Summary
Dette manuskriptet beskriver en protokoll for å vokse in vitro modulære nettverk bestående av romlig trange, funksjonelt inter-tilkoblet nevrale kretser. Et polymert masken blir brukt til å mønstre et proteinsjikt for å fremme cellulær adhesjon i løpet av dyrknings substratet. Belagt nevroner vokse på belagte områder etablerer spontane tilkoblinger og stiller elektrofysiologisk aktivitet.
Abstract
Hjernen opererer gjennom koordinert aktivering og dynamisk kommunikasjon av nevronale forsamlinger. Et stort åpent spørsmål er hvordan et stort repertoar av dynamiske motiver, som ligger til grunn for de forskjelligste hjernefunksjoner, kan komme ut av en fast topologisk og modulær organisering av hjernen kretser. Sammenlignet med in vivo-studier av nervekretser som presenterer eksperimentelle iboende vanskeligheter, in vitro preparater gir en mye større mulighet til å manipulere og undersøke de strukturelle, dynamiske og kjemiske egenskaper av eksperimentelle neuronale systemer. Dette arbeidet beskriver en in vitro eksperimentell metode som gjør det mulig å vokse av modulære nettverk komponert av romlig distinkte, funksjonelt sammenhengende nevronale forsamlinger. Protokollen muliggjør styring av to-dimensjonale (2D) arkitektur av neuronal nettverk på forskjellige nivåer av topologisk kompleksitet.
En ønsket nettverk mønster kan væreoppnås både på vanlige dekkglass og substrat innebygd mikroelektrode arrays. Mikro strukturer er preget på en silisiumskive og brukes til å lage biokompatible polymere stensiler, som omfatter de negative trekk ved den ønskede nettverksarkitektur. Sjablonene er plassert på dyrkingsunderlag under overflatebelegg prosedyre med en molekylsjikt for å fremme cellulær adhesjon. Etter fjerning av sjabloner blir neuroner belagt og de spontant omdirigert til de belagte områder. Ved å redusere inter-rommet avstand, er det mulig å oppnå enten isolerte eller sammenkoblede neuronal kretser. For å fremme celleoverlevelse, celler ko-dyrket med en bære neuronal nettverk som ligger ved periferien av kulturskålen. Elektrofysiologiske og optiske opptak av aktiviteten av modulære nettverk som oppnås henholdsvis ved hjelp av substrat innebygde mikroelektrodegrupper og kalsium avbildning er presentert. Mens hver modul viser spontaneous globale synkroniseringer, er forekomsten av inter-modul-synkronisering regulert av tettheten av forbindelse mellom kretsene.
Introduction
Eksperimentelle og teoretiske bevis støtter den mulighet at hjernen opererer gjennom koordinert aktivering av celleenhetene 1-5, som kan betraktes som dynamiske funksjonsenheter som transient samvirker med hverandre, forme og underliggende forskjellige hjernetilstander. Funksjonell modularitet er også avhengig av og i forbindelse med den strukturelle modulær organisering av hjernen kretser 6,7. Hvordan funksjon og struktur av hjernekretser gjensidig forme hverandre er fortsatt en av de viktigste åpne spørsmål i nevrovitenskap. Å gi en dypere forståelse av dette spørsmålet, er det viktig å identifisere optimale eksperimentelle rammeverk hvor det er mulig å ta opp, i hvert fall delvis, disse problemene. Siden kontrollert manipulering av rom-tid-dynamikk nevrale nettverk i in vivo-eksperimenter er utfordrende, utvikling av in vitro modeller nevrale nettverk er av betydelig interesse på grunn av deres enkle accessibility, overvåking, manipulasjon og modellering 8,9. I de senere årene, in vitro teknologier støttes av avanserte underlaget mønstrings metoder har lov til å indusere nevrale nettverk for å utvikle en rekke forhåndsdefinerte modulære strukturer 3 og å studere funksjonelle egenskaper nettverk med pålagte topologies 10. Spesielt ble metoder nylig brukt til å organisere nettverk ved å pålegge fysiske begrensninger 4,11. Faktisk, for å studere sammenhengen mellom struktur og funksjon i nevrale nettverk og for å gi en forenklet men plausibel representasjon av samspill nevrale forsamlinger, bør in vitro-systemer gir sammenhengende nevronale undergrupper. Allment studert 2D homogene nevrale kulturer ikke pålegge noen romlige begrensninger på selvorganisert emergent kabling av kretsene. Derfor en mulig tilnærming til å forme kunstig sammenhengende celleforsamling er å posisjonere ulike nevronale populasjoner i spyttetially forskjellige områder. Avstanden mellom disse områdene hindrer ikke inter forsamlinger tilkoblinger. Denne tilnærmingen, samtidig som man sikrer en betydelig kontroll over nettverket kompleksitet, har vist seg å gi en rikere repertoar av synkroniserings modeller 6,7,12.
For å muliggjøre en reproduserbar dyrkning av modulære neuronal sammenstillinger, til en protokoll montere selv-organisering av nevrale nettverk i klynger koblet av aksoner og dendritter er presentert og beskrevet. Polymer struktur for fysisk innesperring av nevrale kulturer har blitt opprettet fra polydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS er en elastomer mye brukt for biomedisinske anvendelser på grunn av dets biokompatibilitet, transparens og permeabilitet for gasser 13. PDMS er forberedt og ekskludert fra mikromaskinert SU8 2075 14,15 strukturer av spin-belegg en flytende PDMS på en "master" som beskrevet tidligere i Jackman et al. 16 Than oppnådde mønstret nevrale nettverk er sammensatt av sammenhengende moduler av ulik størrelse, og de har blitt innhentet på begge dekkglass og Micro elektrode Arrays (måle) 17-20. Tettheten av forbindelser mellom modulene kan endre funksjonene i nettverk synkronisering, fra en fullt synkronisert nettverk, typisk for ensartede kulturer, til forbigående tilstander av synkronisering mellom modulene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedyren ble utført i samsvar med NIH standarder for omsorg og bruk av forsøksdyr og ble godkjent av Tel-Aviv University Animal Care og bruk komité (tillatelse nummer - L-14-019).
1. Klargjøring av instrumenter og PDMS
- Klargjør wafer (Table of Materials, eller bestille wafer fra en microfabrication lab), en skalpell og en pinsett - sterilisering er ikke nødvendig.
- Gjør poly-D-lysin (PDL) løsning i henhold til følgende betingelser: 4 mg / ml i 0,1 M boratbuffer, pH 8, og oppbevares ved -20 ° C.
- Forbered PDMS sjablonger i henhold til følgende prosedyre:
- Forbered polydimetylsiloksan (PDMS, silikon-elastomer) ved å blande sammen base og herder med et forhold på 10: 1, deretter røre de to stoffer i omtrent 5 min.
- Plassere i vakuumkammeret to ganger i 15 min hver gang og verifisere boblene blir borte.
- NårPDMS er klar, forberede sentrifuge coater: åpen nitrogen knotter for å tillate gass bruk, plasseres på silikonplaten (figur 1A) på spinneren, og bruke vakuum for å hindre den fra å bevege seg.
- Hell PDMS løpet wafer og aktivere den spinner for en min ved 1000 rpm (skaper ca 100 mikrometer høyde).
- Plassere skiven på en varm plate ved 100 ° C i 30 min.
- Når PDMS har herdet, skissere sjablong grenser med PDMS, ved hjelp av Pasteur pipette. Plassere skiven på en varm plate ved 100 ° C i 30 min.
- Når PDMS grenser har herdet, kan du bruke en skalpell til å kutte sjablonger i henhold til grensene og skrelle av silisium sjablong fra wafer (en kvadratisk PDMS inneholder et enkelt mønster).
2. Petri Dish og Cover Slip Forberedelse
- Forbered 23 mm firkantet glass dekkglass og rengjør dem etter følgende rekkefølge:
- Vask med destillert vann, 70% etanol og aceton.
- Vask med isopropanol og rask tørr med nitrogen.
- Plassere mønstrede PDMS sjablonger på dekkglass, og trykk forsiktig for å kontrollere at de er godt festet til glassflaten. Plasser i vakuumkammeret i 15 min.
- Slippe en ml PDL på sjablong. Sett dekk inn i vakuumkammeret to ganger i 20 min hver gang, og la PDL O / N for å tørke.
- Forbered petriskål for å skape en støttende cellenettverk:
- Dekke overflaten av skålen (3,5 cm) med 1 ml av PDL i 2 timer i romtemperatur. Ta av PDL slipp ved hjelp av en pipette.
- Vask med destillert vann og la tørke. Plasser en liten dråpe silikonfett på hvert hjørne av dekkglass.
- Plasser dekkglass på midten av petriskål (dvs. bør PDMS vende opp) og trykk forsiktig for å bekrefte vedlegg.
- Forsiktig fjerne PDMS fra dekkglass ved hjelp av pinsett. For sterilisering, utsettes for UV-belysning for 7 min.
- Ren MEA i denne rekkefølgen (Table of Materials):
- Vask med vann under springen og sonikere i en konsentrert, enzymatisk rengjøringsmiddel 3 ganger.
- Sonikere i destillert vann tre ganger.
- Vask med destillert vann (i hetten, 1,000 mL tip) i 3 ganger og anbring under UV i 30 min.
- Støtte nettverk forberedelse:
- Klargjør utformet støttenettverk mold.
- Hell PDMS inn i en 12-brønns plate (mm diameter 22).
- Når PDMS er herdet ta ut av formen og ved hjelp av en skalpell, skjære et hull i midten for å skape en ringform.
- Plasser en utformet støttenettverk forme på midten av MEA (figur 2A) og dekker resten av overflaten med PDL i 2 timer ved RT.
- Fjern PDL ved hjelp av pipette og vask med destillert vann.
- Fjerne mugg og la tørke (Figur 2A). </ Li>
- Klargjør utformet støttenettverk mold.
- Rett sjablong til MEA på følgende måte:
- Plassere sjablong på utpekte micro manipulator. Bruke et invertert mikroskop for nøyaktig å justere mønstret struktur til elektrodene, og senke sjablongen inntil den er plassert på MEA overflaten (figur 2B).
Merknad: Ta kontakt med en godt rengjort MEA gir konkurranse vedheft mellom PDMS og MEA selv. - Løft mikromanipluatoren og om nødvendig bruke pinsett for å bruke en liten mengde press over PDMS for å hindre at det løsner fra MEA.
- Trykk forsiktig sjablong til MEA overflaten, og bruke mikroskop for å kontrollere at den er godt festet, og godt justert. (Figur 2C-D).
- Plassere sjablong på utpekte micro manipulator. Bruke et invertert mikroskop for nøyaktig å justere mønstret struktur til elektrodene, og senke sjablongen inntil den er plassert på MEA overflaten (figur 2B).
- Plasser MEA i vakuumkammeret i 15 min; sette en 1 ml dråpe PDL på sjablong.
- Sett inn i vakuumkammeret 2 ganger i 20 minutter hver. La PDL tørke O / N i kuvøse.
- Før plating, fjerne PDMS sjablonger fra MEAs og vaske å bruke steril water. Plasser under UV-lys i 7 minutter.
4. Dissection og kultur
- Forbered kulturer som beskrevet i Herzog et al. 2011 21.
5. Plating
- Beregn antall celler som er nødvendig for plettering, ved hjelp av et hemocytometer (optimal tetthet i henhold til størrelsen av kretsen som diskutert i resultatet).
- Sørg for at tellekammeret (hemocytometer) er ren og plassere en dekkglass på den (bruk alkohol for å rengjøre).
- Fortynn 10 ul av cellesuspensjonen i 190 ul av pletteringsmedium (fortynning 1:20).
- Laste 10 ul av de fortynnede celler ut mot kanten av tellekammer og sakte pipettere cellene ut slik at kammeret til å fylle seg selv.
- Ved hjelp av en invertert mikroskop, visualisere hemocytometer rutenettet. Bestemme antall celler i kammeret ved direkte telling (friske celler bør være rundt). Telle cellene i den store plassen withoút de krysset kantene.
- Beregne konsentrasjonen av celler:
Totalt antall celler / mL = 1,000 Total celler tellet x fortynningsfaktor x 10 4 (område av hemocytometer).
Merk: For eksempel, hvis fortynningsfaktoren var 20, og de totale celler tellet var 100:
100 × 20 × 10 4 = 0,1 x 10 7 celler / 1000 mL eller 1 x 10 6/100 ul. For å plate 0,75 x 10 6 celler, ta 75 ul av cellene.
- Ta antall celler som er nødvendig for pletterings per enkelt MEA eller petriskål, resuspender cellene for å hindre aggregering, og plate dem i senter, på toppen av patternate område (om nødvendig, er det mulig å fortynne cellene i mediet) . For MEA, legg en 100 mL dråpe i midten. For dekkglass, plasserer en 1000 mL dråpe i midten.
- Inkuber de pletterte celler ved 37 ° C i 40 min. Legg pletteringsmedium til de pletterte celler, opp til 1ml pr MEA og 2 ml pr dekkglass.
- Holde ved 37 ° C, og hver 4. dag, fortynne med frisk vekst medium beriket med 0,5 Pen-Strep, 2% B-27 og 0,75% Glutamax.
- Fra 6/7 DIV, etter å ha sett forbindelser mellom øyene, fortynne medium med 10 pl / ml FUDR (25 mg deoksyuridin + 62,5 mg uridin i 12,5 ml MEM (Minimum Essential Medium Eagle)) eller noen andre anti-mitotisk middel for å forhindre glial gjengroing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En SU8-2075 forme på en silisiumskive med en funksjon tykkelse på omtrent 100 um ble anvendt til å forme PDMS. Mønsteret var sammensatt av kvadratene av flere dimensjoner, med en sidelengde og avstand som varierer mellom 200 og 700 um (figur 1B). Størrelsen av plassen ble valgt for å passe til synsfeltet i en 10 ganger (for øyer med en sidelengde <800 um), og av et 20X objektiv (for øyer med en sidelengde <400 um). Tre parametere, nemlig celle plating tetthet, avstand mellom kretser, kretser 'størrelse er determinant for å skaffe monosjiktene eller gruppert kretser samt å pålegge og forme sin tilkobling. Men disse parametre er ikke uavhengige siden, gitt en fast avstand mellom to kretser, er sannsynligheten for at de spontant etablere en forbindelse med økning kretsene 'størrelse. I det eksempel som omtalt i dette arbeidet, for små neuronale moduler av ~ 300 x 300 mikrometer, tilkoblingerble etablert når avstanden var ikke større enn ~ 300-400 mikrometer, mens for store nevronale moduler av ~ 700 x 700 mikrometer, tilkoblinger ble etablert når avstanden var mindre enn ~ 700 mikrometer. Generelt, ved å øke avstanden mellom rutene var det mulig å endre sannsynligheten for å etablere spontant generert inter-forbindelser mellom modulene, og går fra høyt til tilkoblede moduler isolerte seg.
Neuronal moduler av ~ 600 x 600 um er vist i 4 dager in vitro (DIV; Figur 3A). Etter noen dager in vitro-nevroner er stort sett ligger innenfor de belagte områder, mens det ikke er mulig å observere utviklede neuronale prosesser og forbindelser. Tvert imot, ved 14 DIV (figur 3B-C) neuroner etablere forbindelser innenfor og mellom modulene. Mens større nevrale kretser av ~ 600 x 600 mikrometer kan selv organisere inn monosjiktene (figur 3A-C), kretser av smaller dimensjoner (f.eks ~ 300 x 300 mikrometer i Figur 3D) hadde en tendens til å klynge. Derfor, for å oppnå den beste kalibrering for todimensjonale kretser, ble celler platet med forskjellig densitet varierende fra 0,25 x okt 6 til 1 x 10 6 celler / 23 mm dekkglass festet i en 35 mm petriskål. For større kretser av ~ 700 x 700 mikrometer fant vi at 0,75 x 10 6 celler / 23 mm dekkglass festet i en 35 mm petriskål er den optimale tettheten som induserer dannelsen av monolayer kretser ikke hindre deres spontane inter-tilkobling (Figur 3C ). Det samme resultatet av monolag krets ble oppnådd i mindre kretser av ~ 300 x 300 um ved utsåing av 0,5 x 10 6 celler / 23 mm dekkglass festet i en 35 mm petriskål. Generelt, når man vurderer celleplette tetthet, er det viktig å fremheve at, som tidligere omtalt 7, neuronale og gliale celler har en iboende tendens til å klynge, slik at en viss grad av clustering er nesten uunngåelig etter noen tid i kultur. Imidlertid ble det observert at en økning av området bestemt til å støtte nettverket ville øke sannsynligheten for kretsene 'overlevelse og deres mono-lag organisasjon, sannsynligvis på grunn av en større konsentrasjon av næringsstoffer i det ekstracellulære rom. I alle tilfelle blir en prøve og feile metode for å identifisere det optimale cellepletteringstettheten for å lage mono-lag kretser for kalsium avbildning. Hver 4. dag ble mediet fortynnet med ferskt vekstmedium. Fra 6/7 DIV, etter å ha sett forbindelser mellom øyene, 10 mL / ml FUDR har blitt lagt for å forhindre glial gjengroing.
Figur 4 viser dynamikken i et modulært nettverk er tatt opp med kalsium imaging (utført som beskrevet i Bonifazi et al. 2013 8). Kalsium- fl uorescence bildene ble anskaffet ved hjelp av en 4X forstørrelse objektiv, som gjorde det mulig å overvåke aktiviteten til hele nettverket (Figure 4A). Analyse av kalsium avbildning ble utført som beskrevet i Bonifazi et al. 2013 8. I figur 4B raster plott av kalsium hendelser utbruddet viser spontan aktivitet er presentert (Fargene tilsvarer moduler merket i figur 4A). Kalsium bildebehandling ble utført ved 30 Hz, og bildestørrelsen er 1000 x 1000 piksler.
De grønne og rosa moduler er sterkt synkronisert slik det er vist i raster plottet (figur 4B) i overensstemmelse med deres forbindelses tykke bunter, eventuelt tilsvarende et stort antall forbindelser (figur 4A). De blå og røde moduler er svakt koblet til de grønne og rosa moduler og derfor de av og til synkronisert med dem (figur 4B). En video av opptaket er tilgjengelig på nettet (film M1).
Bildet av et modulbasert nettverk dyrket på en MEA ved 21 DIV er vist i figur 5A. Jegn For å oppnå den beste kalibrering for todimensjonale kretser, vi belagt kortikale celler med forskjellig densitet varierende fra 250 x 10 3-500 3 x 10 celler / MEA pr. 250 x 10 3 celler / per MEA (30 mm ring) ga bedre resultater i form av dannelsen av monolayer kretser, mens ikke hindre deres spontane inter-tilkobling. Når mønstrede nevrale nettverk har blitt oppnådd på MEAs substrat (figur 5A), elektrofysiologisk aktivitet har blitt overvåket ved hjelp av et kommersielt system som brukes for å anskaffe og opptak elektrofysiologiske signaler. Spontan aktivitet av kulturer er oppdaget ved hjelp av Presis timing Spike Detection (PTSD) algoritme 22.
Figur 5B viser en raster tomten tilsvarer 5 min av spontan aktivitet (bare aktive elektroder er synlige), farget kodet i henhold til klyngen nummeret. Ved å se på disse plottene, er det mulig å foreta kvalitative vurderingerav aktiviteten til enkeltklynger og for hele nettverket på samme tid. Spesielt er det mulig å observere en sterk synkronisering mellom aktivitetene innspilt i hver klynge. En video av en representant opptak fra mønstrede kulturer enn MEA er tilgjengelig på nettet (film M2).
Figur 1. Silicon wafer. (A) Et silikonplaten (~ 4 cm diameter) som brukes til å forme de PDMS sjablonger. Ulike SU8 strukturer representerer ulike modulære nettverk. (B) Representant har design implementert på en silisiumskive for modulære nettverk konstruksjon. Hver grønn flekk definere et SU8 søylestrukturen og dermed området for en enkelt modul. Designene innenfor den stiplede svarte firkanten tilsvare tre forskjellige sjablonger som kan brukes på standard firkantede kultur Dekk av 23 mm side length. I hver sjablong, en stjerne angir en makro-området for støttenettverket. Avhengig av avstanden mellom stedene, kan den endelige størrelse krets eller moduler kunne etablere spontane nevronale forbindelser mellom dem. Utformingen av funksjonene ble valgt for å skape ulike modulen størrelse og inter-modul avstand for å oppnå isolerte eller sammenhengende nevrale kretser som kan passe synsfeltet i forskjellige objektiv forstørrelser (4X, 10X og 20X, synsfeltet for hver forstørrelse er representert ved de røde firkanter). Funksjonene ut av den stiplede svarte firkanten er designet for å passe samtidig bruk av MEA og kalsium bildebehandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2.PDMS strukturer avsetning på et MEA. (A) PDMS form med en ringform (merket med rød pil) som er montert på en MEA. Formen blir brukt til å belegge området bestemt til å støtte neuronal nettverket og ligger på periferien til dyrkningsområdet (dette er begrenset av ringen er montert på MEA og merket med grønn pil). (B) Justering av en PDMS sjablong på MEA ved hjelp av en mikromanipulator. (C) PDMS sjablong avsatt på den MEA etter innretting. (D) Bilde av en PDMS sjablong på MEA ved anvendelse av en 10 x forstørrelse (inter-elektrodeavstanden er 500 um). Det er mulig å merke hullene på sjablonger i korrespondanse av elektrodene. Limet laget favoriserer cellular heft vil bli satt bare på de åpnede områdene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
ge = "always"> 
Figur 3. Modular nevrale nettverk på ulike DIV. Bright felt bilde av kortikale moduler av ~ 600 x 600 urn (A) etter 4 DIV og (B) etter 14 DIV. (C) Legg merke til de spontane sammenhengene mellom kretsene etter 14 DIV. Cellene ble sådd på optimal celletetthet for store kretser å organisere inn monosjiktene, dvs. 750 x 10 3 celler / 23 mm dekkglass festet i en 35 mm petriskål. (D) Bruke PDMS funksjoner i halv størrelse og samme celle konsentrasjon, nevrale kretser organisert i klynger strukturer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
highres.jpg "width =" 700 "/>
Figur 4. Kalsium avbildning av modulære nettverk. (A) kortikal celler (18 DIV) lastet med kalsiumindikator OGB. Ulike farger markere ulike moduler. Synsfeltet er 2 x 2 mm. (B) Raster tomt på spontan aktivitet. De ulike fargene tilsvarer de cellene i forskjellige moduler som vist i panel A. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. MEA opptak av modulære nettverk. (A) Modular nettverk (kortikale nevroner, 21 DIV) består av tre forskjellige kretser dyrket på en 4Q MEA. Neuronal kretser er fjernt ~ 600 mikrometer sammenkoplet med hverandre. (B) Raster plott som viser 5 min strøm av spontanophysiological aktivitet opptak. C1, C2 og C3 tilsvarer henholdsvis til øvre venstre, nederst til høyre og nederst til venstre klyngens aktiviteter, fremhevet i forskjellige farger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En protokoll for å vokse 2D modulære nevrale nettverk in vitro sammensatt av funksjonelt sammenhengende kretser er beskrevet. Fremgangsmåten er basert på mønstring av et cellulært klebelag. Mønster oppnås med PDMS sjablonger reprodusere den negative trekk ved den ønskede nettverksarkitektur. PDMS sjablonger definere områder hvor det cellulære klebemiddellaget er avsatt. Når cellene blir sådd ut, de spontant å sette sammen de belagte øyer og selv organisere til aktive sammenhengende kretser. Innspillinger av funksjonelle modulære nettverk tatt opp med MEAs og kalsium bildebehandling ble presentert.
Den presenterte protokollen har blitt behørig endret i forhold til opprinnelig fulgt prosedyren. For det første, problemer med PDMS sjablonger 'justering måtte tas opp. Siden justeringen må være oppnådd i første forsøk (når sjablongen har berørt overflaten, er det ikke anbefalt å flytte den), har dette problemet blitt løstved å forlate den manuelle prosedyre, og å velge for en ny metode som består av ved hjelp av en mikromanipulator for nøyaktig sjablong avsetning på MEA opptaksområdet. Et annet problem som måtte løses består i å hindre PDL dråpe fra å passere under justert sjablong (ellers mønstret design kan ikke oppnås). For å gjøre dette, når sjablong har blitt justert og før du setter PDL slipp på den, anses enhet (MEA eller dekkglass) må være igjen i vakuumkammeret for en skikkelig periode og dermed gi et godt feste den på overflate. Det samme er gjort når PDL dråpe er plassert på sjablongen for å eliminere luftbobler som dannes mellom enheten og slipp seg dermed gir PDL å komme i kontakt med overflaten.
De kritiske trinnene i den beskrevne protokollen er representert ved: i) spinnbelegging fasen som skal garantere å få "åpne kopier" eller, i det minste, en sufficiently tynn film over Su8 strukturer som lett kan fjernes ved hjelp av en pinsett, ii) behandling av dyrkningsflate (dekkglass eller MEA), iii) plassering av PDMS sjablonger på den; iv) beleggfasen, siden det er tilfeller hvori, dersom PDMS masken ikke tetter skikkelig mot underlaget som er plassert, kan det skje at klebe protein passerer under masken således svekke mønstring. Så, er renseprosessen av dekkglass eller MEAs av primær betydning, samt justering av PDMS sjablong. Riktig forestillinger av disse to trinnene sikre best mulig mønstrings resultater.
Begrensninger av denne teknikken har også å gjøre med både elektrofysiologisk og kalsium bildebehandling oppkjøpet. I det første tilfelle, en meget lav romlig oppløsning - er (4 8 elektroder inngår i hver modul) som er tilstede på grunn av både dimensjonene av enkeltkrets og den inter-elektrode distance. I det andre tilfellet, består risikoen for ikke å finne den optimale celletetthet som gjør det mulig å oppnå en todimensjonal cellelaget, og dermed hindre en enkelt tilgang celleoppløsning.
Denne strategien, som krevde en forsiktig optimalisering av belegget, montering og sterilisering prosedyrer og etablering av en tilpasset mikro-justering systemet, ga oss noen store fordeler med hensyn til tidligere rapportert verk (f.eks langsiktig overlevelse av cellene våre, dvs. opp til 8 uker in vitro). Spesifikt, det ga oss med en mer stabil og pålitelig langsiktig sperring 24 med hensyn til strategier basert på kjemisk mønster 23-28.
Den beskrevne prosedyren er avhengig av plating kortikale celler på PDL-belagt moduler, som forsikrer at selvorganisering av nettverk i nevronale forsamlinger koblet av axoner og dendritter bunter. Å tillate bredt felt kalsium avbildning av den modulære nettarbeider med en enkelt celle oppløsning, er det viktig at den neuronale system organiserer i et 2D-lag. Derfor er det viktig å optimere tettheten av belagte celler både for å unngå høy tetthet, celleklynger, eller på de andre ekstreme lav tetthet moduler som reduserer inter-modul-forbindelse sannsynlighet.
Selv om nevrale-glial nettverk i kultur mister sin in-vivo strukturell organisasjon, de spontant selv organisere inn i aktive funksjonelle kretser som tilbyr muligheten til å gjennomføre studiene under godt kontrollerte eksperimentelle forhold. De todimensjonale modulære nevrale nettverk bestående av funksjonelt sammenhengende kretser beskrevet i denne protokollen gir et kraftig verktøy for å undersøke dynamikken i kommunikasjon mellom nerve forsamlinger og kapasiteten på strukturelt definerte nevrale nettverk til å generere store repertoar av motiver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av det europeiske prosjektet BRIANBOW (FP7- Young Explorers, ville Forfatterne takke Dr. Jacopo Tessadori for nyttige kommentarer til manuskriptet, og Silvia Chiappalone for hennes hjelp i å produsere grafikk som brukes i videoen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Nalgene vacuum chamber | Thermo | 5305-0609 | |
| Poly-D-lysine PDL | Sigma | P7886 | |
| Silicone grease - SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| Spin coater | Laurell - Technologies Corporation | WS-650-23 | |
| 12-well culture plate | Sigma | CLS3336 | |
| 5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
| TC02 | Multi Channel Systems | ||
| Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
| B-27 | Gibco | 17504044 | |
| glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
| Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com |
| Silicon wafer | microchem | SU8-2075 | Preparation protocol: http://www.microchem.com |
References
- Buzsaki, G. Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68, 362-385 (2010).
- Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. Modular and hierarchically modular organization of brain networks. Frontiers in Neuroscience. 4, 200 (2010).
- Levy, O., Ziv, N. E., Marom, S. Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons. European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).
- Berdondini, L., et al. A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons. Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).
- Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PloS One. 9, e107400 (2014).
- Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits. PloS One. 5, e14443 (2010).
- Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology. Frontiers in Neuroengineering. 4, 10 (2011).
- Bonifazi, P., et al. In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses. Front Neural Circuits. 7, 40 (2013).
- Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording. Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).
- Marconi, E., et al. Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology. PloS One. 7, e34648 (2012).
- Taylor, A. M., Jeon, N. L. Microfluidic and compartmentalized platforms for neurobiological research. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39, 185-200 (2011).
- Sorkin, R., et al. Compact self-wiring in cultured neural networks. J Neural Eng. 3, 95-101 (2006).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems. Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).
- Campo, A. G. C. SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography. Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).
- Liu, G. T. Y. Kan Y Fabrication of high-aspect-ratio microstructures using SU8 photoresist. Microsystem Technologies. 11, 343-346 (2005).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15, 2973-2984 (1999).
- Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 2, 19-31 (1980).
- Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro. Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).
- Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture. Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).
- Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74, 61-66 (1972).
- Herzog, N., Shein-Idelson, M., Hanein, Y. Optical validation of in vitro extra-cellular neuronal recordings. J Neural Eng. 8, 056008 (2011).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177, 241-249 (2009).
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab Chip. 9, 404-410 (2009).
- Georger, J. H., et al. Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth. Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).
- Torimitsu, K., Kawana, A. Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture. Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).
- Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks. Medical & Biological Engineering & Computing. 36, 135-141 (1998).
- Petrelli, A., et al. Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays. Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).
- Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Hippocampal networks on reliable patterned substrates. Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).
