Summary
Questo manoscritto descrive un protocollo di crescere in vitro reti modulari composti da spazialmente confinate, circuiti neuronali funzionalmente interconnessi. Una maschera polimerica viene usata per modello uno strato proteico per favorire l'adesione cellulare su substrato di coltura. Neuroni placcato crescono su aree rivestite stabilire connessioni spontanee e che presentano attività elettrofisiologica.
Abstract
Il cervello opera attraverso l'attivazione coordinata e la comunicazione dinamica di assiemi neuronali. Un importante questione aperta è come un vasto repertorio di motivi dinamici, che sono alla base funzioni cerebrali più diverse, può emergere da un'organizzazione topologica fissa e modulare di circuiti cerebrali. Rispetto a studi in vivo di circuiti neuronali che presentano difficoltà intrinseche sperimentali, preparati in vitro offrono una possibilità molto più grande di manipolare e sondare le proprietà strutturali, dinamiche e chimiche dei sistemi neuronali sperimentali. Questo lavoro descrive un metodo sperimentale in vitro che permette crescente di reti modulari composti da spazialmente distinte, assemblee di neuroni funzionalmente interconnessi. Il protocollo consente il controllo bidimensionale (2D) architettura della rete neuronale a diversi livelli di complessità topologica.
Un patterning rete desiderata può essererealizzato sia su vetrini regolari e substrato integrato array micro elettrodi. Strutture microlavorati sono impressi su un wafer di silicio e usati per creare matrici polimeriche biocompatibili, che incorporano le caratteristiche negative della architettura di rete desiderato. Le matrici sono disposte sui substrati di coltura durante la procedura di rivestimento con uno strato molecolare per promuovere l'adesione cellulare. Dopo la rimozione delle matrici, i neuroni sono placcati e spontaneamente reindirizzato alle zone rivestite. Diminuendo la distanza inter-vano, è possibile ottenere circuiti neuronali o isolate o interconnessi. Per promuovere la sopravvivenza delle cellule, le cellule sono co-coltura con una rete neuronale supporto che si trova alla periferia del piatto di coltura. Registrazioni elettrofisiologiche e ottiche di attività delle reti modulari ottenuti rispettivamente mediante substrato integrato micro schiere di elettrodi e di imaging di calcio sono presentati. Mentre ogni modulo mostra SPONTsincronizzazioni globali aneous, il verificarsi di sincronizzazione tra moduli è regolata dalla densità di collegamento fra i circuiti.
Introduction
Evidenze sperimentali e teorici sostengono la possibilità che il cervello opera attraverso l'attivazione coordinata di gruppi di cellule 1-5, che può essere considerato come unità funzionali dinamici che transientemente interagiscono tra loro, sagomatura e sottostanti diversi stati cerebrali. Modularità funzionale dipende anche e associato con l'organizzazione modulare strutturale dei circuiti cerebrali 6,7. Come funzione e la struttura dei circuiti cerebrali reciprocamente forma l'altro è ancora una delle principali questioni aperte nel campo delle neuroscienze. Per fornire una comprensione più approfondita di questa domanda, è importante identificare quadri sperimentali ottimali dove è possibile affrontare, almeno parzialmente, tali problemi. Dal controllo manipolazione delle dinamiche spazio-temporali delle reti neuronali in esperimenti in vivo è impegnativo, lo sviluppo di modelli in vitro reti neuronali è di notevole interesse per la loro facile accessibility, il monitoraggio, la manipolazione e modellazione 8,9. Negli ultimi anni, nel settore delle tecnologie in vitro sostenute da metodi di substrato patterning avanzati hanno permesso di indurre le reti neuronali per sviluppare una gamma di strutture modulari predefinite 3 e per studiare le proprietà funzionali delle reti con topologie imposti 10. In particolare, i metodi sono stati recentemente utilizzati per organizzare reti imponendo vincoli fisici 4,11. Infatti, per studiare il legame tra struttura e funzione nelle reti neuronali e per fornire una rappresentazione semplificata ma plausibile di interagire assiemi neuronali, sistemi in vitro dovrebbero fornire neuronali sottopopolazioni interconnessi. Omogenei colture neuronali ampiamente studiato 2D non impongono vincoli spaziali sul cablaggio emergenti auto-organizzato dei circuiti. Quindi un possibile approccio per modellare gruppi di cellule artificialmente interconnessi è di posizionare diverse popolazioni neuronali in battibeccoaree distinte buona resa. La distanza tra queste zone non impedisce i collegamenti assemblee interrelazioni. Questo approccio, pur garantendo un controllo notevole sopra complessità della rete, ha dimostrato di fornire un repertorio ricco di modelli di sincronizzazione 6,7,12.
Al fine di facilitare una coltura riproducibile di gruppi neuronali modulari, un protocollo per assemblare l'auto-organizzazione di reti in cluster neuronali collegati da assoni e dendriti è presentato e descritto. La struttura polimerica per il confinamento fisico di colture neuronali è stato creato da polydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS è un elastomero ampiamente utilizzati per applicazioni biomediche grazie alla sua biocompatibilità, la trasparenza e la permeabilità ai gas 13. Il PDMS è preparato e escluso dalla SU8 micromachined 2075 14,15 strutture da-spin rivestimento a PDMS liquido su un "maestro" come descritto in precedenza in Jackman et al. 16 THa raggiunto modellato reti neuronali sono composti da moduli di diverse dimensioni interconnesse e che sono stati ottenuti con successo su entrambi i vetrini e Micro Electrode Array (MEA) 17-20. La densità delle connessioni tra i moduli può cambiare le caratteristiche della sincronizzazione di rete, da una rete completamente sincronizzato, tipica delle culture uniformi, a stati transitori di sincronizzazione tra i moduli.
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Protocol
La procedura è stata effettuata in conformità con le norme NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio ed è stato approvato dall'Università Cura e uso Comitato Tel-Aviv animali (numero di permesso - L-14-019).
1. Preparazione degli strumenti e PDMS
- Preparare il wafer (Table of Materials, o ordinare il wafer da un laboratorio di microfabbricazione), un bisturi, e un paio di pinzette - la sterilizzazione non è necessario.
- Preparare la soluzione di poli-D-lisina (PDL) secondo le seguenti condizioni: 4 mg / ml in 0,1 M tampone borato, pH 8, e conservare a -20 ° C.
- Preparare stencil PDMS secondo la seguente procedura:
- Preparare polidimetilsilossano (PDMS, elastomero siliconico) miscelando la base e il vulcanizzante con un rapporto di 10: 1, quindi agitare le sostanze 2 per circa 5 min.
- Mettere in camera a vuoto due volte per 15 minuti ogni volta e verificare le bolle sono andati.
- Quandoil PDMS è pronto, preparare rotazione coater: manopole azoto aperte per consentire l'utilizzo del gas, posizionare il wafer di silicio (Figura 1A) sul filatore, e utilizzare il vuoto per evitare che si muova.
- Versare PDMS su wafer e attivare il filatore per 1 min a 1000 rpm (crea circa 100 micron altezza).
- Inserire wafer su una piastra calda a 100 ° C per 30 min.
- Quando il PDMS è indurito, delineare i confini del stencil con PDMS, con pipetta Pasteur. Inserire wafer su una piastra calda a 100 ° C per 30 min.
- Quando i confini PDMS hanno indurito, utilizzare un bisturi per tagliare gli stampini in base ai confini e staccare lo stencil di silicio dal wafer (PDMS un quadrato contenente un singolo modello).
2. Petri Dish e copertura di slittamento Preparazione
- Preparare 23 millimetri scivola copertura di vetro quadrato e pulirli secondo il seguente ordine:
- Lavare con acqua distillata, 70% di etanolo e acetone.
- Lavare con isopropanolo e asciugare velocemente con azoto.
- Posizionare fantasia PDMS stencil su coprioggetto, e premere delicatamente per verificare che siano saldamente attaccati alla superficie del vetro. Porre in camera a vuoto per 15 min.
- Depositare 1 ml di PDL su stencil. Inserire il vetrino nella camera a vuoto per due volte per 20 minuti ogni volta, e lasciare PDL O / N a secco.
- Preparare capsula di Petri per creare una rete di cellule di supporto:
- Coprire la superficie del piatto (3,5 cm) con 1 ml di PDL per 2 ore a RT. Rimuovere la goccia Pdl con una pipetta.
- Lavare con acqua distillata e lasciare asciugare. Mettere una piccola goccia di grasso al silicone su ogni angolo del vetrino.
- Posizionare il vetrino al centro del piatto Petri (cioè, le PDMS devono essere rivolti verso l'alto) e premere delicatamente per verificare l'attaccamento.
- Rimuovere delicatamente PDMS dal coprioggetto con una pinzetta. Per la sterilizzazione, esporre a illuminazione UV per 7 min.
- Clean MEA in questo ordine (Table of Materials):
- Lavare con acqua sotto rubinetto e sonicare in un detergente enzimatico concentrato 3 volte.
- Sonicare in acqua distillata per 3 volte.
- Lavare con acqua distillata (in cappa, 1.000 punta microlitri) per 3 volte e posto sotto UV per 30 min.
- Sostenere la preparazione di rete:
- Preparare lo stampo rete di supporto progettato.
- Versare PDMS in una piastra 12 pozzetti (22 mm di diametro).
- Quando il PDMS è indurito estrarre lo stampo ed utilizzando un bisturi, tagliare un foro nel mezzo per creare una forma ad anello.
- Inserire uno stampo rete di supporto progettata sul centro del MEA (Figura 2A) e coprire il resto della superficie con PDL per 2 ore a temperatura ambiente.
- Rimuovere PDL con pipetta e lavare con acqua distillata.
- Togliere lo stampo e lasciare asciugare (figura 2A). </ Li>
- Preparare lo stampo rete di supporto progettato.
- Allineare stencil al MEA nel seguente modo:
- Mettere stencil su designato micro manipolatore. Utilizzare un microscopio invertito per allineare con precisione struttura modellata agli elettrodi, e abbassare la matrice finché non viene posto sulla superficie MEA (Figura 2B).
Nota: Il contatto con un MEA ben pulita fornisce adesione concorrenziali tra le PDMS e MEA stesso. - Sollevare il micromanipolatore e, se necessario, utilizzare una pinzetta per applicare una piccola quantità di pressione sopra i PDMS per evitare che il distacco dal MEA.
- Premere delicatamente stencil sulla superficie MEA, e utilizzare il microscopio per verificare che sia saldamente collegato, e ben allineata. (Figura 2C-D).
- Mettere stencil su designato micro manipolatore. Utilizzare un microscopio invertito per allineare con precisione struttura modellata agli elettrodi, e abbassare la matrice finché non viene posto sulla superficie MEA (Figura 2B).
- Inserire MEA in camera a vuoto per 15 min; mettere una goccia 1 ml di PDL su stencil.
- Inserire nella camera a vuoto 2 volte per 20 minuti ciascuno. Lasciare asciugare PDL O / N in incubatrice.
- Prima di placcatura, rimuovere le PDMS stencil da MEA e lavare con sterili wAter. Mettere sotto illuminazione UV per 7 min.
4. Dissection e Cultura
- Preparare le culture come descritto in Herzog et al. 2011 21.
5. placcatura
- Calcolare il numero di cellule necessarie per la placcatura, utilizzando un emocitometro (densità ottimale in base alle dimensioni del circuito come discusso nel risultato).
- Assicurarsi che la camera di conteggio (emocitometro) è pulito e mettere un vetrino su di esso (l'uso di alcol per la pulizia).
- Diluire 10 ml di sospensione di cellule in 190 microlitri di placcatura medio (diluizione 1:20).
- Carico 10 microlitri di cellule diluite sul bordo della camera di conteggio e lentamente pipettare le cellule che permetta la camera di riempimento stesso.
- Utilizzando un microscopio invertito, visualizza la griglia emocitometro. Determinare il numero di cellule nella camera mediante conteggio diretto (cellule sane dovrebbero essere rotondo). Contare le cellule all'interno del grande piazzale without quelli che attraversano i bordi.
- Calcolare la concentrazione di cellule:
Numero di cellule / 1000 ml = cellule totali contate × fattore di diluizione × 10 4 (zona del emocitometro).
Nota: Ad esempio, se il fattore di diluizione è 20 e le cellule totali contate erano 100:
100 × 20 × 10 4 = 0.1 x 10 7 cellule / 1.000 ml o 1 x 10 6/100 l. Per piastra 0,75 x 10 6 cellule, prendere 75 microlitri fuori delle cellule.
- Prendere il numero di cellule necessarie per la placcatura per singolo MEA o capsula di Petri, risospendere le cellule per prevenire l'aggregazione, e li piastra al centro, sulla parte superiore della zona patternate (se necessario, è possibile diluire le cellule nel mezzo) . Per la MEA, una goccia 100 ml nel mezzo. Per vetrino, una goccia di 1000 ml in mezzo.
- Incubare le cellule piastrate a 37 ° C per 40 min. Aggiungere mezzo placcatura alle cellule piastrate, fino a 1ml per MEA e 2 ml per vetrino.
- Tenere a 37 ° C e, ogni 4 giorni, diluire con mezzo di crescita fresco arricchito con 0,5 Pen-Strep, 2% B-27 e 0,75% Glutamax.
- Dal 6/7 DIV, dopo aver visto i collegamenti tra le isole, diluire media con 10 microlitri / ml FUDR (25 mg + 62,5 mg deossiuridina uridina in 12,5 ml MEM (Minimum Essential Media Aquila)) o qualsiasi altro agente anti-mitotico per evitare gliale crescita eccessiva.
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Representative Results
Un SU8-2075 stampo su un wafer di silicio con uno spessore di circa caratteristica 100 micron è stato utilizzato per modellare i PDMS. Il modello era composta di quadrati di varie dimensioni, con una lunghezza laterale e distanza variabile tra 200 e 700 micron (Figura 1B). La dimensione della piazza stata scelta per adattarsi al campo di vista di un 10X (per isole con una lunghezza laterale <800 micron) e un obiettivo 20X (per isole con una lunghezza laterale <400 micron). Tre parametri, vale a dire cellule densità di placcatura, distanza tra i circuiti, le dimensioni dei circuiti 'sono determinanti per l'ottenimento monolayers o circuiti cluster nonché per imporre e modellare la loro connettività. Tuttavia, questi parametri non sono indipendenti in quanto, data una distanza fissa tra i due circuiti, la probabilità che spontaneamente stabiliscono un aumento connessione con dimensioni dei circuiti. Nell'esempio discusso in questo lavoro, per piccoli moduli neuronali di ~ 300 x 300 micron, connessionisono stati stabiliti quando la distanza non era più grande di ~ 300-400 micron, mentre per i grandi moduli neuronali di ~ 700 x 700 micron, i collegamenti sono stati stabiliti quando la distanza era più piccolo di ~ 700 micron. In generale, aumentando la distanza tra i quadrati era possibile modificare la probabilità di stabilire generati spontaneamente interconnessioni tra i moduli, passando dai moduli altamente collegati a quelli isolati.
Moduli neuronali di ~ 600 x 600 micron sono mostrati a 4 giorni in vitro (DIV; Figura 3a). Dopo alcuni giorni in vitro neuroni trovano principalmente nelle zone rivestite mentre non è possibile osservare sviluppati processi neuronali e connessioni. Al contrario, a 14 DIV (Figura 3B-C) neuroni stabiliscono connessioni all'interno e tra i moduli. Mentre grandi circuiti neuronali di ~ 600 x 600 micron possono auto-organizzarsi in monostrati (Figura 3A-C), circuiti di smalleDimensioni r (ad esempio, ~ 300 x 300 micron di figura 3D) tendevano a raggrupparsi. Pertanto, al fine di ottenere la migliore calibrazione per circuiti bidimensionali, le cellule sono state piastrate a densità diversa che varia da 0,25 x 06-01 ottobre x 10 6 cellule / 23 coprioggetto mm attaccato in una capsula Petri da 35 mm. Per i più grandi circuiti del ~ 700 x 700 micron abbiamo scoperto che 0,75 x 10 6 cellule / 23 millimetri vetrino fissato in un piatto 35 millimetri Petri è la densità ottimale che induce la formazione di circuiti monostrato non impedire la loro interconnessione spontaneo (Figura 3C ). Lo stesso risultato di circuito monostrato è stato ottenuto nei circuiti minori di ~ 300 x 300 micron dalla placcatura 0,5 x 10 6 cellule / 23 millimetri vetrino attaccato in una capsula di Petri da 35 mm. In generale, quando si considera la densità di placcatura cellule, è importante sottolineare che, come precedentemente discusso 7, cellule neuronali e gliali hanno una tendenza innata a raggrupparsi, quindi un certo grado di clustering è quasi inevitabile dopo qualche tempo nella cultura. Tuttavia, abbiamo osservato che aumentando la superficie destinata alla rete di supporto aumenterebbe la probabilità di sopravvivenza circuiti e la loro organizzazione mono-strato, probabilmente a causa di una grande concentrazione di nutrienti nello spazio extracellulare. In ogni caso, è necessario un approccio per tentativi ed errori per identificare l'ottimale densità di placcatura delle cellule per creare circuiti mono-strato per l'imaging del calcio. Ogni 4 giorni medio è stato diluito con terreno di coltura fresco. Dal 6/7 DIV, dopo aver visto i collegamenti tra le isole, 10 ml / ml FUDR è stato aggiunto per impedire la crescita eccessiva gliale.
La Figura 4 mostra la dinamica di una rete modulare registrata usando calcium imaging (eseguita come descritto in Bonifazi et al. 2013 8). Immagini Calcio- fluorescenza sono stati acquisiti utilizzando un obiettivo di ingrandimento 4X, che ha consentito il monitoraggio dell'attività dell'intera rete (Figure 4A). Analisi della calcium imaging è stata eseguita come descritto in Bonifazi et al. 2013 8. Nella Figura 4B raster trama degli eventi di calcio insorgenza visualizzazione attività spontanea è presentato (colori corrispondono ai moduli contrassegnati in figura 4A). Calcio Imaging è stata effettuata a 30 Hz, e la dimensione dell'immagine è di 1.000 x 1.000 pixel.
I moduli verdi e rosa sono altamente sincronizzati come mostrato nella trama raster (Figura 4B) in accordo con i loro fasci di spessore di collegamento, eventualmente corrispondente ad un elevato numero di connessioni (Figura 4A). I moduli blu e rosso sono debolmente collegati ai moduli verdi e rosa e pertanto talvolta sincronizzati con essi (Figura 4B). Un video della registrazione è disponibile online (film M1).
L'immagine di una rete modulare coltivate su un MEA a 21 DIV è mostrato in Figura 5A. Ioordine n per ottenere la migliore calibrazione per circuiti bidimensionali, abbiamo placcato cellule corticali con diversa densità che varia da 250 x 10 3 a 500 x 10 3 cellule / per MEA. 250 x 10 3 cellule / MEA per 30 mm (anello) hanno dato risultati migliori in termini di formazione di circuiti monostrato, pur non impedendo loro interconnessione spontanea. Reti neuronali Una fantasia sono stati raggiunti su MEA substrato (Figura 5A), l'attività elettrofisiologica è stato monitorato con un sistema commerciale utilizzato per l'acquisizione e la registrazione di segnali elettrofisiologici. L'attività spontanea di culture viene rilevato mediante l'algoritmo 22 Timing Precise Detection Spike (PTSD).
La figura 5B mostra un grafico raster corrispondente a 5 min di attività spontanea (solo elettrodi attivi sono visibili), colore codificato secondo il numero di cluster. Osservando queste trame, è possibile fare valutazioni qualitativedell'attività di singoli cluster e di tutta la rete, allo stesso tempo. In particolare, è possibile osservare una forte sincronizzazione tra le attività registrate all'interno di ciascun cluster. Un video di una registrazione rappresentante di culture fantasia su MEA è disponibile online (film M2).
Figura 1. silicio. (A) Il wafer di silicio (~ diametro di 4 pollici) utilizzati per modellare gli stencil PDMS. Diverse strutture SU8 rappresentano diverse reti modulari. (B) progettazione funzione Rappresentante implementata su un wafer di silicio per la costruzione di reti modulari. Ogni punto verde definire una struttura a pilastri SU8 e quindi l'area per un singolo modulo. I disegni all'interno del rettangolo nero tratteggiato corrispondono a tre differenti matrici che possono essere utilizzati su vetrini cultura quadrati standard di 23 millimetri len latogth. In ogni stencil, l'asterisco indica un macro-regione per la rete di sostegno. A seconda della distanza tra i punti, il circuito di dimensione finita o moduli potrebbero essere in grado di stabilire connessioni neuronali spontanee tra di loro. Il disegno delle caratteristiche è stato scelto per creare diverse dimensioni del modulo e la distanza tra moduli per realizzare circuiti neuronali isolate o interconnessi che possa adattare il campo di vista in diversi ingrandimenti oggettivi (4X, 10X e 20X, il campo di vista per ogni ingrandimento è rappresentato dai quadrati rossi). Le caratteristiche fuori dal rettangolo nero tratteggiato sono progettati per adattarsi l'uso simultaneo di MEA e calcio di imaging. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2.Strutture PDMS deposizione su un MEA. (A) PDMS stampo con una forma ad anello (contrassegnata dalla freccia rossa) montato su un MEA. Lo stampo viene utilizzato per rivestire la superficie destinata alla rete neuronale supporto e situato alla periferia dell'area di coltura (questa è limitata dalla anello montato sulla MEA e contrassegnata dalla freccia verde). (B) di un allineamento stencil PDMS sulla MEA usando un micro manipolatore. (C) PDMS stencil depositato sul sulla MEA dopo l'allineamento. (D) Immagine di un stencil PDMS su MEA con un ingrandimento 10x (distanza inter-elettrodo è 500 micron). È possibile notare i fori stencil in corrispondenza degli elettrodi. Lo strato adesivo favorire l'adesione cellulare verrà depositato solo sulle zone aperte. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3. reti neuronali modulari a diversi DIV. Campo immagine luminosa di moduli corticali di ~ 600 x 600μm (A) dopo 4 DIV e (B) dopo 14 DIV. (C) Nota le interconnessioni spontanee tra i circuiti dopo il 14 DIV. Le cellule sono state piastrate alla densità cellulare ottimale per i grandi circuiti di organizzare in monostrati, vale a dire, 750 x 10 3 cellule / 23 millimetri vetrino fissato in un piatto 35 millimetri Petri. (D) Utilizzo PDMS caratteristiche di metà dimensioni e concentrazione cellulare stesso, circuiti neuronali organizzati in strutture cluster. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 4. Imaging di calcio di reti modulari. (A), le cellule corticali (18 DIV) caricato con l'indicatore di calcio OGB. Diversi colori segnano diversi moduli. Il campo visivo è di 2 x 2 mm. (B) Raster trama di attività spontanea. I diversi colori corrispondono alle cellule all'interno di diversi moduli, come mostrato in pannello A. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. MEA registrazione delle reti modulari. (A) di rete modulare (neuroni corticali, 21 DIV), composto da 3 circuiti distinti coltivate su un MEA 4Q. Circuiti neuronali sono distanti ~ 600 micron interconnessi tra di loro. (B) Raster trama che mostra 5 min di elettr spontaneala registrazione di attività ophysiological. C1, C2 e C3 corrispondono, rispettivamente, a sinistra in alto, in basso a destra e le attività del cluster in basso a sinistra, evidenziato in diversi colori. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Un protocollo di crescere reti neuronali modulari 2D in vitro composto da circuiti funzionalmente interconnessi è descritto. La procedura si basa su uno strato adesivo patterning cellulare. Patterning si ottiene con PDMS stencil riproduce la caratteristica negativa della architettura di rete desiderato. Stencil PDMS definiscono le aree in cui lo strato adesivo cellulare è depositato. Una volta che le cellule sono placcati, spontaneamente si riuniscono per le isole ricoperte e di auto-organizzarsi in circuiti interconnessi attivi. Registrazioni di reti modulari funzionali registrati con MEA e l'imaging di calcio è stato presentato.
Il protocollo presentato è stato debitamente modificato rispetto alla procedura seguita inizialmente. In primo luogo, i problemi con l'allineamento PDMS stencil 'dovevano essere affrontati. Dal momento che l'allineamento deve essere raggiunto al primo tentativo (una volta lo stencil ha toccato la superficie, non è consigliabile a trasferirsi esso), questo problema è stato superatoabbandonando la procedura manuale e optando per un nuovo metodo che consiste nell'usare un micro manipolatore per la deposizione precisa stencil sulla superficie di registrazione MEA. Un altro problema che doveva essere affrontato consiste nell'impedire la caduta Pdl di passare sotto la stencil allineato (altrimenti il disegno fantasia non poteva ottenere). Per fare ciò, una volta che la matrice è stato allineato e prima di mettere la goccia PDL su di esso, il dispositivo in esame (MEA o coprioggetto) deve essere lasciato nella camera a vuoto per un adeguato periodo di tempo, fornendo così un buon fissaggio del sul di superficie. Lo stesso è stato fatto una volta che la goccia PDL è posto sul stencil per eliminare le bolle d'aria che si formano tra il dispositivo e la goccia si permettendo così la PDL per entrare in contatto con la superficie.
Le fasi critiche del protocollo descritto sono rappresentati da: i) la fase di centrifuga rivestimento che dovrebbe garantire arrivare "repliche aperti" o, almeno, un sufficipellicola temente sottile sopra le strutture SU8 che possono essere facilmente rimossi con pinzette; ii) il trattamento della superficie di coltura (vetrino o MEA); iii) il posizionamento delle matrici PDMS su di esso; iv) la fase di rivestimento poiché ci sono casi in cui, se la maschera PDMS non tiene perfettamente contro il substrato su cui è posizionato, potrebbe accadere che la proteina adesiva passa sotto la maschera compromettendo così il patterning. Così, il processo di pulizia dei vetrini coprioggetto o MEA è di importanza primaria e l'allineamento del stencil PDMS. Performance corretta di questi due passaggi garantiscono migliori risultati patterning.
Le limitazioni di questa tecnica hanno a che fare sia con la elettrofisiologico e l'acquisizione di immagini di calcio. Nel primo caso, una risoluzione molto bassa spaziale (4 - 8 elettrodi sono inclusi in ogni modulo) è presente a causa sia delle dimensioni del singolo circuito e la distanc inter-elettrodoe. Nel secondo caso, il rischio consiste nel non trovare la densità cellulare ottimale che consente di ottenere uno strato cellulare bidimensionale, impedendo così una singola acquisizione risoluzione cella.
Questa strategia, che richiede una attenta ottimizzazione del rivestimento, assemblaggio e procedure di sterilizzazione e la creazione di un sistema di micro-allineamento personalizzato, ci ha dato alcuni importanti vantaggi rispetto ai lavori precedentemente riportato (ad esempio, la sopravvivenza a lungo termine delle nostre cellule, cioè, fino a 8 settimane in vitro). In particolare, ci ha fornito un lungo periodo di confinamento più stabile e affidabile 24 rispetto alle strategie basate su patterning chimico 23-28.
La procedura descritta si basa sulla placcatura cellule corticali moduli PDL-rivestiti, che assicura l'auto-organizzazione di reti in gruppi di neuroni collegati da assoni e dendriti bundle. Per consentire a grande campo di calcio di imaging della rete modularelavora con risoluzione singola cella, è essenziale che il sistema neuronale organizza in un livello 2D. Pertanto è importante per ottimizzare la densità delle cellule piastrate sia per evitare alta densità, cluster cellulari o altri moduli densità estremamente basse che riducono tra moduli probabilità collegamento.
Anche se le reti neuronali, gliali in coltura perdono la loro organizzazione strutturale in-vivo, spontaneamente auto-organizzano in circuiti funzionali attivi che offrono la possibilità di effettuare studi in condizioni sperimentali ben controllate. Le due reti neuronali modulari tridimensionali composte da circuiti funzionalmente interconnessi descritti in questo protocollo forniscono un potente strumento per indagare le dinamiche di comunicazione tra gruppi di neuroni e la capacità delle reti neuronali strutturalmente definiti per generare vasto repertorio di motivi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal BRIANBOW Progetto Europeo (7PQ Giovani Esploratori, Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Jacopo Tessadori per gli utili commenti sul manoscritto, e Silvia Chiappalone per il suo aiuto nel produrre la grafica utilizzata nel video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Nalgene vacuum chamber | Thermo | 5305-0609 | |
| Poly-D-lysine PDL | Sigma | P7886 | |
| Silicone grease - SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| Spin coater | Laurell - Technologies Corporation | WS-650-23 | |
| 12-well culture plate | Sigma | CLS3336 | |
| 5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
| TC02 | Multi Channel Systems | ||
| Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
| B-27 | Gibco | 17504044 | |
| glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
| Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com |
| Silicon wafer | microchem | SU8-2075 | Preparation protocol: http://www.microchem.com |
References
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