Summary
כתב יד זה מתאר פרוטוקול לגדול ברשתות מודולרי מבחנה המורכבת של מעגלים עצביים, מבחינה תפקודית בין מחוברים-מוגבלים במרחב. מסכת פולימרים משמשת לדפוס שכבת חלבון לקדם הידבקות סלולרית על מצע culturing. נוירונים מצופים לגדול באזורים מצופים יצירת קשרים ספונטניים ומציג פעילות אלקטרו.
Abstract
המוח פועל באמצעות ההפעלה מתואמת והתקשורת הדינמית של מכלולים עצביים. שאלה פתוחה גדולה היא איך רפרטואר עצום של מוטיבים הדינמיים, העומדים ביסוד תפקודי מוח המגוונים ביותר, יכול לצאת מארגון טופולוגי ומודולרי קבוע של מעגלים חשמליים במוח. בהשוואה למחקרי in vivo של מעגלים עצביים המציגים קשיים ניסיוניים פנימיים, הכנות במבחנה מציעות אפשרות הרבה יותר גדולה כדי לתפעל ולחקור את התכונות מבניות, דינמיות וכימיות של מערכות עצביות ניסיוניות. עבודה זו מתארת במבחנה מתודולוגיה ניסיונית המאפשר גידול של רשתות מודולרי הולחנו על ידי אסיפות מרחבית שונות, ביניהם מבחינה תפקודית עצביות. הפרוטוקול מאפשר שליטה הארכיטקטורה דו-ממדית (2D) של הרשת העצבית ברמות של מורכבות טופולוגי שונות.
דפוסי רשת רצויים יכולים להיותהושג הן על מכסה מחליק רגיל ומערכי אלקטרודה מיקרו מצע מוטבע. מבני micromachined מוטבעים על פרוסות סיליקון ומשמשים ליצירת שבלונות פולימרים ביולוגית, אשר משלבות את התכונות השליליות של ארכיטקטורת הרשת הרצויה. סטנסילים מונחים על מצעי culturing במהלך הליך ציפוי פני השטח בשכבה מולקולרית לקידום הידבקות סלולרית. לאחר הסרת שבלונות, נוירונים הם מצופים והם יופנו באופן ספונטני לאזורים המצופים. על ידי הפחתת המרחק בין התא, ניתן להשיג מעגלים עצביים או מבודדים או מחוברים. כדי לקדם את הישרדות תא, תאי שיתוף תרבותיים עם רשת עצבית תמיכה הממוקמת בפריפריה של המנה התרבות. קלטות אלקטרו אופטיות של הפעילות של רשתות מודולרי המתקבלות על ידי שימוש בהתאמה מערכי מצע משובץ מיקרו אלקטרודה והדמיה סידן מוצגות. בעוד כל מודול תערוכות spontסינכרונים הגלובליים aneous, ההתרחשות של סנכרון בין-מודול מוסדר על ידי הצפיפות של חיבור בין המעגלים.
Introduction
עדויות ניסויית ותיאורטיות תומכות באפשרות שהמוח פועל באמצעות הפעלה מתואמת של מכלולי תא 1-5, שיכול להיחשב כיחידות פונקציונליות דינמיות שtransiently לתקשר אחד עם השני, עיצוב ומדינות שונות במוח בסיסי. המודולריות פונקציונלית תלויה גם ובקשור לארגון מודולרי המבני של המעגלים חשמליים במוח 6,7. איך תפקוד ומבנה של מעגלים חשמליים במוח באופן הדדי לעצב אחד את השני הוא עדיין אחת השאלות פתוחות העיקריות במדעי המוח. כדי לספק הבנה עמוקה יותר של שאלה זו, חשוב לזהות מסגרות ניסיוניות אופטימליות בו ניתן לטפל ב, לפחות באופן חלקי, בנושאים אלה. מאז נשלט מניפולציה של דינמיקת מרחב ובזמן של רשתות עצביות בניסויי in vivo הוא מאתגר, פיתוח המודלים רשתות עצביות במבחנה הוא עניין משמעותי בשל acc הקלessibility, ניטור, מניפולציה ודוגמנות 8,9. בשנים האחרונות, בטכנולוגיות מבחנה הנתמכות על ידי שיטות דפוסי מצע מתקדמות אפשרו לגרום לרשתות עצביות לפתח מגוון של מבנים מודולריים מוגדרים מראש 3 וללמוד את המאפיינים הפונקציונליים של רשתות עם טופולוגיות הוטלו 10. בפרט, שיטות שמשו לאחרונה לארגן רשתות על ידי הטלת מגבלות פיזיות 4,11. ואכן, כדי ללמוד את הקשר בין המבנה ותפקוד ברשתות עצביות ולספק ייצוג פשוט אך מתקבל על הדעת של אינטראקציה מכלולים עצביים, במבחנה מערכות אמורות לספק תת-אוכלוסיות עצביות בין המחובר. תרבויות הומוגני 2D נחקרו באופן נרחב עצביות לא להטיל מגבלות כלשהן על מרחבי החיווט מתהווה, באמצעות התארגנות העצמית של המעגלים. לכן גישה אפשרית לעצב אסיפות תא מלאכותי ביניהם היא למצב את האוכלוסיות עצביות שונות בירקאזורי ially מובחנים. המרחק בין האזורים אלה אינו מונע את הקשרים בין המכלולים. גישה זו, תוך הבטחת שליטה ניכרת על מורכבות רשת, הוכח לספק רפרטואר עשיר של דגמי סנכרון 6,7,12.
על מנת להקל על culturing שחזור של מכלולים עצביים מודולרי, פרוטוקול להרכיב את הארגון העצמי של רשתות עצביות לאשכולות מקושרים על ידי אקסונים ודנדריטים מוצג ומתואר. מבנה פולימרים לבידוד הפיזי של תרבויות עצביות נוצר מpolydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS הוא אלסטומר בשימוש נרחב עבור יישומים ביו-רפואיים בשל biocompatibility, שקיפותה וחדירות לגזים 13. PDMS מוכן ולא נכלל בSU8 micromachined 2,075 14,15 מבנים על ידי PDMS נוזלי על "אדון", כפי שתואר בעבר באל ג'קמן et ציפוי ספין. 16 Tהוא השיג בדוגמת רשתות עצביות מורכבות ממודולים מחוברים בין גודל שונה והם התקבלו בהצלחה בשני coverslips ומערכי מיקרו אלקטרודה (MEAs) 17-20. הצפיפות של קשרים בין המודולים יכולה לשנות את התכונות של סנכרון הרשת, מרשת מסונכרנת באופן מלא, אופיינית לתרבויות אחידות, למדינות חולפות של סנכרון בין המודולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ההליך נעשה בהתאם לתקני NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושר על ידי ועדת אוניברסיטת תל-אביב הטיפול בבעלי חיים והשימוש (מספר רישיון - L-14-019).
1. הכנה של מכשירים וPDMS
- הכן את הרקיק (טבלה של חומרים, או להורות על הרקיק ממעבדת microfabrication), אזמל, ופינצטה - העיקור אינו נחוץ.
- הפוך poly-D- ליזין פתרון (PDL) על פי התנאים הבאים: 4 מ"ג / מיליליטר במאגר M 0.1 borate, pH 8, ולאחסן ב -20 ° C.
- הכן סטנסילים PDMS על פי הנוהל הבא:
- הכן polydimethylsiloxane (PDMS, אלסטומר סיליקון) על ידי ערבוב יחד הבסיס וסוכן הריפוי עם יחס של 10: 1, ולאחר מכן מערבבים את החומרים 2 לכ 5 דקות.
- בועות מניחים בתא ואקום פעמיים במשך 15 דקות בכל פעם ולאמת נעלמו.
- מתיPDMS מוכן, להכין coater ספין: ידיות חנקן פתוחות על מנת לאפשר שימוש בגז, הנח את פרוסות סיליקון (איור 1 א) על טווה, ולהשתמש בוואקום כדי למנוע ממנה לזוז.
- יוצקים PDMS על פרוסות סיליקון ולהפעיל את הטווה דקות 1 ב 1000 סל"ד (יוצר כ 100 מיקרומטר גובה).
- מניחים פרוסות על צלחת חמה ב 100 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- כאשר PDMS יש קשוח, לסמן הגבולות של סטנסיל עם PDMS, באמצעות פיפטה פסטר. מניחים פרוסות על צלחת חמה ב 100 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- כאשר גבולות PDMS הקשיחו, השתמש באזמל כדי לחתוך שבלונות לפי הגבולות ולקלף את השבלונה סיליקון מהרקיק (PDMS ריבוע המכיל תבנית אחת).
2. צלחת פטרי והכנת Slip כיסוי
- הכן 23 מ"מ מכסה מחליק זכוכית מרובעת ולנקות אותם לפי הסדר הבא:
- לשטוף עם מים מזוקקים, 70% אתנול, ואצטון.
- לשטוף עם isopropanol ומהיר יבש עם חנקן.
- הנח סטנסילים PDMS דוגמת על coverslip, ולחץ בעדינות כדי לוודא שהם מחוברים היטב למשטח הזכוכית. מניחים בתא ואקום במשך 15 דקות.
- ירידה של 1 מיליליטר של PDL בסטנסיל. הכנס את coverslip לתא הוואקום פעמיים במשך 20 דקות בכל פעם, ולהשאיר PDL O / N לייבוש.
- הכן צלחת פטרי ליצירת רשת סלולארי תומכת:
- מכסה את פני השטח של המנה (3.5 סנטימטרים) עם 1 מיליליטר של PDL לשעה 2 בRT. הסר את ירידת PDL בעזרת פיפטה.
- לשטוף עם מים מזוקקים ולהשאיר לייבוש. מניחים ירידה קטנה מאוד של שמן סיליקון על כל פינה של coverslip.
- מניחים את coverslip במרכז צלחת פטרי (כלומר, PDMS צריך לפנות כלפי מעלה) ולחץ בעדינות כדי לוודא קובץ מצורף.
- להסיר בעדינות PDMS מcoverslip באמצעות פינצטה. לעיקור, לחשוף לתאורת UV במשך 7 דקות.
- MEA הנקי בצו זה (טבלה של חומרים):
- לשטוף עם מים תחת ברז וsonicate בחומר ניקוי מרוכז, האנזימטית 3 פעמים.
- Sonicate במים מזוקקים 3 פעמים.
- לשטוף עם מים מזוקקים (במכסת מנוע, 1,000 קצה μl) במשך 3 פעמים ומקום תחת UV למשך 30 דקות.
- תמיכת הכנת רשת:
- הכן את עובש רשת תמיכה שתוכנן.
- יוצקים לתוך צלחת PDMS 12 גם (22 מ"מ קוטר).
- כאשר PDMS הוא התקשה להוציא את התבנית ובאמצעות אזמל, לחתוך חור באמצע כדי ליצור צורת טבעת.
- מניחים תבנית רשת תמיכה שתוכננה במרכז MEA (איור 2 א) ולכסות את שאר פני השטח עם PDL לשעה 2 ב RT.
- הסר PDL באמצעות פיפטה ולשטוף עם מים מזוקקים.
- להסיר את התבנית ולהשאיר לייבוש (איור 2 א). </ Li>
- הכן את עובש רשת תמיכה שתוכנן.
- יישר סטנסיל לMEA באופן הבא:
- הנח סטנסיל על מניפולטור מיקרו מיועד. שימוש במיקרוסקופ הפוכה כדי ליישר במדויק מבנה בדוגמת לאלקטרודות, ולהפחית את השבלונה עד שהוא ממוקם על פני השטח MEA (איור 2).
הערה: לתקשר עם MEA לנקות היטב מספק הידבקות תחרותית בין PDMS וMEA עצמו. - הרם את micromanipulator ואם יש צורך, להשתמש בפינצטה כדי למרוח כמות קטנה של לחץ מעל PDMS כדי למנוע את זה ניתוק מMEA.
- לחץ בעדינות על סטנסיל למשטח MEA, ולהשתמש במיקרוסקופ כדי לוודא שהוא מחובר היטב, ומיושר היטב. (איור 2C-D).
- הנח סטנסיל על מניפולטור מיקרו מיועד. שימוש במיקרוסקופ הפוכה כדי ליישר במדויק מבנה בדוגמת לאלקטרודות, ולהפחית את השבלונה עד שהוא ממוקם על פני השטח MEA (איור 2).
- הנח MEA בתא ואקום במשך 15 דקות; לשים טיפת 1 מיליליטר של PDL בסטנסיל.
- הכנס לתא ואקום 2 פעמים במשך 20 דקות כל אחד. השאר PDL לייבוש O / N בחממה.
- לפני הציפוי, להסיר את PDMS סטנסילים מMEAs ולשטוף באמצעות סטרילי wאטר. הנח תחת תאורת UV במשך 7 דקות.
4. Dissection ותרבות
- הכן תרבויות כפי שמתואר בהרצוג et al. 2011 21.
5. ציפוי
- לחשב מספר התאים הדרושים לציפוי, באמצעות hemocytometer (צפיפות אופטימלית בהתאם לגודלו של המעגל כפי שנדון בתוצאה).
- ודא שחדר הספירה (hemocytometer) הוא נקי ובמקום להחליק כיסוי עליו (אלכוהול שימוש לנקות).
- לדלל 10 μl של ההשעיה התא 190 μl של ציפוי בינוני (דילול 1:20).
- טען 10 μl של התאים בדילול מלא על קצה חדר הספירה ולאט לאט פיפטה את התאים המאפשר לתא כדי למלא את עצמו.
- באמצעות מיקרוסקופ הפוכה, לדמיין את רשת haemocytometer. לקבוע את מספר התאים בתא על ידי ספירה ישירה (תאים בריאים צריכים להיות עגולים). ספירת התאים בתוך witho המרובע הגדולut אלה שחצו את הקצוות.
- חשב את הריכוז של תאים:
מספר כולל של תאים / 1000 μl = סה"כ תאים נספרו × גורם לדילול × 10 4 (שטח של hemocytometer).
הערה: לדוגמא, אם היה הגורם לדילול 20 והתאים הכולל נספרו היו 100:
100 × 20 × 10 4 = 0.1 10 7 תאים / μl 1,000 x או 1 x 10 6/100 μl. כדי צלחת 0.75 x 10 6 תאים, לקחת 75 μl מתוך התאים.
- קח את מספר התאים הדרושים לציפוי לMEA הבודד או צלחת פטרי, resuspend התאים כדי למנוע צבירה, וצלחת אותם במרכז, על גבי שטח patternate (במידת צורך, ניתן לדלל את התאים במדיום) . לMEA, מקום טיפת 100 μl באמצע. לכיסוי להחליק, מקום טיפת 1,000 μl באמצע.
- דגירה התאים המצופה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות. הוסף בינוני ציפוי לתאים מצופים, עד 1מיליליטר לMEA ו -2 מיליליטר לכיסוי להחליק.
- שמור על 37 מעלות צלזיוס ו, כל 4 ימים, לדלל עם מדיום גידול טרי מועשר עם 0.5 פן-דלקת, 2% Glutamax B-27 ושל 0.75%.
- מ6/7 DIV, לאחר שראה את הקשרים בין האיים, לדלל בינוני עם 10 μl / מיליליטר FUDR (uridine deoxyuridine + 62.5 מ"ג 25 מ"ג ב12.5 מיליליטר ממ (בינוני נשר חיוני מינימאלי)), או כל סוכן אנטי mitotic אחר כדי למנוע גליה יתר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עובש SU8-2075 על פרוסות סיליקון בעובי תכונה של כ 100 מיקרומטר שימש לעצב את PDMS. הדפוס היה מורכב מריבועים של מספר ממדים, עם אורך צד ומרחק משתנים בין 200 ל 700 מיקרומטר (איור 1). הגודל של הכיכר נבחר כדי להתאים את שדה ראייה של 10X (לאיים עם אורך צד <800 מיקרומטר) ושל מטרת 20X (לאיים עם אורך צד <400 מיקרומטר). שלושה פרמטרים, כלומר צפיפות תאי ציפוי, מרחק בין מעגלים, הגודל 'המעגלים הם הקובע לקבלת monolayers או מעגלי מקובצים כמו גם להטיל ולעצב את הקישוריות שלהם. עם זאת, פרמטרים אלה אינם עצמאיים מאז, בהתחשב במרחק קבוע בין שני מעגלים, ההסתברות שהם באופן ספונטני להקים גידול חיבור עם הגודל של המעגלים. בדוגמא שנדונה בעבודה זו, עבור מודולים עצביים קטנים של ~ 300 x 300 מיקרומטר, קשריםהוקמו כאשר המרחק לא היה גדול יותר מ~ 300-400 מיקרומטר, ואילו עבור מודולים עצביים גדולים של ~ 700 x 700 מיקרומטר, נוצרו קשרים כאשר המרחק היה קטן יותר ~ 700 מיקרומטר. באופן כללי, על ידי הגדלת המרחק בין הריבועים ניתן היה לשנות את ההסתברות להקמה בין-חיבורים שנוצרו באופן ספונטני בין מודולים, עובר ממודולים מחוברים מאוד לבודדים אלה.
מודולים עצביים של ~ 600 x 600 מיקרומטר מוצגים על 4 ימים במבחנה (DIV; איור 3 א). לאחר כמה ימים בתאי עצב מבחנה ממוקמים לרוב באזורים המצופים בזמן שהוא לא ניתן לראות תהליכים עצביים מפותחים וקשרים. להיפך, בגיל 14 DIV נוירונים (איור 3 ב-ג) ליצור חיבורים בתוך ובין המודולים. בעוד מעגלים עצביים גדולים יותר של ~ 600 x 600 מיקרומטר יכולים עצמי לארגן לmonolayers (איור 3 א-ג), מעגלים של smalleממדי r (למשל, ~ 300 x 300 מיקרומטר באיור 3D) נטו אשכול. לכן, על מנת לקבל את הכיול הטוב ביותר עבור מעגלים דו-ממדיים, תאים היו מצופים בצפיפות שונה הנעה בין 0.25 x 10 x 6 עד 1 10 6 תאים / 23 מ"מ כיסוי להחליק מצורף בצלחת פטרי 35 מ"מ. למעגלים רחבים יותר של ~ 700 x 700 מיקרומטר מצאנו כי הכיסוי להחליק 0.75 x 10 6 תאים / 23 מ"מ מצורף בצלחת פטרי 35 מ"מ היא הצפיפות האופטימלית אשר גורמת להיווצרות של מעגלי monolayer לא מונעים בין-החיבור הספונטני שלהם (איור 3 ג ). אותו התוצאה ממעגל monolayer הושגה במעגלים קטנים של ~ 300 x 300 מיקרומטר על ידי ציפוי כיסוי להחליק 0.5 x 10 6 תאים / 23 מ"מ מצורף בצלחת פטרי 35 מ"מ. באופן כללי, כאשר בוחנים צפיפות ציפוי תא, חשוב להדגיש כי, כפי שנדון בעבר 7, יש לי תאים עצביים וגליה נטייה מולדת לאשכול, כך במידה מסוימת של CLustering הוא כמעט בלתי נמנע אחרי כמה זמן בתרבות. עם זאת, שמה לב שהגדלת השטח המיועד לרשת התמיכה היה לשפר את ההסתברות להישרדות 'המעגלים והארגון מונו-שכבתית שלהם, ככל הנראה בשל ריכוז גדול יותר של חומרים מזינים במרחב החוץ תאי. בכל מקרה, יש צורך בגישה של ניסוי וטעייה כדי לזהות את צפיפות ציפוי תא האופטימלית ליצירת מעגלים חד-שכבתיים להדמית סידן. כל 4 ימים הבינוני היה מדולל עם מדיום גידול טרי. מ6/7 DIV, לאחר שראה את הקשרים בין האיים, 10 μl / מיליליטר FUDR נוספו למנוע גדילת יתר של גליה.
איור 4 מראה הדינמי של רשת מודולרית נרשם באמצעות הדמיה סידן (בוצעה כפי שתואר בBonifazi et al. 2,013 8). תמונות סידן fl uorescence נרכשו באמצעות מטרת הגדלת 4X, שאיפשר לפקח על הפעילות של הרשת כולה (figur4A ה). ניתוח של ההדמיה סידן בוצע כפי שתואר בBonifazi et al. 2,013 8. בעלילת סריקה איור 4 של אירועי סידן תחילתו מוצגות פעילות ספונטנית מוצג (צבעים מתאימות למודולים מסומנים באיור 4 א). ההדמיה סידן בוצעה ליום 30 בהרץ, וגודל תמונה הוא 1,000 x 1,000 פיקסלים.
מודולים הירוקים וורודים מסונכרנים מאוד, כפי שמוצגים בעלילת סריקה (איור 4) בהסכם עם הצרורות עבות החיבור שלהם, ואולי מתאים למספר רב של חיבורים (איור 4 א). מודולים הכחולים ואדומים בחולשה מחוברים למודולים הירוקים וורודים ולכן הם מסונכרנים מדי פעם איתם (איור 4). וידאו של ההקלטה זמין באופן מקוון (סרט M1).
התמונה של רשת מודולרית גדלה על MEA בגיל 21 DIV מוצגת באיור 5 א. אניכדי n כדי לקבל את הכיול הטוב ביותר עבור מעגלים דו-ממדיים, שמצופים בתאים בקליפת המוח עם צפיפות שונה הנעה בין 250 x 10 3-500 x 10 3 תאים / לMEA. 250 x 10 3 תאים / לMEA (30 טבעת מ"מ) נתנו תוצאות טובות יותר במונחים של ההיווצרות של מעגלי monolayer, ואילו לא מונעים בין-החיבור הספונטני שלהם. רשתות עצביות בדוגמת פעם הושגו על מצע MEAs (איור 5 א), פעילות אלקטרו כבר לנטר באמצעות מערכת מסחרית המשמשת לרכישה והקלטת אותות אלקטרו. פעילות ספונטנית של תרבויות המזוהות באמצעות אלגוריתם תזמון המדויק ספייק איתור (PTSD) 22.
איור 5 מציג עלילת סריקה המקבילה ל 5 דקות של פעילות ספונטנית (רק אלקטרודות פעילים גלויות), בצבע המקודד לפי מספר האשכול. על ידי הסתכלות על חלקות אלה, ניתן לבצע הערכות איכותיותהפעילות של אשכולות יחידים ושל הרשת כולה באותו הזמן. בפרט, ניתן לצפות בסנכרון חזק בין הפעילויות שנרשמו בכל אשכול. וידאו של הקלטת נציג מתרבויות בדוגמת על MEA זמין באופן מקוון (סרט M2).
איור 1. הסיליקון רקיק. פרוסות סיליקון (~ 4 אינץ 'קוטר) (א) המשמש לעצב סטנסילים PDMS. מבני SU8 שונים מייצגים רשתות מודולרי שונות. עיצוב (B) נציג תכונה מיושם על פרוסות סיליקון לבניית רשתות מודולרי. כל נקודה ירוקה להגדיר מבנה עמוד SU8 ולכן האזור למודול אחד. העיצובים בתוך המלבן השחור המקווקו מתאים לשלושה סטנסילים שונים אשר ניתן להשתמש בי על coverslips התרבות המרובע הסטנדרטי של len צד 23 מ"מGTH. בכל סטנסיל, כוכבית מסמנת מאקרו-אזור לרשת תמיכה. בהתאם למרחק בין הנקודות, מעגל הגודל הסופי או מודולים אולי יוכלו ליצור חיבורים עצביים ספונטניים ביניהם. העיצוב של התכונות נבחר כדי ליצור גודל מודול שונה ומרחק בין מודול להשיג מעגלים עצביים מבודדים או מחוברים שיכול להתאים את שדה ראיה בהגדלת יעד שונה (4X, 10X ו20X; שדה ראייה לכל הגדלה הוא מיוצג על ידי הריבועים האדומים). התכונות מתוך המלבן השחור המקווקו נועדו להתאים את השימוש בו זמני של ההדמיה MEA וסידן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מבני PDMS תצהיר על MEA. () PDMS תבנית עם צורת טבעת (מסומנת בחץ האדום) רכוב על MEA. יישור העובש משמש למעייל האזור המיועד לרשת העצבית התמיכה וממוקם בפריפריה של אזור culturing (זה מוגבל על ידי הטבעת רכוב על MEA ומסומן על ידי החץ הירוק). (ב) לסטנסיל PDMS על MEA באמצעות מניפולטור מיקרו. (ג) PDMS סטנסיל שהופקד על על MEA לאחר יישור. תמונה (D) של סטנסיל PDMS על MEA באמצעות הגדלה 10x (מרחק בין האלקטרודה הוא 500 מיקרומטר). אפשר לציין את החורים בשבלונות בהתכתבות של אלקטרודות. שכבת דבק העדפת הידבקות סלולרית תופקד רק באזורים פתחו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ge = "תמיד"> 
איור 3. רשתות עצביות מודולרי בDIV שונה. תמונת שדה מואר של מודולים בקליפת המוח של 600μm ~ 600 x () לאחר 4 DIV ו- (ב) לאחר 14 DIV. (ג) שים לב לחיבורים ספונטניים בקרב המעגלים לאחר 14 DIV. תאים היו מצופים בצפיפות תאים האופטימלית למעגלים גדולים כדי לארגן לmonolayers, כלומר, 750 x 10 3 תאים / להחליק לכסות 23 מ"מ מצורף בצלחת פטרי 35 מ"מ. (ד) שימוש בתכונות PDMS של מחצית גודל ואותו ריכוז תא, מעגלים עצביים מאורגנים במבנים התקבצו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
"Width =" 700 highres.jpg "/>
הדמיה 4. סידן איור של רשתות מודולרי. (א) תאים בקליפת מוח (18 DIV) עמוסות מחוון סידן OGB. צבעים שונים לסמן מודולים שונים. שדה הראייה הוא 2 x 2 מ"מ. עלילת סריקה (B) של פעילות ספונטנית. הצבעים השונים מתאים לתאים בתוך מודולים שונים כפי שמוצגים בלוח א 'אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הקלטת 5. MEA איור של רשתות מודולרי. (א) רשת מודולרי (נוירונים בקליפת המוח, 21 DIV) מורכבות מ 3 מעגלים שונים הגדלים על MEA 4Q. מעגלים עצביים רחוקים ~ 600 מיקרומטר מחוברים זה לזה. עלילה (B) סריקה מראה 5 דקות של חשמל ספונטניהקלטת פעילות ophysiological. C1, C2 ו- C3 מתאים, בהתאמה, לפינה השמאלית העליונה, הימנית התחתונה והפעילויות של האשכול השמאלי התחתון, מודגש בצבעים שונים. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול לגדול רשתות עצביות מודולרי 2D במבחנה המורכבת ממעגלים תפקודי-היתר קשור מתואר. ההליך מבוסס על דפוסי שכבת דבק סלולרית. דפוסים מושגת עם שבלונות PDMS לשחזר את התכונה השלילית של ארכיטקטורת הרשת הרצויה. סטנסילים PDMS להגדיר את האזורים שבם שכבת הדבק הסלולרית מופקדת. ברגע שתאים מצופה, הם באופן ספונטני להרכיב לאיים המצופים ועצמיים לארגן למעגלים בין המחובר פעילים. הקלטות של רשתות מודולרי פונקציונליות שהוקלטו באמצעות MEAs והדמיה סידן הוצגו.
הפרוטוקול שהוצג כבר שונה כדין בהשוואה להליך בתחילה ואחריו. ראשית, בעיות עם היישור 'סטנסילים PDMS היו צריכות לטפל. מאז היישור יש לעשותה בניסיון הראשון (פעם סטנסיל נגע פני השטח, זה לא מומלץ לעבור את זה), בעיה זו כבר להתגברעל ידי נטישת ההליך הידני ובוחר בשיטה חדשה אשר מורכבת באמצעות מניפולטור מיקרו לתצהיר סטנסיל מדויק על אזור MEA ההקלטה. נושא נוסף שהייתי צריך לטפל מורכב במניעת ירידת PDL מעובר מתחת לסטנסיל מיושר (אחרת לא ניתן היה לקבל את העיצוב בדוגמת). לשם כך, ברגע שסטנסיל כבר מיושר ולפני שהכניס את ירידת PDL על זה, המכשיר נחשב (MEA או coverslip) יש להשאיר בתא הוואקום לתקופה נכונה של זמן ובכך לספק התקשרות טובה שלו על פני השטח. אותו נעשה פעם אחת טיפת PDL מושם על סטנסיל על מנת לחסל את בועות האוויר שיוצרות בין ההתקן והירידה עצמו ובכך מאפשר PDL ליצור קשר עם פני השטח.
השלבים הקריטיים של הפרוטוקול המתואר מיוצגים על ידי: א) שלב ציפוי הספין שאמור להבטיח כדי לקבל "העתקים פתוחים" או, לפחות, מספקסרט ently דק על מבני SU8 שניתן להסיר בקלות באמצעות פינצטה; ii) עיבוד משטחי culturing (כיסוי להחליק או MEA); iii) את המיקום של שבלונות PDMS עליו; ד) שלב הציפוי שכן יש מקרים שבו, אם מסכת PDMS אינה חותמת כראוי נגד המצע שעליו ממוקם, זה יכול לקרות כי חלבון הדבק עובר מתחת למסכה וכך לפגוע בדפוסים. אז, תהליך הניקוי של המכסה מחליק או MEAs הוא ראשונה בחשיבותו, כמו גם את היישור של סטנסיל PDMS. מופעים נכונים של שני שלבים הבאים להבטיח תוצאות הטובות ביותר דפוסים.
המגבלות של טכניקה זו גם צריכה לעשות עם שני אלקטרו ורכישת ההדמיה סידן. במקרה הראשון, ברזולוציה מרחבית נמוכה מאוד (4-8 אלקטרודות כלולות בכל מודול) היא הווה הן בשל הממדים של המעגל היחיד וdistanc בין-אלקטרודהדואר. במקרה השני, הסיכון מורכב באינו מוצא את הצפיפות הסלולרית האופטימלית המאפשרת קבלת שכבה סלולרית דו-ממדית, ובכך למנוע רכישת רזולוציה תא בודדת.
אסטרטגיה זו, שנדרשה אופטימיזציה זהירה של הציפוי, ההרכבה ונהלי עיקור ויצירת מערכת מיקרו-יישור מותאם אישית, נתנה לנו כמה יתרונות עיקריים ביחס לעבודות שדווחה בעבר (למשל, ההישרדות לטווח הארוך של התאים שלנו, כלומר, עד 8 שבועות במבחנה). באופן ספציפי, זה סיפק לנו כליאה לטווח ארוך יותר יציבה ואמינה 24 ביחס לאסטרטגיות המבוססות על דפוסים כימיים 23-28.
ההליך המתואר מסתמך על ציפוי תאים בקליפת המוח במודולים מצופים PDL, אשר מבטיח ארגון העצמי של רשתות עצביות לתוך אסיפות מקושרות על ידי אקסונים ודנדריטים חבילות. כדי לאפשר הדמיה סידן רחב בתחום של רשת מודולריעובד עם רזולוציה תא בודדת, זה חיוני כי המערכת העצבית מארגנת לשכבת 2 ד. לכן זה קריטי כדי לייעל את הצפיפות של תאים מצופים שני להימנע מצפיפות גבוהה, אשכולות סלולריים או במודולים האחרים הקיצוניים בצפיפות הנמוכה המקטינים הסתברות חיבור בין מודול.
למרות שרשתות עצביות-גליה בתרבות לאבד הארגון המבני ב- vivo שלהם, הם באופן ספונטני עצמי לארגן למעגלים תפקודיים פעילים ומציעים את האפשרות לבצע מחקרים בתנאי ניסוי מבוקרים היטב. שתי הרשתות עצביות מודולרי ממדיים מורכבות ממעגלים תפקודי-היתר קשור המתוארים בפרוטוקול זה מספקים כלי רב עוצמה לחקירת הדינמיקה של תקשורת בין מכלולים עצביים ואת היכולת של רשתות עצביות מוגדרות מבחינה מבנית ליצירת רפרטואר רחב של מוטיבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לי המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי האירופית פרויקט BRIANBOW (הסיירים צעירים FP7-, המחברים מבקשים להודות לד"ר יאקופו Tessadori על הערות מועילות על כתב היד, וסילביה Chiappalone על עזרתה בהפקת הגרפיקה המשמשת בוידאו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Nalgene vacuum chamber | Thermo | 5305-0609 | |
| Poly-D-lysine PDL | Sigma | P7886 | |
| Silicone grease - SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| Spin coater | Laurell - Technologies Corporation | WS-650-23 | |
| 12-well culture plate | Sigma | CLS3336 | |
| 5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
| TC02 | Multi Channel Systems | ||
| Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
| B-27 | Gibco | 17504044 | |
| glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
| Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com |
| Silicon wafer | microchem | SU8-2075 | Preparation protocol: http://www.microchem.com |
References
- Buzsaki, G. Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68, 362-385 (2010).
- Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. Modular and hierarchically modular organization of brain networks. Frontiers in Neuroscience. 4, 200 (2010).
- Levy, O., Ziv, N. E., Marom, S. Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons. European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).
- Berdondini, L., et al. A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons. Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).
- Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PloS One. 9, e107400 (2014).
- Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits. PloS One. 5, e14443 (2010).
- Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology. Frontiers in Neuroengineering. 4, 10 (2011).
- Bonifazi, P., et al. In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses. Front Neural Circuits. 7, 40 (2013).
- Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording. Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).
- Marconi, E., et al. Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology. PloS One. 7, e34648 (2012).
- Taylor, A. M., Jeon, N. L. Microfluidic and compartmentalized platforms for neurobiological research. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39, 185-200 (2011).
- Sorkin, R., et al. Compact self-wiring in cultured neural networks. J Neural Eng. 3, 95-101 (2006).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems. Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).
- Campo, A. G. C. SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography. Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).
- Liu, G. T. Y. Kan Y Fabrication of high-aspect-ratio microstructures using SU8 photoresist. Microsystem Technologies. 11, 343-346 (2005).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15, 2973-2984 (1999).
- Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 2, 19-31 (1980).
- Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro. Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).
- Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture. Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).
- Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74, 61-66 (1972).
- Herzog, N., Shein-Idelson, M., Hanein, Y. Optical validation of in vitro extra-cellular neuronal recordings. J Neural Eng. 8, 056008 (2011).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177, 241-249 (2009).
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab Chip. 9, 404-410 (2009).
- Georger, J. H., et al. Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth. Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).
- Torimitsu, K., Kawana, A. Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture. Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).
- Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks. Medical & Biological Engineering & Computing. 36, 135-141 (1998).
- Petrelli, A., et al. Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays. Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).
- Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Hippocampal networks on reliable patterned substrates. Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).
