Summary
Dette håndskrift beskriver en protokol til at vokse in vitro modulære netværk bestående af rumligt begrænset, funktionelt indbyrdes forbundne neuronale kredsløb. En polymer maske anvendes til at mønsteret et protein lag for at fremme cellulær adhæsion over dyrkning substrat. Belagte neuroner vokse på coatede områder oprettelse spontane forbindelser og udviser elektrofysiologisk aktivitet.
Abstract
Hjernen fungerer via den koordinerede aktivering og den dynamiske kommunikation af neuronforsamlinger. En større åbent spørgsmål er, hvordan et stort repertoire af dynamiske motiver, der ligger til grund mest forskelligartede hjernefunktioner kan opstå ud af en fast topologisk og modulær organisering af hjernens kredsløb. Sammenlignet med in vivo undersøgelser af neuronale kredsløb, som udgør iboende eksperimentelle vanskeligheder in vitro præparater tilbyder en langt større mulighed for at manipulere og sonde de strukturelle, dynamiske og kemiske egenskaber af eksperimentelle neuronale systemer. Dette arbejde beskriver en in vitro eksperimentel metode, der tillader dyrkning af modulære netværk bestående af rumligt adskilte, funktionelt sammenhængende neuronforsamlinger. Protokollen tillader styring af todimensionale (2D) arkitektur af den neuronale netværk på forskellige niveauer af topologiske kompleksitet.
En ønskede netværk mønster kan væreopnået både på almindelige dækglas og substrat indlejret mikro elektrode arrays. Mikrobearbejdet strukturer er præget på en siliciumskive og bruges til at skabe biokompatible polymere stencils, der inkorporerer de negative træk ved den ønskede netværksarkitektur. De stencils er placeret på dyrkning substrater under overfladebelægningen procedure med et molekylært lag for at fremme cellulær adhæsion. Efter fjernelse af stencils, er neuroner belagt og de spontant omdirigeret til de belagte områder. Ved at reducere den indbyrdes rum afstand, er det muligt at opnå enten isolerede eller sammenkoblede neuronale kredsløb. For at fremme celleoverlevelse celler co-dyrket med et understøttende neuronal net, der er placeret ved periferien af dyrkningsskålen. Elektrofysiologiske og optiske optagelser af aktiviteten af modulære netværk opnået henholdsvis ved hjælp af substrat indlejret mikro elektrodesæt og calcium imaging præsenteres. Mens hvert modul viser spontaneous globale synkroniseringer, er forekomsten af inter-modul synkronisering reguleret af tætheden af forbindelsen mellem kredsløb.
Introduction
Eksperimentelle og teoretiske beviser støtter muligheden for, at hjernen fungerer ved koordineret aktivering af celle samlinger 1-5, som kan betragtes som dynamiske funktionelle enheder, der forbigående interagere med hinanden, forme og underliggende forskellige hjerne stater. Funktionel modularitet er også afhængig af og forbundet med den strukturelle modulære organisering af hjernens kredsløb 6,7. Hvordan funktion og struktur hjernens kredsløb form gensidigt hinanden er stadig en af de vigtigste åbne spørgsmål i neurovidenskab. At give en dybere forståelse af dette spørgsmål, er det vigtigt at identificere optimale eksperimentelle rammer, hvor det er muligt at tage fat, i det mindste delvist, disse spørgsmål. Siden kontrolleret manipulation af spatio-tidsmæssige dynamik neuronale netværk i in vivo-forsøg er udfordrende, udvikling af in vitro-modeller neuronale netværk er af væsentlig interesse på grund af deres let accessibility, overvågning, manipulation og modellering 8,9. I de senere år har in vitro teknologier understøttes af avancerede substrat mønsterdannende metoder lov til at fremkalde neurale netværk til at udvikle en række foruddefinerede modulkonstruktioner 3 og studere de funktionelle egenskaber af netværk med pålagte topologier 10. Især blev metoder nylig bruges til at organisere netværk ved at pålægge fysiske begrænsninger 4,11. Faktisk, for at studere sammenhængen mellem struktur og funktion i neuronale netværk og give en forenklet, men plausibel repræsentation af interagerende neuronforsamlinger bør in vitro systemer giver indbyrdes forbundne neuronale delpopulationer. Vidt studeret 2D homogene neuronkulturer ikke pålægger rumlige begrænsninger på selvorganiseret emergent ledningsføring af kredsløbene. Derfor er en mulig tilgang til at forme kunstigt forbundne celle forsamlinger er at positionere forskellige neuronale populationer i spyttedeially adskilte områder. Afstanden mellem disse områder er ikke til hinder inter forsamlinger tilslutninger. Denne tilgang, samtidig med at en betydelig kontrol over netværk kompleksitet, har vist sig at give en rigere repertoire af synkronisering modeller 6,7,12.
For at lette en reproducerbar dyrkning af modulære neuronforsamlinger, at en protokol samle selvorganisering af netværk i neuronale klynger forbundet af axoner og dendritter præsenteres og beskrives. Den polymere struktur for fysisk indeslutning af neuronale kulturer er blevet skabt fra polydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS er en elastomer vid udstrækning anvendes til biomedicinske anvendelser på grund af sin biokompatibilitet, gennemsigtighed og permeabilitet for gasser 13. PDMS fremstilles og udelukket fra mikrobearbejdet SU8 2075 14,15 strukturer ved spin-coating af en flydende PDMS på en "master" som beskrevet tidligere i Jackman et al. 16 THan opnåede mønstrede neuronale netværk er sammensat af indbyrdes forbundne moduler af forskellig størrelse, og de er med held blevet opnået på begge dækglas og Micro Elektrode Arrays (MEA) 17-20. Tætheden af forbindelser mellem modulerne kan ændre funktioner af netværket synkronisering fra en fuldt synkroniseret netværk, typisk af ensartede kulturer, til forbigående tilstande af synkronisering mellem moduler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Proceduren blev udført i overensstemmelse med NIH standarder for pasning og anvendelse af forsøgsdyr og blev godkendt af Tel-Aviv University Animal Care og brug Udvalg (tilladelsens nummer - L-14-019).
1. Fremstilling af instrumenter og PDMS
- Forbered wafer (Table of Materials, eller bestille skiven fra en mikrofabrikation lab), en skalpel og en pincet - sterilisation er ikke nødvendigt.
- Gør poly-D-lysin (PDL) opløsning ifølge de følgende betingelser: 4 mg / ml i 0,1 M boratbuffer, pH 8, og opbevares ved -20 ° C.
- Forbered PDMS stencils efter følgende procedure:
- Forbered polydimethylsiloxan (PDMS, silikoneelastomer) ved at sammenblande basen og hærdningsmidlet med et forhold på 10: 1, derefter omrøres 2 stoffer til ca. 5 min.
- Sted i vakuumkammer to gange i 15 minutter hver gang og kontrollere bobler er væk.
- HvornårPDMS er klar, forberede spin-coater: åbne nitrogen drejeknapper til at tillade brugen gas placere siliciumskiven (figur 1A) på spinner, og bruge vakuum for at forhindre det i at bevæge sig.
- Hæld PDMS løbet wafer og aktivere spinderen i 1 minut ved 1000 rpm (skaber ca. 100 um højde).
- Placer wafer på en varm plade ved 100 ° C i 30 minutter.
- Når PDMS er hærdet, skitsere stencil grænser med PDMS, ved hjælp af Pasteur-pipette. Placer wafer på en varm plade ved 100 ° C i 30 minutter.
- Når PDMS grænser er hærdet, skal du bruge en skalpel til at skære stencils i henhold til de grænser og skrælle silicium stencil fra skiven (en kvadratisk PDMS indeholder et enkelt mønster).
2. petriskål og dækglas Forberedelse
- Forbered 23 mm firkantet glas dækglas og rengør dem efter følgende rækkefølge:
- Vaskes med destilleret vand, 70% ethanol og acetone.
- Vask med isopropanol og hurtigt tør med nitrogen.
- Placer mønstrede PDMS stencils på dækglas, og tryk forsigtigt for at kontrollere, at de er fast bundet til glasoverfladen. Placer i vakuumkammer i 15 min.
- Drop 1 ml PDL på stencil. Sæt dækglasset i vakuumkammeret to gange i 20 minutter hver gang, og efterlade PDL O / N at tørre.
- Forbered petriskål til at skabe et understøttende celle netværk:
- Dække overfladen af skålen (3,5 cm) med 1 ml PDL i 2 timer i stuetemperatur. Fjern PDL drop ved hjælp af en pipette.
- Vask med destilleret vand og lad det tørre. Placer en meget lille dråbe silikone fedt på hvert hjørne af dækglasset.
- Placer dækglasset på midten af petriskålen (dvs. bør PDMS vende opad), og tryk forsigtigt for at kontrollere vedhæftning.
- Fjern forsigtigt PDMS fra dækglasset med en pincet. For sterilisering, udsættes for UV-belysning i 7 min.
- Clean MEA i denne rækkefølge (Table of Materials):
- Vask med vand under vandhanen og soniker i en koncentreret, enzymatisk rengøringsmiddel 3 gange.
- Sonikeres i destilleret vand 3 gange.
- Vaskes med destilleret vand (i hætte, 1.000 pi tip) 3 gange og sted under UV i 30 minutter.
- Støtte forberedelse netværk:
- Forbered designet støttenetværk skimmel.
- Hæld PDMS i en 12-brønds plade (diameter 22 mm).
- Når PDMS hærdes tage formen og ved hjælp af en skalpel skæres et hul i midten til at skabe en ringform.
- Placer en designet støtte netværk mug på midten af MEA (figur 2A) og dække resten af overfladen med PDL i 2 timer ved stuetemperatur.
- Fjern PDL hjælp pipette og vaskes med destilleret vand.
- Fjern formen og lad det tørre (figur 2A). </ Li>
- Forbered designet støttenetværk skimmel.
- Juster stencil til MEA på følgende måde:
- Placer stencil på udpegede mikro manipulator. Brug en omvendt mikroskop til præcist tilpasse mønstret struktur til elektroder, og sænk stencil, indtil den er placeret på MEA overflade (figur 2B).
Bemærk: Kontakt med et godt rengøres MEA giver konkurrencedygtig vedhæftning mellem PDMS og MEA selv. - Løft mikromanipulator og om nødvendigt bruge pincet til at anvende en lille mængde af tryk over de PDMS at forhindre det afmonterer fra MEA.
- Tryk forsigtigt stencil til MEA overflade, og brug mikroskop for at kontrollere den er solidt fastgjort og godt tilpasset. (Figur 2C-D).
- Placer stencil på udpegede mikro manipulator. Brug en omvendt mikroskop til præcist tilpasse mønstret struktur til elektroder, og sænk stencil, indtil den er placeret på MEA overflade (figur 2B).
- Placer MEA i vakuumkammer i 15 minutter; sætte en 1 ml dråbe PDL på stencil.
- Indsæt i vakuumkammer 2 gange 20 minutter hver. Lad PDL tørre O / N i inkubatoren.
- Før plating, fjerne PDMS stencils fra MEA og vask under anvendelse af sterilt water. Placer under UV-belysning i 7 min.
4. Dissektion og Kultur
- Forbered kulturer som beskrevet i Herzog et al. 2011 21.
5. Plating
- Beregn antal celler, der er nødvendige for plating, anvendelse af et hæmocytometer (optimal tæthed i forhold til størrelsen af kredsløbet som beskrevet i resultat).
- Sørg for, at tællekammer (hæmocytometer) er ren og placere et dækglas på det (alkohol til at rense).
- Fortynd 10 pi af cellesuspensionen i 190 pi udpladningsmedium (fortynding 1:20).
- Load 10 pi af den fortyndede celler på kanten af tællekammer og langsomt pipettere cellerne ud tillade kammeret at udfylde selv.
- Anvendelse af et omvendt mikroskop, visualisere hæmocytometer nettet. Bestem antallet af celler i kammeret ved direkte tælling (raske celler skal være runde). Tæl celler i store firkantede without dem krydse kanterne.
- Beregn koncentrationen af celler:
Totale antal celler / 1000 pi = totale celler tælles × fortyndingsfaktor x 10 4 (område af hæmocytometer).
Bemærk: For eksempel, hvis fortyndingsfaktoren var 20 og de totale celler tælles var 100:
100 × 20 × 10 4 = 0,1 x 10 7 celler / 1.000 pi eller 1 x 10 6/100 pi. For at pladen 0,75 x 10 6 celler, tage 75 pi ud af cellerne.
- Tag antallet af celler, der er nødvendige for udpladning per enkelt MEA eller en petriskål, resuspenderes cellerne til at forhindre aggregering, og pladen dem i centrum, på toppen af patternate (hvis nødvendigt, er det muligt at fortynde cellerne i medium) . For MEA, placere en 100 pi dråbe i midten. For dækglas, placere en 1.000 pi fald i midten.
- Inkuber de udpladede celler ved 37 ° C i 40 min. Føj plating medium til de udpladede celler, op til 1ml pr MEA og 2 ml pr dækglas.
- Hold ved 37 ° C, og hver 4 dage, fortyndes med frisk vækstmedium beriget med 0,5 Pen-Strep, 2% B-27 og 0,75% Glutamax.
- Fra 6/7 DIV, efter at have set forbindelser mellem øerne, fortyndes medium med 10 pl / ml FUDR (25 mg deoxyuridin + 62,5 mg uridin i 12,5 ml MEM (Minimum Essential Medium Eagle)) eller enhver anden antimitotisk middel til at forhindre glial tilgroning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En SU8-2075 mug på en siliciumskive med en funktion tykkelse på ca. 100 um blev anvendt til at forme PDMS. Mønsteret bestod af kvadrater af flere dimensioner, med en sidelængde og afstand varierer mellem 200 og 700 um (figur 1B). Størrelsen af pladsen blev valgt til at passe til synsfeltet af en 10X (for øer med en sidelængde <800 um) og en 20 x objektiv (for øer med en sidelængde <400 um). Tre parametre, nemlig celle udpladningsdensitet, distance mellem kredsløb, kredsløb 'størrelse er afgørende for at opnå monolag eller klynger kredsløb samt at indføre og forme deres tilslutning. Men disse parametre er ikke uafhængige, eftersom givet en fast afstand mellem to kredsløb, sandsynligheden for, at de spontant etablere en forbindelse stigning med kredsløbene 'størrelse. I eksemplet diskuteret i dette arbejde, til små neuronale moduler ~ 300 x 300 um, tilslutningerblev etableret, når afstanden var ikke større end ~ 300-400 um, mens for store neuronale moduler ~ 700 x 700 um, blev forbindelser etableres, når afstanden var mindre end ~ 700 um. I almindelighed, ved at øge afstanden mellem kvadrater var det muligt at ændre sandsynligheden for at etablere spontant genererede indbyrdes forbindelser mellem modulerne, der passerer fra stærkt forbundne moduler til isolerede dem.
Neuronal moduler ~ 600 x 600 um er vist ved 4 dage in vitro (DIV, figur 3A). Efter nogle dage in vitro neuroner er for det meste placeret i de belagte områder, mens det ikke er muligt at observere udviklede neuronale processer og forbindelser. Tværtimod ved 14 DIV (figur 3B-C) neuroner oprette forbindelser inden for og blandt moduler. Mens større neuronale kredsløb ~ 600 x 600 um kan selv organisere sig i monolag (figur 3A-C), kredsløb af Smaller dimensioner (f.eks ~ 300 x 300 um i figur 3D) tendens til at klynge. Derfor, for at opnå den bedste kalibrering for todimensionale kredsløb, blev celler udpladet med forskellig densitet varierer fra 0,25 x 06-1 oktober x 10 6 celler / 23 mm dækglas fastgjort i en 35 mm petriskål. For større kredsløb af ~ 700 x 700 um fandt vi, at 0,75 x 10 6 celler / 23 mm dækglas fastgjort i en 35 mm petriskål er den optimale tæthed, som inducerer dannelsen af monolag kredsløb ikke hindrer, at de spontane sammenkobling (figur 3C ). Det samme resultat af monolag kredsløb blev opnået i mindre kredsløb ~ 300 x 300 um ved udpladning 0,5 x 10 6 celler / 23 mm dækglas fastgjort i en 35 mm petriskål. I almindelighed, når man overvejer celleudpladning tæthed, er det vigtigt at fremhæve, at som tidligere beskrevet 7, neuronale og gliale celler har en medfødt tendens til at klynge, så en vis grad af clustering er næsten uundgåelig efter nogen tid i kultur. Observerede vi imidlertid, at forøgelse af område bestemt til den understøttende net vil øge sandsynligheden for kredsløb overlevelse og deres mono-lags organisation, sandsynligvis på grund af en større koncentration af næringsstoffer i det ekstracellulære rum. I alle tilfælde kræves en trial and error tilgang til at identificere den optimale celle udpladningsdensitet at skabe mono-lags kredsløb for calcium imaging. Hver 4 dage blev mediet fortyndet med frisk vækstmedium. Fra 6/7 DIV, efter at have set forbindelser mellem øerne, 10 pl / ml FUDR er blevet tilføjet til forhindre glial tilgroning.
Figur 4 viser den dynamiske af et modulært netværk registreres ved hjælp calcium imaging (udført som beskrevet i Bonifazi et al. 2013 8). Calcium- fl uorescence billeder blev erhvervet ved hjælp af en 4X forstørrelse mål, som gjorde det muligt at overvåge aktiviteten af hele netværket (Figure 4A). Analyse af calcium billeddannelse blev udført som beskrevet i Bonifazi et al. 2013 8. I figur 4B raster plot af calcium begivenheder debut udviser spontan aktivitet præsenteres (farver svarer til moduler, der er markeret i figur 4A). Calcium imaging blev udført ved 30 Hz, og billedstørrelsen er 1.000 x 1.000 pixels.
De grønne og lyserøde moduler er stærkt synkroniseret som vist i raster plot (figur 4B) i overensstemmelse med deres tykke forbinder bundter, eventuelt svarende til et stort antal forbindelser (figur 4A). De blå og røde moduler er svagt forbundet med den grønne og lyserøde moduler og derfor lejlighedsvis synkroniseret med dem (figur 4B). En video af optagelsen er tilgængelig online (film M1).
Billedet af en modulær netværk dyrket på en MEA ved 21 DIV er vist i figur 5A. Jegn for at opnå den bedste kalibrering for todimensionale kredsløb vi belagt kortikale celler med forskellig densitet varierer fra 250 x 10 3 500 x 10 3 celler / per MEA. 250 x 10 3 celler / per MEA (30 mm ring) gav bedre resultater i form af dannelsen af monolag kredsløb, mens ikke forhindrer deres spontane sammenkobling. Når mønstrede neuronale netværk er nået på MEA substrat (figur 5A), elektrofysiologiske aktivitet er blevet overvåget ved hjælp af et kommercielt system, der anvendes til at erhverve og registrere elektrofysiologiske signaler. Spontan aktivitet af kulturer påvises ved hjælp af præcis timing Spike Detection (PTSD) algoritme 22.
Figur 5B viser en raster plot svarende til 5 min af spontan aktivitet (kun aktive elektroder er synlige), farvet kodet efter klyngen nummer. Ved at se på disse grunde, er det muligt at foretage kvalitative vurderingeraf aktiviteten af enkelte klynger og hele nettet på samme tid. Især er det muligt at observere en stærk synkronisering mellem de aktiviteter, der er registreret i hver klynge. En video af en repræsentativ optagelse fra mønstrede kulturer i MEA er tilgængelig online (film M2).
Figur 1. Silicon wafer. (A) siliciumskiven (~ 4 inch diameter) anvendes til at støbe PDMS stencils. Forskellige SU8 strukturer repræsenterer forskellige modulære netværk. (B) Repræsentant funktion design implementeres på en silicium wafer for modulære netværk konstruktion. Hver grøn plet definere en SU8 struktur søjle og derfor området til et enkelt modul. Motiverne i den stiplede sorte rektangel svarer til tre forskellige stencils, der kan anvendes på standard firkantede kultur dækglas på 23 mm side LENGTH. I hver stencil, markerer en stjerne en makro-region for det støttende netværk. Afhængigt af afstanden mellem pletterne, kan endelig størrelse kredsløb eller moduler kunne etablere spontane neuronale forbindelser blandt dem. Udformningen af de funktioner, blev valgt til at skabe forskellige modul størrelse og inter-modul afstand for at opnå isolerede eller indbyrdes forbundne neurale kredsløb, som kunne passe synsfeltet i forskellige objektive forstørrelser (4X, 10X og 20X, synsfeltet for hver forstørrelse repræsenteret ved de røde firkanter). De funktioner ud af den stiplede sorte firkant er designet til at passe samtidig anvendelse af MEA og calcium billeddannelse. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2.PDMS strukturer afsætning på en MEA. (A) PDMS støbeform med en ringform (markeret med rød pil) monteret på en MEA. Formen anvendes til at coate det område bestemt til den understøttende neuronal net og placeret ved periferien af dyrkningen området (dette er begrænset af ringen monteret på MEA og markeret med grøn pil). (B) justering af en PDMS stencil på MEA ved hjælp af en mikro manipulator. (C) PDMS stencil aflejret på den MEA efter justering. (D) Billede af en PDMS stencil på MEA ved hjælp af en 10x forstørrelse (inter-elektrode afstand er 500 um). Det er muligt at notere hullerne på stencils i korrespondance med elektroderne. Det klæbende lag begunstige cellulær vedhæftning vil kun deponeres på de åbnede områder. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
GE = "altid"> 
Figur 3. Modular neuronale netværk på forskellige DIV. Bright felt billede af kortikale moduler af ~ 600 x 600μm (A) efter 4 DIV og (B) efter 14 DIV. (C) Bemærk de spontane sammenkoblinger mellem kredsløbene efter 14 DIV. Celler blev udpladet på optimal celledensitet til store kredsløb for at organisere sig i monolag, dvs. 750 x 10 3 celler / 23 mm dækglas fastgjort i en 35 mm petriskål. (D) under anvendelse af PDMS funktioner i halv størrelse og samme cellekoncentration, neuronale kredsløb organiseret i klynger strukturer. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
highres.jpg "width =" 700 "/>
Figur 4. Calcium imaging af modulære netværk. (A) Kortikale celler (18 DIV) lastet med calcium indikator OGB. Forskellige farver markere forskellige moduler. Synsfeltet er 2 x 2 mm. (B) Raster plot af spontan aktivitet. De forskellige farver svarer til cellerne i forskellige moduler, som vist i panel A. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. MEA optagelse af modulære netværk. (A) Modular netværk (corticale neuroner, 21 DIV) består af 3 særskilte kredsløb dyrket på en 4Q MEA. Neurale kredsløb er fjernt ~ 600 um sammenkoblet med hinanden. (B) Raster plot, der viser 5 min af spontan strømophysiological aktivitet optagelse. C1, C2 og C3 svarer henholdsvis øverste venstre, nederst til højre og nederste venstre klyngens aktiviteter, fremhævet i forskellige farver. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En protokol til at vokse 2D modulære neuronale netværk in vitro består af funktionelt indbyrdes forbundne kredsløb beskrives. Proceduren er baseret på mønstring et cellulært klæbelag. Mønsterdannelse opnås med PDMS stencils gengive negative træk ved den ønskede netværksarkitektur. PDMS stencils definerer de områder, hvor det cellulære klæbelag deponeres. Når cellerne er belagt, de spontant samle de coatede øer og selv-organisere til aktive indbyrdes forbundne kredsløb. Optagelser af funktionelle modulære netværk optaget med multilaterale miljøaftaler og calcium billeddannelse blev præsenteret.
Den præsenterede protokol er blevet behørigt ændret i forhold til den oprindeligt fulgte procedure. For det første er problemer med PDMS stencils 'justering skulle løses. Da tilpasningen skal nås i første forsøg (når stencilen har rørt overfladen, anbefales det ikke at flytte det), er dette problem blevet løstved at opgive den manuelle procedure og vælger en ny metode, som består i at bruge en mikro manipulator for præcis stencil aflejring på MEA optagelse området. Et andet spørgsmål, der skulle behandles består i at undgå PDL drop i at passere under linje stencil (ellers mønstrede design ikke kunne opnås). For at gøre dette, når stencil er blevet justeret og før du sætter PDL slip på det, den betragtede enhed (MEA eller dækglas) skal efterlades i vakuumkammer for en ordentlig tid og derved sikre et godt fastgørelse af det på overflade. Det samme er sket, når PDL dråbe anbringes på stencil for at fjerne de luftbobler, som dannes mellem enheden og drop selv således at PDL at komme i kontakt med overfladen.
De kritiske trin i den beskrevne protokol er repræsenteret ved: i) spincoating fase, der skal sikre at få "open replikaer" eller i det mindste en sufficiladende tynd film over SU8 strukturer, der let kan fjernes med en pincet, ii) behandling af dyrkningen overflade (dækglas eller MEA) iii) anbringelse af PDMS stencils på det; iv) coating fase, da der er tilfælde hvor, hvis PDMS masken ikke tætne effektivt mod det substrat, på hvilket er placeret, kan det ske, at den klæbende protein passerer under masken således kompromittere mønsterdannelse. Så renseprocessen af dækglas eller multilaterale miljøaftaler er af største betydning, samt tilpasningen af PDMS stencil. Ordentlig opførelser af disse to trin sikre de bedste mønsterdannende resultater.
Begrænsningerne i denne teknik har også at gøre med både elektrofysiologiske og calcium imaging købet. I det første tilfælde en meget lav rumlig opløsning (4-8 elektroder er inkluderet i hvert modul) er til stede på grund af både dimensionerne af det indre kredsløb og inter-elektrode distance. I det andet tilfælde er risikoen består i ikke at finde den optimale celledensitet, der tillader opnåelse af et todimensionalt cellulære lag, og dermed forhindre en enkelt erhvervelse celle opløsning.
Denne strategi, som krævede en omhyggelig optimering af belægningen, montage og sterilisering procedurer og oprettelsen af en brugerdefineret mikro-justering-system, gav os nogle store fordele med hensyn til tidligere rapporterede værker (f.eks den langsigtede overlevelse af vores celler, dvs. op til 8 uger in vitro). Konkret er det givet os en mere stabil og pålidelig langsigtet indespærring 24 med hensyn til strategier baseret på kemisk mønster 23-28.
Den beskrevne fremgangsmåde er afhængig af plating kortikale celler på PDL-belagte moduler, der sikrer selvorganisering af netværk i neuronforsamlinger forbundet af axoner og dendritter bundter. Hvis du vil tillade bredt felt calcium billeddannelse af den modulære netarbejder med en enkelt celle opløsning, er det vigtigt, at den neuronale systemet organiserer i en 2D-lag. Derfor er det vigtigt at optimere tætheden af belagte celler både for at undgå høj densitet, cellulære klynger eller på de andre ekstreme lav tæthed moduler, der reducerer indbyrdes modultilslutning sandsynlighed.
Selvom neuronal-glial netværk i kultur mister deres in vivo organisatoriske struktur, de spontant selv organisere sig i aktive funktionelle kredsløb, der tilbyder muligheden for at gennemføre undersøgelser under velkontrollerede forsøgsbetingelser. De to dimensionelle modulære neuronale netværk bestående af funktionelt indbyrdes forbundne kredsløb beskrevet i denne protokol giver et effektivt værktøj til at undersøge dynamikken i kommunikation blandt neuronforsamlinger og kapaciteten af strukturelt definerede neuronale netværk til at generere store repertoire af motiver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af det europæiske projekt BRIANBOW (FP7- Young Explorers vil Forfatterne takker Dr. Jacopo Tessadori til nyttige kommentarer til manuskriptet, og Silvia Chiappalone for hendes hjælp i produktion af grafik, der anvendes i videoen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Nalgene vacuum chamber | Thermo | 5305-0609 | |
| Poly-D-lysine PDL | Sigma | P7886 | |
| Silicone grease - SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| Spin coater | Laurell - Technologies Corporation | WS-650-23 | |
| 12-well culture plate | Sigma | CLS3336 | |
| 5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
| TC02 | Multi Channel Systems | ||
| Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
| B-27 | Gibco | 17504044 | |
| glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
| Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com |
| Silicon wafer | microchem | SU8-2075 | Preparation protocol: http://www.microchem.com |
References
- Buzsaki, G. Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68, 362-385 (2010).
- Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. Modular and hierarchically modular organization of brain networks. Frontiers in Neuroscience. 4, 200 (2010).
- Levy, O., Ziv, N. E., Marom, S. Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons. European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).
- Berdondini, L., et al. A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons. Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).
- Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PloS One. 9, e107400 (2014).
- Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits. PloS One. 5, e14443 (2010).
- Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology. Frontiers in Neuroengineering. 4, 10 (2011).
- Bonifazi, P., et al. In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses. Front Neural Circuits. 7, 40 (2013).
- Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording. Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).
- Marconi, E., et al. Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology. PloS One. 7, e34648 (2012).
- Taylor, A. M., Jeon, N. L. Microfluidic and compartmentalized platforms for neurobiological research. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39, 185-200 (2011).
- Sorkin, R., et al. Compact self-wiring in cultured neural networks. J Neural Eng. 3, 95-101 (2006).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems. Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).
- Campo, A. G. C. SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography. Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).
- Liu, G. T. Y. Kan Y Fabrication of high-aspect-ratio microstructures using SU8 photoresist. Microsystem Technologies. 11, 343-346 (2005).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15, 2973-2984 (1999).
- Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 2, 19-31 (1980).
- Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro. Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).
- Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture. Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).
- Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74, 61-66 (1972).
- Herzog, N., Shein-Idelson, M., Hanein, Y. Optical validation of in vitro extra-cellular neuronal recordings. J Neural Eng. 8, 056008 (2011).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177, 241-249 (2009).
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab Chip. 9, 404-410 (2009).
- Georger, J. H., et al. Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth. Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).
- Torimitsu, K., Kawana, A. Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture. Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).
- Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks. Medical & Biological Engineering & Computing. 36, 135-141 (1998).
- Petrelli, A., et al. Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays. Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).
- Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Hippocampal networks on reliable patterned substrates. Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).
