Summary
Ce manuscrit décrit un protocole de croître dans les réseaux modulaires in vitro consistant en l'espace confiné, circuits neuronaux fonctionnellement interconnectés. Un masque de polymère est utilisé pour motif une couche de protéines pour favoriser l'adhérence cellulaire sur le substrat de culture. Plaqués neurones poussent sur les zones revêtues établissant des connexions spontanées et présentant une activité électrophysiologique.
Abstract
Le cerveau fonctionne par l'activation coordonnée et la communication dynamique des assemblées de neurones. Une question majeure est de savoir comment ouvert un vaste répertoire de motifs dynamiques, qui sous-tendent les fonctions cérébrales les plus diverses, peut émerger d'une organisation topologique fixe et modulaire des circuits du cerveau. Par rapport aux études de circuits neuronaux in vivo qui présentent des difficultés expérimentales intrinsèques, les préparations in vitro offrent une possibilité beaucoup plus grande à manipuler et sonder les propriétés structurelles, dynamiques et chimiques des systèmes neuronaux expérimentales. Ce travail décrit une méthodologie expérimentale in vitro qui permet croissante des réseaux modulaires composés par les assemblées de neurones spatialement distincts, fonctionnellement interconnectés. Le protocole permet de contrôler les deux dimensions (2D), l'architecture du réseau neuronal à différents niveaux de complexité topologique.
Une structuration de réseau désiré peut êtreréalisé à la fois sur des lamelles régulières et substrat intégré tableaux micro-électrodes. Structures micro-usinées sont gaufrées sur une tranche de silicium et utilisés pour créer des pochoirs polymères biocompatibles, qui incorporent les caractéristiques négatives de l'architecture de réseau souhaitée. Les pochoirs sont placés sur des substrats de culture au cours de la procédure de revêtement de surface d'une couche moléculaire pour favoriser l'adhérence cellulaire. Après élimination des pochoirs, les neurones sont étalées et ils spontanément redirigées vers les zones revêtues. En diminuant la distance inter-compartiment, il est possible d'obtenir des circuits neuronaux isolées ou reliées entre elles. Pour favoriser la survie des cellules, les cellules sont co-cultivées avec un réseau neuronal de support, qui est situé à la périphérie de la boîte de culture. Des enregistrements électrophysiologiques et optiques de l'activité de réseaux modulaires respectivement obtenus à l'aide de substrats micro intégré réseaux d'électrodes et d'imagerie de calcium sont présentés. Bien que chaque module présente spontsynchronisations mondiaux aneous, l'apparition de synchronisation inter-module est réglementée par la densité de connexion entre les circuits.
Introduction
Preuves expérimentales et théoriques soutiennent la possibilité que le cerveau fonctionne par l'activation coordonnée des agencements de piles 1-5, qui peut être considéré comme unités fonctionnelles dynamiques qui interagissent de façon transitoire avec l'autre, mise en forme et les différents états sous-jacents du cerveau. Modularité fonctionnelle dépend également et associé à l'organisation modulaire de la structure des circuits cérébraux 6,7. Comment la fonction et la structure des circuits cérébraux façonnent mutuellement est encore l'une des principales questions ouvertes en neurosciences. Afin de fournir une meilleure compréhension de cette question, il est important d'identifier les cadres expérimentales optimales où il est possible de répondre, au moins partiellement, ces questions. Depuis contrôlée manipulation de la dynamique spatio-temporelles des réseaux neuronaux dans des expériences in vivo est difficile, le développement de modèles in vitro de réseaux neuronaux est d'un grand intérêt en raison de leur acc facileessibility, la surveillance, la manipulation et la modélisation de 8,9. Au cours des dernières années, dans les technologies appuyées par des méthodes in vitro substrat de modelage avancées ont permis d'induire réseaux neuronaux pour développer une gamme de structures modulaires prédéfinis 3 et d'étudier les propriétés fonctionnelles des réseaux avec des topologies imposées 10. En particulier, les méthodes ont récemment été utilisés pour organiser des réseaux en imposant des contraintes 4,11 physique. En effet, pour étudier le lien entre la structure et la fonction dans les réseaux neuronaux et de fournir une représentation simplifiée mais plausibles d'interagir assemblées de neurones, les systèmes in vitro doivent fournir des sous-populations neuronales interconnectées. 2D cultures neuronales homogènes largement étudiés ne imposent pas de contraintes spatiales sur le câblage des circuits émergente auto-organisée. Par conséquent, une approche possible pour façonner assemblages de cellules interconnectées artificiellement est de positionner différentes populations neuronales dans naissainially zones distinctes. La distance entre ces zones ne empêche pas les assemblées inter connexions. Cette approche, tout en assurant un contrôle considérable sur la complexité du réseau, a été montré pour fournir un répertoire plus riche de modèles de synchronisation 6,7,12.
Afin de faciliter une culture reproductible des assemblées de neurones modulaires, un protocole d'assembler l'auto-organisation des réseaux neuronaux en groupes reliés par des axones et dendrites est présentée et décrite. La structure polymère pour le confinement physique des cultures de neurones a été créé à partir polydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS est un élastomère largement utilisé pour des applications biomédicales en raison de sa biocompatibilité, la transparence et la 13 perméabilité aux gaz. Le PDMS est préparé et exclu de la micro-usiné SU8 2075 14,15 structures par spin-coating un PDMS liquides sur un «maître» comme décrit précédemment dans Jackman et al. 16 TIl a réalisé modelé réseaux neuronaux sont composés de modules interconnectés de taille différente et ils ont été obtenus avec succès sur les deux lamelles et Micro Arrays électrodes (AME) 17-20. La densité des connexions entre les modules peut changer les caractéristiques de la synchronisation du réseau, à partir d'un réseau entièrement synchronisée, typique des cultures homogènes, à des états transitoires de synchronisation entre modules.
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Protocol
La procédure a été fait en conformité avec les normes NIH pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire et a été approuvé par le Comité de Tel-Aviv University animale soin et l'utilisation (nombre de permis - L-14-019).
1. Préparation d'instruments et PDMS
- Préparer la plaquette (Table des matières, ou commander la plaquette d'un laboratoire de microfabrication), un scalpel, et une paire de pinces à épiler - stérilisation ne est pas nécessaire.
- Assurez-poly-D-lysine (PDL) Solution selon l'une des conditions suivantes: 4 mg / ml dans du tampon borate 0,1 M, pH 8, et conserver à -20 ° C.
- Préparer PDMS pochoirs selon la procédure suivante:
- Préparer polydiméthylsiloxane (PDMS, élastomère de silicone) en mélangeant ensemble la base et l'agent de durcissement avec un rapport de 10: 1, puis mélanger les deux substances pendant environ 5 min.
- Place dans la chambre à vide à deux reprises pendant 15 min à chaque fois et de vérifier bulles ont disparu.
- QuandPDMS est prêt, préparer tournette: boutons d'azote ouverts pour permettre l'utilisation du gaz, placer la plaquette de silicium (figure 1A) sur spinner, et utiliser le vide pour l'empêcher de bouger.
- Verser PDMS sur plaquette et activer le spinner pendant 1 min à 1000 rpm (crée environ 100 um hauteur).
- Placez plaquette sur une plaque chaude à 100 ° C pendant 30 min.
- Lorsque le PDMS a durci, définir les frontières de l'pochoir avec PDMS, en utilisant une pipette Pasteur. Placez plaquette sur une plaque chaude à 100 ° C pendant 30 min.
- Lorsque les PDMS frontières ont durci, utiliser un scalpel pour couper les stencils selon les frontières et de décoller le pochoir de silicium de la plaquette (un PDMS carré contenant un seul motif).
2. Boîte de Pétri et lamelle Préparation
- Préparer 23 mm lamelles de verre carrée et nettoyez-les selon l'ordre suivant:
- Laver à l'eau distillée, 70% d'éthanol, et l'acétone.
- Laver avec de l'isopropanol et séchage rapide avec de l'azote.
- Placez motifs PDMS pochoirs sur la lamelle, et appuyez doucement pour vérifier qu'ils sont fermement attachés à la surface du verre. Placer dans la chambre à vide pendant 15 min.
- 1 ml de l PDL sur pochoir. Insérer la lamelle dans la chambre à vide à deux reprises pendant 20 min chaque fois, et laisser PDL O / N à sécher.
- Préparer boîte de Pétri pour créer un réseau de cellules de soutien:
- Couvrez la surface du plat (3,5 cm) avec 1 ml de PDL pour 2 h en RT. Retirer la chute PDL aide d'une pipette.
- Laver avec de l'eau distillée et laisser sécher. Placer une très petite goutte de la graisse de silicone sur chaque coin de la lamelle.
- Placez la lamelle sur le centre de la boîte de Petri (ie, les PDMS devraient être orientés vers le haut) et appuyez doucement pour vérifier l'attachement.
- Retirez délicatement PDMS de lamelle en utilisant une pince à épiler. Pour la stérilisation, exposer à illumination UV pendant 7 min.
- Clean MEA dans cet ordre (Table des Matières):
- Laver avec de l'eau sous l'eau courante et soniquer dans un détergent enzymatique concentré trois fois.
- Soniquer en eau distillée 3 fois.
- Laver avec de l'eau distillée (dans le capot, 1000 pointe du pi) pour 3 fois et le lieu sous UV pendant 30 min.
- Appuyer la préparation du réseau:
- Préparer le moule de réseau de soutien conçu.
- Verser PDMS dans une plaque à 12 puits (diamètre 22 mm).
- Lorsque le PDMS est durcie sortir du moule et l'aide d'un scalpel, découper un trou au milieu pour créer une forme d'anneau.
- Placez un moule de réseau de soutien conçue sur le centre de la MEA (figure 2A) et couvrir le reste de la surface avec PDL pendant 2 heures à la température ambiante.
- Retirer PDL utilisant pipette et laver avec de l'eau distillée.
- Retirer le moule et laisser sécher (figure 2A). </ Li>
- Préparer le moule de réseau de soutien conçu.
- Aligner à stencil MEA de la manière suivante:
- Placez pochoir sur micro manipulateur désigné. Utilisation d'un microscope inversé pour aligner avec précision la structure à motifs à des électrodes, et d'abaisser le gabarit jusqu'à ce qu'il soit placé sur la surface de la MEA (Figure 2B).
Remarque: Le contact avec un MEA bien nettoyée fournit adhérence de concurrence entre les PDMS et l'AEM lui-même. - Soulevez le micromanipulateur et, si nécessaire, utiliser des pinces d'appliquer une petite quantité de pression au-dessus des PDMS pour l'empêcher détacher de l'AEM.
- Appuyez doucement pochoir à la surface de la MEA, et d'utiliser un microscope pour vérifier qu'il est fermement attaché, et bien aligné. (Figure 2C-D).
- Placez pochoir sur micro manipulateur désigné. Utilisation d'un microscope inversé pour aligner avec précision la structure à motifs à des électrodes, et d'abaisser le gabarit jusqu'à ce qu'il soit placé sur la surface de la MEA (Figure 2B).
- Passer MEA dans la chambre à vide pendant 15 min; mettre une goutte de 1 ml de PDL sur pochoir.
- Insérez dans la chambre à vide 2 fois pendant 20 min chacun. Laisser sécher PDL O / N dans l'incubateur.
- Avant de plaquage, enlever les pochoirs de PDMS AME et laver utilisant stérile water. Placer sous illumination UV pendant 7 min.
4. Dissection et de la culture
- Préparer cultures comme décrit dans Herzog et al. 2011 21.
5. Placage
- Calculer le nombre de cellules nécessaires pour le placage, en utilisant un hémocytomètre (densité optimale en fonction de la taille du circuit comme décrit dans la suite).
- Assurez-vous que la chambre de comptage (hémocytomètre) est propre et placer une lamelle sur elle (la consommation d'alcool pour nettoyer).
- Diluer 10 ul de la suspension de cellules dans 190 ul de milieu d'étalement (dilution 1:20).
- Charge 10 pi des cellules diluées sur le bord de la chambre de comptage et lentement pipeter les cellules permettant à la chambre à se remplir.
- En utilisant un microscope inversé, de visualiser la grille de hémocytomètre. Déterminer le nombre de cellules dans la chambre par comptage direct (cellules saines doivent être ronds). Compter les cellules au sein de la grande witho carréut ceux qui traversent les bords.
- Calculer la concentration de cellules:
Nombre total de cellules / 1000 pi = Total cellules comptées × facteur de dilution x 10 4 (zone de l'hémocytomètre).
Remarque: Par exemple, si le facteur de dilution est de 20 et le total des cellules comptées étaient 100:
100 x 20 x 10 x 4 = 0,1 10 7 cellules / 1000 pi ou 1 x 10 6/100 pi. Afin de plaque 0,75 x 10 6 cellules, prendre 75 pi sur les cellules.
- Prendre le nombre de cellules nécessaires pour le placage par MEA unique ou boîte de Pétri, remettre en suspension les cellules pour empêcher l'agrégation, et la plaque entre eux au centre, sur le dessus de la zone de patternate (si nécessaire, il est possible de diluer les cellules dans le milieu) . Pour la MEA, déposer une goutte de 100 pl dans le milieu. Pour lamelle, placez une goutte de 1 000 pi au milieu.
- Incuber les cellules étalées à 37 ° C pendant 40 min. Ajouter à moyen placage pour les cellules étalées, jusqu'à 1ml par MEA et 2 ml par lamelle.
- Gardez à 37 ° C et, tous les quatre jours, diluer avec de milieu de croissance frais enrichi avec 0,5 Pen-Strep, 2% de B-27 et 0,75% glutamax.
- De 6/7 DIV, après avoir vu les connexions entre les îles, diluer moyenne avec 10 pl / ml FUDR (25 mg désoxyuridine + 62,5 mg uridine dans 12,5 ml de MEM (milieu essentiel minimum d'Eagle)) ou tout autre agent anti-mitotique pour empêcher gliale prolifération.
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Representative Results
Un SU8-2075 moule sur une tranche de silicium avec une épaisseur de caractéristique d'environ 100 um a été utilisée pour façonner le PDMS. Le motif est composé de plusieurs carrés de dimensions, avec une longueur de côté et la distance variant entre 200 et 700 um (figure 1B). La taille de la place a été choisi pour adapter le champ de vision d'un 10X (pour les îles avec une longueur de côté <800 um) et d'un objectif 20X (pour les îles avec une longueur de côté <400 um). Trois paramètres, à savoir la densité de placage cellulaire, la distance entre les circuits, la taille de circuits sont déterminants pour l'obtention de monocouches ou circuits groupés ainsi que d'imposer et de façonner leur connectivité. Cependant, ces paramètres ne sont pas indépendantes puisque, compte tenu de la distance fixe entre les deux circuits, la probabilité qu'ils établissent spontanément une augmentation de la liaison avec la taille des circuits. Dans l'exemple présenté dans ce travail, pour les petits modules neuronaux de ~ 300 x 300 um, connexionsont été mis en place lorsque la distance ne était pas plus grand que ~ 300-400 um, tandis que pour les grands modules neuronaux de ~ 700 x 700 um, les connexions ont été établies lorsque la distance était plus petit que ~ 700 um. En général, en augmentant la distance entre les carrés qu'il était possible de modifier la probabilité de créer des interconnexions générées spontanément entre les modules, en passant de modules connectés à ceux fortement isolés.
Modules neuronaux de ~ 600 x 600 um sont indiquées à 4 jours in vitro (DIV; figure 3a). Après quelques jours dans les neurones in vitro sont principalement situés dans les zones revêtues alors qu'il ne est pas possible d'observer les processus et les connexions neuronales développés. Au contraire, au 14 DIV (figure 3B-C) neurones établissent des connexions dans et entre les modules. Alors que les grandes circuits neuronaux de ~ 600 x 600 um pourraient se auto-organiser dans des monocouches (figure 3A-C), des circuits de smalledimensions r (par exemple, ~ 300 x 300 um dans la figure 3D) ont tendance à se regrouper. Par conséquent, afin d'obtenir le meilleur calibrage pour les circuits à deux dimensions, les cellules ont été étalées avec une densité variant de différent 0,25 x 10 6 à 1 x 10 6 cellules / 23 mm couvercle de glissement fixée dans une boîte de Petri de 35 mm. Pour les plus grands circuits de ~ 700 x 700 um nous avons constaté que 0,75 x 10 6 cellules / 23 mm lamelle couvre-joint dans une boîte de 35 mm de Pétri est la densité optimale qui induit la formation de circuits de monocouches pas empêcher leur interconnexion spontanée (figure 3C ). Le même résultat du circuit de monocouche a été obtenu dans les petits circuits de ~ 300 x 300 um par placage 0,5 x 10 6 cellules / 23 mm lamelle fixé dans un plat de 35 mm de Pétri. En général, lorsque l'on considère la densité de placage de la cellule, il est important de souligner que, comme précédemment discuté 7, les cellules neuronales et gliales ont une tendance naturelle à se regrouper, de façon certaine clustering est presque inévitable après un certain temps dans la culture. Cependant, nous avons observé que l'augmentation de la zone destinée à soutenir le réseau pourrait augmenter les chances de survie de circuits et de leur organisation de mono-couches, probablement en raison d'une plus grande concentration de nutriments dans l'espace extracellulaire. Dans tous les cas, une approche par essais et erreurs est nécessaire pour identifier la densité optimale de placage des cellules pour créer des circuits mono-couches pour l'imagerie de calcium. Tous les 4 jours le milieu a été dilué avec du milieu de croissance frais. De 6/7 DIV, après avoir vu les connexions entre les îles, 10 pl / ml FUDR a été ajouté à prévenir la prolifération des cellules gliales.
La figure 4 représente la dynamique d'un réseau modulaire enregistré en utilisant l'imagerie de calcium (réalisée comme décrit dans Bonifazi et al. 2013 8). Images calcium fl uorescence ont été acquises en utilisant un objectif de grossissement 4X, ce qui a permis le contrôle de l'activité de l'ensemble du réseau (Figure 4A). L'analyse de l'imagerie de calcium a été effectuée comme décrit dans Bonifazi et al. 2013 8. Dans la figure 4B parcelle de trame des événements de calcium apparition présentant une activité spontanée est présenté (couleurs correspondent aux modules marqués dans la figure 4A). imagerie de calcium a été effectuée à 30 Hz, et la taille d'image est 1000 x 1000 pixels.
Les modules verts et roses sont très synchronisées comme indiqué dans le complot tramé (figure 4B) en accord avec leurs faisceaux reliant épaisseur, pouvant correspondre à un grand nombre de connexions (figure 4A). Les modules bleues et rouges sont faiblement reliés aux modules vert et rose et par conséquent ils parfois synchronisées avec eux (figure 4B). Une vidéo de l'enregistrement est disponible en ligne (film M1).
L'image d'un réseau modulaire développée sur un MEA à 21 DIV est illustré à la figure 5A. Jen afin d'obtenir le meilleur calibrage pour les circuits à deux dimensions, on plaqué les cellules corticales avec différentes densités variant de 250 x 10 3 à 500 x 10 3 cellules / par MEA. 250 x 10 3 cellules / par MEA (30 mm anneau) ont donné de meilleurs résultats en termes de formation de monocouches circuits, tout en ne empêchant leur interconnexion spontanée. Réseaux neuronaux fois motifs ont été réalisés sur le substrat des AME (figure 5A), l'activité électrophysiologique a été contrôlée en utilisant un système commercial utilisé pour l'acquisition et l'enregistrement de signaux électrophysiologiques. L'activité spontanée des cultures est détectée en utilisant le calendrier précis de détection de Spike (SSPT) 22 algorithme.
La figure 5B montre un graphique de trame correspondant à 5 min de l'activité spontanée (seuls les électrodes actives sont visibles), de couleur codé selon le numéro de grappe. En regardant ces parcelles, il est possible de faire des évaluations qualitativesde l'activité de grappes uniques et de l'ensemble du réseau en même temps. En particulier, il est possible d'observer une forte synchronisation entre les activités enregistrées au sein de chaque cluster. Une vidéo d'un enregistrement représentant de cultures motifs plus MEA est disponible en ligne (film M2).
Figure 1. Plaque au silicium. (A) La tranche de silicium (~ 4 de pouce de diamètre) utilisé pour mouler les pochoirs PDMS. Structures SU8 différents représentent différents réseaux modulaires. (B) la conception de fonction Représentant mis en œuvre sur une plaquette de silicium pour les réseaux modulaires construction. Chaque spot vert définir une structure en piliers SU8 et donc la région pour un seul module. Les dessins dans le rectangle en pointillé correspondent à trois pochoirs différents qui peuvent être utilisés sur des lamelles de culture standard carré de 23 mm de côté lenGTH. Dans chaque pochoir, un astérisque marque une macro-région pour le réseau de soutien. En fonction de la distance entre les points, le circuit de taille finie ou modules peuvent être en mesure d'établir des connexions neuronales spontanées entre eux. La conception des caractéristiques a été choisi pour créer la taille de module différent et inter-module à distance pour réaliser des circuits neuronaux isolés ou interconnectés qui pourrait adapter le champ de vision dans différents grossissements objectives (4X, 10X et 20X, le champ de vision pour chaque grossissement est représenté par les carrés rouges). Les caractéristiques sur le rectangle noir en pointillés sont conçus pour se adapter à l'utilisation simultanée de la MEA et de calcium imagerie. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2.PDMS structures dépôt sur un MEA. (A) PDMS moule avec une forme d'anneau (marqué par la flèche rouge) monté sur un MEA. Le moule est utilisé pour recouvrir la zone destinée au réseau neuronal de support et située à la périphérie de la zone de culture (ce est limité par la bague montée sur la MEA et marquée par la flèche verte). (B) alignement d'un stencil de PDMS sur la MEA en utilisant un micro manipulateur. (C) PDMS pochoir déposé sur la sur MEA après alignement. (D) l'image d'un pochoir de PDMS sur MEA en utilisant un grossissement de 10x (la distance entre les électrodes est de 500 um). Il est possible de noter les trous sur les pochoirs en correspondance avec les électrodes. La couche d'adhésif favorisant l'adhésion cellulaire sera déposé uniquement sur les zones ouvertes. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Image de champ lumineux de modules corticaux de ~ 600 x 600 pm (A) après 4 DIV et (B) après le 14 DIV. (C) Figure 3. réseaux neuronaux modulaires à DIV différente. Notez les interconnexions spontanées entre les circuits après le 14 DIV. Les cellules ont été étalées à la densité cellulaire optimale pour les grands circuits pour organiser en monocouches, à savoir 750 x 10 3 cellules / 23 mm glissement de couvercle fixé dans une boîte de 35 mm de Pétri. (D) à l'aide PDMS caractéristiques de moitié la taille et la même concentration de cellules, circuits neuronaux organisés en structures en cluster. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 4. Calcium imagerie des réseaux modulaires. (A) Les cellules corticales (18 DIV) chargées de l'indicateur de calcium OGB. Différentes couleurs marquent les différents modules. Le champ de vision est de 2 x 2 mm. (B) parcelle Raster de l'activité spontanée. Les différentes couleurs correspondent aux cellules dans différents modules comme indiqué dans le panneau A. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. enregistrement de MEA de réseaux modulaires. (A) Réseau modulaire (neurones corticaux, 21 DIV) composé de trois circuits distincts cultivés sur une MEA 4Q. Circuits neuronaux sont éloignés ~ 600 um interconnectés les uns aux autres. (B) parcelle Raster montrant 5 min du électr spontanéeophysiological enregistrement d'activité. C1, C2 et C3 correspondent, respectivement, à la les activités du pôle inférieur gauche en haut à gauche, en bas à droite, et mis en évidence dans différentes couleurs. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Un protocole de croître réseaux neuronaux modulaires 2D in vitro composé de circuits fonctionnellement interconnectés est décrite. La procédure est basée sur un motif sur la couche adhésive cellulaire. Modélisation est réalisé avec PDMS pochoirs reproduire l'aspect négatif de l'architecture de réseau désiré. Pochoirs PDMS définissent les zones où la couche adhésive est déposée cellulaire. Une fois que les cellules sont étalées, ils assemblent spontanément aux îles recouvertes et l'auto-organisent en circuits interconnectés actifs. Enregistrements de réseaux modulaires fonctionnels enregistrés avec les AEM et l'imagerie de calcium a été présenté.
Le protocole présenté a été dûment modifié par rapport à la procédure suivie initialement. Tout d'abord, des problèmes avec l'alignement de PDMS pochoirs devaient être abordées. Depuis l'alignement doit être réalisé dans la première tentative (une fois le pochoir a touché la surface, il ne est pas recommandé de le transférer), ce problème a été surmontéen abandonnant la procédure manuelle et en optant pour une nouvelle méthode qui consiste à utiliser un micro manipulateur pour dépôt au pochoir précise sur la zone d'enregistrement de MEA. Une autre question qui devait être abordée consiste à empêcher la chute PDL de passer sous le pochoir alignés (sinon la conception modelée ne pouvait pas être obtenu). Pour ce faire, une fois le pochoir a été aligné et avant de mettre la goutte PDL sur elle, le dispositif envisagé (MEA ou lamelle) doit être laissé dans la chambre à vide pour une période appropriée de temps fournissant ainsi une bonne fixation de celui-ci sur le surface. La même chose a été fait une fois la baisse PDL est placé sur le pochoir afin d'éliminer les bulles d'air qui se forment entre l'appareil et la baisse se laissant ainsi le PDL d'entrer en contact avec la surface.
Les étapes critiques du protocole décrit sont représentés par: i) la phase de revêtement par centrifugation qui devrait garantir à obtenir "répliques ouvertes» ou, au moins, un sufficiremment film mince sur les structures SU8 qui peuvent être facilement enlevés en utilisant des pinces; ii) le traitement de la surface de culture (de lamelle ou MEA); iii) le placement des pochoirs PDMS sur elle; iv) la phase de revêtement car il ya des cas dans lequel, si le masque de PDMS ne est pas suffisamment étanche contre le substrat sur lequel est positionné, il peut arriver que la protéine adhésive passe sous le masque compromettant ainsi la formation de motifs. Ainsi, le processus de nettoyage des lamelles ou AME est de première importance ainsi que l'alignement du pochoir PDMS. Performances propres de ces deux étapes se assurer les meilleurs résultats de structuration.
Les limites de cette technique ont aussi à voir avec la fois la électrophysiologique et l'acquisition de l'imagerie calcique. Dans le premier cas, une résolution spatiale très faible (4-8 électrodes sont inclus dans chaque module) est présent en raison à la fois aux dimensions du circuit unique et le distanc inter-électrodee. Dans le second cas, le risque consiste à ne pas trouver la densité cellulaire optimale qui permet d'obtenir une couche cellulaire à deux dimensions, empêchant ainsi une acquisition unique de la cellule de résolution.
Cette stratégie, qui nécessitait une optimisation soignée du revêtement, l'assemblage et les procédures de stérilisation et de la création d'un système de micro-alignement coutume, nous a donné quelques avantages majeurs par rapport aux œuvres précédemment (par exemple, la survie à long terme de nos cellules, ce est à dire jusqu'à 8 semaines in vitro). Plus précisément, il nous a fourni un confinement plus stable et fiable à long terme 24 par rapport à des stratégies basées sur la structuration chimique 23-28.
La procédure décrite se appuie sur placage cellules corticales sur les modules PDL-revêtues, ce qui assure l'auto-organisation des réseaux en assemblées de neurones reliés par des axones et les dendrites faisceaux. Pour permettre à grand champ imagerie calcique du filet modulairefonctionne avec une résolution d'une cellule unique, il est essentiel que le système neuronal organise en une couche en 2D. Par conséquent, il est essentiel pour optimiser la densité des cellules étalées à la fois pour éviter de haute densité, les clusters cellulaires ou aux autres modules de faible densité extrêmes qui réduisent connexion inter-module probabilité.
Bien que les réseaux neuronaux-gliales en culture perdent leur organisation structurelle in vivo, ils spontanément auto-organisent en circuits fonctionnels actifs offrant la possibilité de réaliser des études dans des conditions expérimentales bien contrôlées. Les deux réseaux neuronaux modulaires dimensions composées de circuits fonctionnellement interconnectés décrites dans ce protocole constituent un outil puissant pour étudier la dynamique de la communication entre les assemblées de neurones et la capacité des réseaux neuronaux structurellement définis pour générer vaste répertoire de motifs.
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Disclosures
Les auteurs ne ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le projet BRIANBOW européenne (FP7 Jeunes Explorateurs, Les auteurs tiennent à remercier le Dr Jacopo Tessadori des commentaires utiles sur le manuscrit, et Silvia Chiappalone pour son aide dans la production des graphiques utilisés dans la vidéo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Nalgene vacuum chamber | Thermo | 5305-0609 | |
| Poly-D-lysine PDL | Sigma | P7886 | |
| Silicone grease - SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| Spin coater | Laurell - Technologies Corporation | WS-650-23 | |
| 12-well culture plate | Sigma | CLS3336 | |
| 5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
| TC02 | Multi Channel Systems | ||
| Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
| B-27 | Gibco | 17504044 | |
| glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
| Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com |
| Silicon wafer | microchem | SU8-2075 | Preparation protocol: http://www.microchem.com |
References
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