır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
ge = "always"> 
Farklı DIV de 3. Modüler nöronal ağlar Şekil. ~ 600 x 600μm (A) kortikal modülleri 14 DIV. (C) sonra 4 DIV ve (B) sonrası Aydınlık alan görüntüsü 14 DIV sonra devreler arasında spontan bağlantıları unutmayın. Hücreler, büyük devreler tek katmanlar halinde organize etmek için en uygun hücre yoğunluğunda kaplanmıştır, yani yarı boyutunda aynı hücre konsantrasyonu PDMS özelliklerini kullanarak 750 x 10 3 hücreleri, bir 35 mm Petri kabı bağlanmış / 23 mm kapak fişi. (D) kümelenmiş yapılar halinde organize nöronal devreler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
highres.jpg "width =" 700 "/>
Modüler ağların Şekil 4. Kalsiyum görüntüleme. Kalsiyum göstergesi OGB yüklü (A) Kortikal hücreleri (18 DIV). Farklı renkler, farklı modülleri işaretleyin. Görüş alanı. 2 x 2 mm spontan aktivite (B) Raster arsa. Panel A'da görüldüğü gibi farklı renkler, farklı modüllerin içindeki hücrelerin karşılık bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Modüler ağların Şekil 5. MEA kaydı. (A) 4Q MEA üzerinde büyümüş 3 farklı devrelerden oluşan modüler bir ağ (kortikal nöronlar, 21 DIV). Nöronal devreler ~ birbirlerine 600 mikron birbirine uzak bulunmaktadır. (B) Raster arsa spontan elektrikli 5 dk gösterenophysiological etkinlik kaydı. C1, C2 ve C3 sol üst, alt, sağ ve sol alt kümenin faaliyetlerine, farklı renklerle vurgulanır, sırasıyla, gelmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fonksiyonel inter-connected devrelerden oluşan in vitro 2D modüler nöron ağları büyümeye bir protokol tarif edilmektedir. işlem, bir hücresel yapışkan tabaka desenlendirme dayanmaktadır. Desenlendirme PDMS şablonlar istenen ağ mimarisinin olumsuz özelliği üreyen ile elde edilir. PDMS şablonlar hücresel yapışkan tabaka yatırılır alanları tanımlar. Hücreler kaplama sonra, kendiliğinden kaplanmış adalar montaj ve aktif inter-connected devreler halinde kendini organize. Anlaşmalardan doğan ve kalsiyum görüntüleme kullanılarak kaydedilen fonksiyonel modüler ağların Kayıtlar sunuldu.
sunulan protokol usulüne başlangıçta takip prosedüre göre modifiye edilmiştir. Öncelikle, PDMS şablonlar 'uyum sorunları ele gerekiyordu. Hizalama (şablon yüzeyi dokundu sonra, onu taşınmaya tavsiye edilmez) ilk denemede elde edilmesi olduğundan, bu sorun aşılmıştırmanuel prosedürü terk ve MEA kayıt alanında hassas şablon birikimi için bir mikro manipülatör kullanarak oluşan yeni bir yöntem için gözle. Ele alınması gerekiyordu bir başka konu hizalanmış şablon altından geçmesini PDL damla önlemede oluşur (aksi desenli tasarım elde edilemedi). Şablon hizalanmış ve üzerinde PDL damla, kabul cihazı (MEA veya lamel) koymadan önce bir kez, bunu yapmak için böylece üzerinde bunun iyi bir bağlanmasını sağlayan zaman uygun bir süre için vakum odasına bırakılması için vardır Yüzey. PDL açılan cihazı ve damla kendisi böylece PDL yüzeyi ile temasa izin arasında formu hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak için şablonun üzerine konulduğunda aynı yapılmıştır.
i) garanti etmelidir spin kaplama aşaması "açık kopyaları" almak için ya da, en azından, bir yeterliliktir: açıklanan protokol kritik adımlar ile temsil edilmektedirKolayca cımbız kullanarak silinebilir SU8 yapılar üzerinde ently ince film ii) kültür yüzeyi (kapak kayma veya MEA) tedavisi iii) üzerinde PDMS şablonlar yerleştirilmesi; iv) olgu kaplama aşaması vardır çünkü olan PDMS maskesi konumlandırıldığı alt-tabakaya karşı tam sızdırmazlık durumunda, bu maske, böylece model oluşturmanın ödün altında yapışkan proteini geçtiği gerçekleşebilir. Yani, kapak fişleri veya ÇÇA temizleme işlemi birincil öneme yanı sıra PDMS şablon uyum olduğunu. Bu iki adım Uygun performansları iyi desenleme sonuçlar sağlar.
Bu tekniğin sınırlamalar elektrofizyolojik ve kalsiyum görüntüleme edinimi hem yapmak da var. İlk durumda, çok düşük bir uzamsal çözünürlük (4-8 elektrot her modül dahildir) bağlı tek bir devrenin boyutları ve elektrotlar arası Distanc hem de mevcut olduğuör. İkinci durumda ise, riski bir tek hücre çözünürlüğü edinimi önlenmesi, iki boyutlu bir hücresel tabakanın elde edilmesine izin verir uygun hücre yoğunluğu bulma oluşur.
Daha önce (işleri rapor için kaplama, montaj ve sterilizasyon prosedürleri ve özel mikro-hizalama sisteminin oluşturulması dikkatli optimizasyonu gerekli Bu strateji, saygı ile bize bazı önemli avantajlar verdi örneğin, bizim hücrelerinin uzun süreli sağkalım, yani, yukarı) in vitro 8 hafta için. Özellikle, kimyasal desenlendirme 23-28 dayalı stratejiler açısından daha istikrarlı ve güvenilir uzun vadeli hapsi 24 ile sağladı.
açıklanan prosedür akson ile bağlantılı nöronal meclisleri içine ağların öz-örgütlenmesini sağlar ve demetleri dendritlerindeki PDL-kaplı modülleri, kortikal hücrelerin kaplama dayanır. Modüler net geniş alan kalsiyum görüntüleme izin vermek içinTek bir hücre çözünürlük ile birlikte çalışır, bu nöronal sistemi 2 boyutlu tabaka halinde organize esastır. Bu nedenle kaplama hücrelerin yoğunluğu optimize etmek hem de yüksek yoğunluklu, hücresel kümeleri önlemek veya arası modül bağlantısı olasılığını azaltmak diğer aşırı düşük yoğunluklu modülleri de önemlidir.
Kültür nöronal-glial ağları in vivo yapısal organizasyon kaybetmek rağmen, kendiliğinden iyi kontrol deneysel koşullar altında çalışmalarını yürütmek imkanı sunan aktif fonksiyonel devreler halinde kendini organize. Bu protokol açıklanan fonksiyonel inter-connected devrelerden oluşan iki boyutlu modüler nöronal ağlar motifleri geniş bir repertuvara oluşturmak için nöronal meclislerinin arasında iletişim dinamiklerini ve yapısal olarak tanımlanmış nöronal ağlar kapasitesini araştırmak için güçlü bir araç sağlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Avrupa Projesi BRIANBOW (FP7- Genç kaşifler tarafından desteklenen, yazarlar yazının yararlı yorumlar için Dr. Jacopo Tessadori teşekkür etmek istiyorum, ve video kullanılan grafik üretiminde ona yardım için Silvia Chiappalone olur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Nalgene vacuum chamber | Thermo | 5305-0609 | |
| Poly-D-lysine PDL | Sigma | P7886 | |
| Silicone grease - SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| Spin coater | Laurell - Technologies Corporation | WS-650-23 | |
| 12-well culture plate | Sigma | CLS3336 | |
| 5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
| TC02 | Multi Channel Systems | ||
| Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
| B-27 | Gibco | 17504044 | |
| glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
| Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com |
| Silicon wafer | microchem | SU8-2075 | Preparation protocol: http://www.microchem.com |
References
- Buzsaki, G. Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68, 362-385 (2010).
- Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. Modular and hierarchically modular organization of brain networks. Frontiers in Neuroscience. 4, 200 (2010).
- Levy, O., Ziv, N. E., Marom, S. Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons. European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).
- Berdondini, L., et al. A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons. Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).
- Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PloS One. 9, e107400 (2014).
- Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits. PloS One. 5, e14443 (2010).
- Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology. Frontiers in Neuroengineering. 4, 10 (2011).
- Bonifazi, P., et al. In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses. Front Neural Circuits. 7, 40 (2013).
- Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording. Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).
- Marconi, E., et al. Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology. PloS One. 7, e34648 (2012).
- Taylor, A. M., Jeon, N. L. Microfluidic and compartmentalized platforms for neurobiological research. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39, 185-200 (2011).
- Sorkin, R., et al. Compact self-wiring in cultured neural networks. J Neural Eng. 3, 95-101 (2006).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems. Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).
- Campo, A. G. C. SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography. Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).
- Liu, G. T. Y. Kan Y Fabrication of high-aspect-ratio microstructures using SU8 photoresist. Microsystem Technologies. 11, 343-346 (2005).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15, 2973-2984 (1999).
- Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 2, 19-31 (1980).
- Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro. Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).
- Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture. Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).
- Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74, 61-66 (1972).
- Herzog, N., Shein-Idelson, M., Hanein, Y. Optical validation of in vitro extra-cellular neuronal recordings. J Neural Eng. 8, 056008 (2011).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177, 241-249 (2009).
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab Chip. 9, 404-410 (2009).
- Georger, J. H., et al. Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth. Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).
- Torimitsu, K., Kawana, A. Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture. Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).
- Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks. Medical & Biological Engineering & Computing. 36, 135-141 (1998).
- Petrelli, A., et al. Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays. Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).
- Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Hippocampal networks on reliable patterned substrates. Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).
