Summary
Este manuscrito describe un protocolo para crecer en redes modulares vitro consistentes espacialmente confinados, los circuitos neuronales interconectadas funcionalmente. Una máscara polimérico se utiliza para patrón de una capa de proteína para promover la adhesión celular sobre el sustrato de cultivo. Neuronas chapados crecen en zonas recubiertas establecimiento de conexiones espontáneas y que muestran actividad electrofisiológica.
Abstract
El cerebro funciona a través de la activación coordinada y la comunicación dinámica de las asambleas neuronales. Una pregunta abierta importante es cómo un vasto repertorio de motivos dinámicos, que subyacen más diversas funciones cerebrales, puede surgir de una organización fija topológica y modular de los circuitos cerebrales. En comparación con los estudios in vivo de los circuitos neuronales que presentan dificultades experimentales intrínsecas, las preparaciones in vitro ofrecen una posibilidad mucho mayor de manipular y probar las propiedades estructurales, dinámicos y químicas de los sistemas neuronales experimentales. Este trabajo describe una metodología experimental in vitro que permite cada vez mayor de las redes modulares compuestas por asambleas neuronales espacialmente distintas, funcionalmente interconectados. El protocolo permite el control de la (2D) de la arquitectura bidimensional de la red neuronal a diferentes niveles de complejidad topológica.
Un patrón de red deseada puede serlogrado tanto en cubreobjetos regulares y de sustrato incrustado arrays micro electrodos. Estructuras micromecanizadas están en relieve sobre una oblea de silicio y se utilizaron para crear plantillas poliméricos biocompatibles, que incorporan las características negativas de la arquitectura de red deseada. Las plantillas se colocan sobre los sustratos de cultivo durante el procedimiento de revestimiento de la superficie con una capa molecular para promover la adhesión celular. Después de la eliminación de las plantillas, las neuronas se sembraron y se redirigen de forma espontánea a las áreas recubiertas. Al disminuir la distancia inter-compartimiento, es posible obtener los circuitos neuronales ya sea aislados o interconectados. Para promover la supervivencia celular, las células se co-cultivaron con una red neuronal de soporte que está situado en la periferia de la placa de cultivo. Se presentan los registros electrofisiológicos y ópticas de la actividad de las redes modulares obtenidos respectivamente mediante el uso de sustrato incrustado micro matrices de electrodos y de imágenes de calcio. Si bien cada módulo muestra SPONTsincronizaciones globales aneous, la ocurrencia de sincronización entre módulos está regulado por la densidad de la conexión entre los circuitos.
Introduction
Evidencias experimentales y teóricos apoyan la posibilidad de que el cerebro opera a través de la activación coordinada de ensamblajes de pilas de 1-5, que puede considerarse como unidades funcionales dinámicos que interactúan transitoriamente uno con el otro, de conformación y diferentes estados cerebrales subyacentes. Modularidad funcional también es dependiente de y asociado con la organización modular estructural de los circuitos cerebrales 6,7. Cómo función y la estructura de los circuitos cerebrales moldean mutuamente sigue siendo una de las principales cuestiones abiertas en la neurociencia. Para proporcionar una comprensión más profunda de esta cuestión, es importante identificar los marcos experimentales óptimas donde es posible abordar, al menos parcialmente, esas cuestiones. Desde controlado manipulación de la dinámica espacio-temporal de las redes neuronales en experimentos in vivo es difícil, el desarrollo de modelos in vitro redes neuronales es de gran interés debido a su fácil accessibility, el seguimiento, la manipulación y el modelado de 8,9. En los últimos años, en tecnologías in vitro con el apoyo de métodos de modelado sustrato avanzadas han permitido inducir redes neuronales para desarrollar una gama de estructuras modulares predefinidos 3 y estudiar las propiedades funcionales de las redes con topologías impuestas 10. En particular, los métodos han sido recientemente utilizados para organizar redes mediante la imposición de restricciones físicas 4,11. De hecho, para estudiar la relación entre estructura y función en las redes neuronales y para proporcionar una representación simplificada pero plausible de la interacción conjuntos neuronales, sistemas in vitro deben proporcionar subpoblaciones neuronales interconectadas. Estudiados ampliamente cultivos neuronales homogéneos 2D no imponen limitaciones espaciales en el cableado emergente autoorganizada de los circuitos. Por lo tanto un posible enfoque para dar forma a las asambleas de células artificialmente interconectados es posicionar diferentes poblaciones neuronales en disputaially zonas distintas. La distancia entre estos ámbitos no impide las conexiones inter asambleas. Este enfoque, garantizando al mismo tiempo un control considerable sobre complejidad de la red, se ha demostrado proporcionar un repertorio más rico de los modelos de sincronización 6,7,12.
Con el fin de facilitar un cultivo reproducible de asambleas neuronales modulares, un protocolo de montar la auto-organización de las redes en conglomerados neuronales conectadas por axones y dendritas se presenta y describe. La estructura polimérica para el confinamiento físico de cultivos neuronales se ha creado a partir de polydimtheylsiloxane (PDMS). PDMS es un elastómero ampliamente utilizado para aplicaciones biomédicas debido a su biocompatibilidad, la transparencia y la permeabilidad a los gases 13. El PDMS se prepara y se excluye del SU8 micromecanizado 2075 14,15 estructuras por spin-coating un PDMS líquido en un "maestro" como se describe anteriormente en Jackman et al. 16 TLogró modelado redes neuronales están compuestos por módulos interconectados de diferentes tamaños y que se han obtenido con éxito en ambos cubreobjetos y Microelectrodo Arrays (AMUMA) 17-20. La densidad de las conexiones entre los módulos puede cambiar las características de la sincronización de la red, desde una red totalmente sincronizado, típico de las culturas uniformes, a los estados transitorios de la sincronización entre los módulos.
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Protocol
El procedimiento se realizó de acuerdo con las normas del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fue aprobado por el Cuidado y Uso Comité Universidad de Tel Aviv Animal (número de permiso - L-14-019).
1. Elaboración de Instrumentos y PDMS
- Preparar la oblea (Tabla de materiales, u ordenar la oblea de un laboratorio de microfabricación), un bisturí, y un par de pinzas - no es necesaria la esterilización.
- Hacer poli-D-lisina solución (PDL) de acuerdo con las siguientes condiciones: 4 mg / ml en tampón de borato 0,1 M, pH 8, y se almacena a -20 ° C.
- Preparar plantillas de PDMS de acuerdo con el siguiente procedimiento:
- Preparar polidimetilsiloxano (PDMS, elastómero de silicona) mezclando entre sí la base y el agente de curado con una proporción de 10: 1, a continuación, se agita la 2 sustancias para aproximadamente 5 min.
- Lugar en la cámara de vacío dos veces durante 15 minutos cada vez y verificar las burbujas se han ido.
- Cuandoel PDMS está listo, preparar recubridora de rotación: perillas de nitrógeno abiertos para permitir el uso de gas, colocar la oblea de silicio (Figura 1) en spinner, y utilizar el vacío para evitar que se mueva.
- Verter PDMS sobre la oblea y activar la spinner durante 1 min a 1000 rpm (crea aproximadamente 100 micras de altura).
- Coloque la oblea en una placa caliente a 100 ° C durante 30 min.
- Cuando el PDMS se ha endurecido, delinear las fronteras de la plantilla con PDMS, usando una pipeta Pasteur. Coloque la oblea en una placa caliente a 100 ° C durante 30 min.
- Cuando las fronteras PDMS se han endurecido, usar un bisturí para cortar plantillas de acuerdo con las fronteras y retire la plantilla de silicio de la oblea (a PDMS cuadrados que contienen un solo patrón).
2. Placa de Petri y cubierta Slip Preparación
- Preparar 23 mm cubreobjetos de vidrio cuadrado y limpiarlas de acuerdo con el siguiente orden:
- Lavar con agua destilada, etanol 70%, y acetona.
- Lavar con isopropanol y secado rápido con nitrógeno.
- Coloque estampadas PDMS plantillas en cubreobjetos, y presione suavemente para comprobar que están firmemente unidos a la superficie de cristal. Colocar en la cámara de vacío durante 15 min.
- Aplique 1 ml de PDL en la plantilla. Insertar el cubreobjetos en la cámara de vacío dos veces durante 20 min cada vez, y dejar PDL O / N a secar.
- Preparar placa de Petri para crear una red de células de soporte:
- Cubrir la superficie de la placa (3,5 cm) con 1 ml de PDL para 2 horas en RT. Retire la caída PDL usando una pipeta.
- Lavar con agua destilada y dejar secar. Coloque una muy pequeña gota de grasa de silicona en cada esquina del cubreobjetos.
- Coloque el cubreobjetos en el centro de la placa de Petri (es decir, el PDMS deben estar hacia arriba) y presione suavemente para verificar el apego.
- Retire con cuidado PDMS de cubreobjetos con unas pinzas. Para la esterilización, exponerlo a iluminación UV durante 7 minutos.
- MEA Limpio en este orden (Tabla de Materiales):
- Lavar con agua debajo del grifo y se somete a ultrasonidos en un detergente enzimático concentrado 3 veces.
- Someter a ultrasonidos en agua destilada 3 veces.
- Lavar con agua destilada (en campana, 1000 l punta) por 3 veces y de lugar en UV durante 30 minutos.
- Apoyo a la preparación de la red:
- Preparar el molde red de apoyo diseñado.
- Vierta PDMS en una placa de 12 pocillos (22 mm de diámetro).
- Cuando el PDMS se endurece sacar el molde y usando un bisturí, cortar un agujero en el centro para crear una forma de anillo.
- Colocar un molde red de apoyo diseñado en el centro de la MEA (Figura 2A) y cubrir el resto de la superficie con PDL durante 2 horas a RT.
- Retire PDL que usa la pipeta y lavar con agua destilada.
- Retire el molde y dejar secar (Figura 2). </ Li>
- Preparar el molde red de apoyo diseñado.
- Alinear la plantilla de MEA de la siguiente manera:
- Coloque la plantilla en manipulador micro designado. Utilice un microscopio invertido para alinear con precisión la estructura modelada a los electrodos, y bajar la plantilla hasta que se coloca en la superficie MEA (Figura 2B).
Nota: El contacto con un MEA bien limpia proporciona adhesión de competencia entre los PDMS y la propia AMA. - Levante el micromanipulador y si es necesario, utilizar pinzas para aplicar una pequeña cantidad de presión por encima de los PDMS para evitar que se separe de la MEA.
- Presione suavemente la plantilla a la superficie MEA, y utilizar el microscopio para verificar que esté bien conectado y bien alineada. (Figura 2C-D).
- Coloque la plantilla en manipulador micro designado. Utilice un microscopio invertido para alinear con precisión la estructura modelada a los electrodos, y bajar la plantilla hasta que se coloca en la superficie MEA (Figura 2B).
- Coloque MEA en la cámara de vacío durante 15 minutos; poner una gota 1 ml de PDL en la plantilla.
- Inserte en la cámara de vacío 2 veces durante 20 minutos cada uno. Deja PDL para secar O / N en la incubadora.
- Antes de chapado, retire el PDMS plantillas de los AMUMA y lavar con estéril water. Coloque bajo iluminación UV durante 7 minutos.
4. Disección y Cultura
- Preparar culturas como se describe en Herzog et al. 2011 21.
5. Chapado
- Calcular el número de células necesarias para el chapado, utilizando un hemocitómetro (densidad óptima de acuerdo con el tamaño del circuito como se discute en el resultado).
- Asegúrese de que la cámara de recuento (hemocitómetro) es limpio y coloque una hoja de la cubierta en el mismo (el consumo de alcohol para limpiar).
- Diluir 10 l de la suspensión de células en 190 l de medio de baño (dilución 1:20).
- Carga de 10 l de las células diluidas en el borde de la cámara de recuento y lentamente pipetear las células a cabo permitiendo que la cámara se llene.
- Usando un microscopio invertido, visualizar la rejilla hemocitómetro. Determinar el número de células en la cámara por recuento directo (células sanas deben ser redondos). Contar las células dentro de la gran plaza without los que cruzan los bordes.
- Calcular la concentración de las células:
Número total de células / 1000 l = células totales contadas × factor de dilución × 10 4 (área del hemocitómetro).
Nota: Por ejemplo, si el factor de dilución fue de 20 y las células totales contadas eran 100:
100 × 20 × 10 4 = 0,1 x 10 7 células / 1000 l o 1 x 10 6/100 l. Con el fin de placa 0,75 x 10 6 células, tomar 75 l fuera de las células.
- Tome el número de células necesarias para el chapado por MEA simple o placa de Petri, resuspender las células para evitar la agregación y la placa de ellos en el centro, en la parte superior de la zona patternate (si es necesario, es posible diluir las células en el medio) . Para la MEA, coloque una gota de 100 l en el medio. Por hoja de la cubierta, colocar una gota de 1.000 l en el medio.
- Incubar las células sembradas a 37 ° C durante 40 min. Añadir medio en placa para las células cultivadas en placas, hasta 1ml por MEA y 2 ml por hoja de la cubierta.
- Mantenga a 37 ° C y, cada 4 días, se diluye con medio de cultivo fresco enriquecido con 0,5 Pen-Strep, 2% de B-27 y 0,75% glutamax.
- De 6/7 DIV, después de ver las conexiones entre las islas, diluir medio con 10 l / ml FUDR (25 mg desoxiuridina + 62,5 mg de uridina en 12,5 ml de MEM (medio esencial mínimo de Eagle)) o cualquier otro agente anti-mitótico para evitar glial sobrecrecimiento.
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Representative Results
A SU8-2075 molde sobre una oblea de silicio con un espesor característica de aproximadamente 100 micras se utilizó para dar forma a los PDMS. El patrón se compone de los cuadrados de varias dimensiones, con una longitud de lado y la distancia que varía entre 200 y 700 micras (Figura 1B). El tamaño del cuadrado fue elegido para encajar el campo de visión de un 10X (por islas con una longitud de lado <800 micras) y de un objetivo 20X (por islas con una longitud de lado <400 micras). Tres parámetros, a saber densidad de placas de células, la distancia entre los circuitos, el tamaño de los circuitos 'son determinantes para la obtención de monocapas o circuitos agrupados, así como para imponer y dar forma a su conectividad. Sin embargo, estos parámetros no son independientes, ya que, dada una distancia fija entre dos circuitos, la probabilidad de que espontáneamente establecen un aumento conexión con el tamaño de los circuitos. En el ejemplo analizado en este trabajo, por pequeños módulos neuronales de ~ 300 x 300 micras, conexionesse establecieron cuando la distancia no era más grande que ~ 300 a 400 micras, mientras que para los grandes módulos neuronales de ~ 700 x 700 m, se establecieron conexiones cuando la distancia era menor que ~ 700 micras. En general, aumentando la distancia entre los cuadrados que era posible cambiar la probabilidad de establecer interconexiones generados espontáneamente entre los módulos, pasando de módulos altamente conectados a los aislados.
Módulos neuronales de ~ 600 x 600 micras se muestran a los 4 días in vitro (DIV; Figura 3A). Después de unos pocos días en las neuronas in vitro se encuentran principalmente dentro de las áreas recubiertas mientras que no es posible observar los procesos y conexiones neuronales desarrollados. Por el contrario, en 14 DIV (Figura 3B-C), las neuronas establecen conexiones dentro y entre los módulos. Mientras más grandes circuitos neuronales de ~ 600 x 600 micras pueden auto-organizarse en monocapas (Figura 3A-C), circuitos de smaller dimensiones (por ejemplo, ~ 300 x 300 m en la figura 3D) tendían a agruparse. Por lo tanto, con el fin de obtener la mejor calibración para circuitos de dos dimensiones, las células se colocaron en placas con diferente densidad que varía de 0,25 × 10 6 hasta 1 x 10 6 células / 23 mm de deslizamiento cubierta colocada en una placa de Petri de 35 mm. Para los circuitos más grandes de ~ 700 x 700 micras, se encontró que 0,75 x 10 6 células / 23 mm cubreobjetos se adjunta en un plato de Petri de 35 mm es la densidad óptima que induce la formación de circuitos monocapa no impedir su espontánea inter-conexión (Figura 3C ). El mismo resultado de circuito monocapa se obtuvo en los circuitos más pequeños de ~ 300 x 300 micras mediante siembra de 0,5 x 10 6 células / 23 mm cubreobjetos fijado en una placa de Petri de 35 mm. En general, cuando se considera densidad de placas de células, es importante destacar que, como se indicó anteriormente 7, las células neuronales y gliales tienen una tendencia innata a agruparse, lo cierto grado de clustering es casi inevitable después de algún tiempo en la cultura. Sin embargo, se observó que el aumento de la superficie destinada a la red de soporte aumentaría la probabilidad de supervivencia circuitos y de su organización mono-capas, probablemente debido una mayor concentración de nutrientes en el espacio extracelular. En cualquier caso, se requiere un enfoque de ensayo y error para identificar la densidad óptima de chapado de células para crear circuitos mono-capas de imágenes de calcio. Cada 4 días el medio se diluyó con medio de cultivo fresco. Desde 06.07 DIV, después de ver las conexiones entre las islas, / ml FUDR ha añadido 10 l para evitar el crecimiento excesivo de la glía.
La Figura 4 muestra la dinámica de una red modular registró usando imágenes de calcio (realizado como se describe en Bonifazi et al. 2013 8). Imágenes calcio fl uorescencia fueron adquiridos utilizando un objetivo de 4 aumentos, lo que permitió el control de la actividad de toda la red (Figure 4A). Análisis de la formación de imágenes de calcio se realizó como se describe en Bonifazi et al. 2013 8. En la figura 4B raster trama de los acontecimientos de calcio inicio mostrar la actividad espontánea se presenta (colores corresponden a los módulos marcados en la figura 4A). El calcio de imágenes se realizó a 30 Hz, y tamaño de la imagen es de 1000 x 1000 píxeles.
Los módulos de verde y rosa son altamente sincronizados como se muestra en la trama de trama (Figura 4B) de acuerdo con sus haces de espesor de conexión, posiblemente correspondiente a un gran número de conexiones (Figura 4A). Los módulos de color azul y rojo están débilmente conectados a los módulos de verde y rosa, por lo que en ocasiones se sincronizan con ellos (Figura 4B). Un video de la grabación está disponible en línea (película M1).
La imagen de una red modular crecido en un MEA en 21 DIV se muestra en la Figura 5A. YOorden n para obtener la mejor calibración para circuitos de dos dimensiones, que plateado células corticales con diferente densidad que varía de 250 x 10 3 a 500 x 10 3 células / por MEA. 250 x 10 3 células / por MEA (30 mm anillo) dieron mejores resultados en cuanto a la formación de circuitos monocapa, y no impide su espontánea interconexión. Redes neuronales Una vez modelados se han logrado en sustrato AMUMA (Figura 5), la actividad electrofisiológica ha sido objeto de seguimiento utilizando un sistema comercial utilizado para la adquisición y registro de señales electrofisiológicas. Se detecta la actividad espontánea de las culturas utilizando el algoritmo de detección de la sincronización exacta de Spike (TEPT) 22.
La Figura 5B muestra un gráfico de trama correspondiente a 5 min de la actividad espontánea (sólo electrodos activos son visibles), de color codificado según el número de clúster. Al observar estas parcelas, es posible hacer evaluaciones cualitativasde la actividad de las agrupaciones individuales y de toda la red al mismo tiempo. En particular, es posible observar una fuerte sincronización entre las actividades grabadas dentro de cada grupo. Un video de una grabación representante de culturas modeladas sobre MEA está disponible en línea (película M2).
Figura 1. Oblea de silicio. (A) La oblea de silicio (~ 4 pulgadas de diámetro) que se utiliza para moldear los stencils PDMS. Diferentes estructuras de SU8 representan diferentes redes modulares. (B) Diseño característica Representante implementado en una oblea de silicio para las redes modulares de construcción. Cada punto verde definir una estructura de pilares SU8 y por lo tanto la zona por un solo módulo. Los diseños dentro del rectángulo negro de trazos corresponden a tres plantillas diferentes que pueden ser utilizados en cubreobjetos de cultivo cuadrados estándar de 23 mm len ladoGTH. En cada plantilla, un asterisco marca una macrorregión para la red de apoyo. Dependiendo de la distancia entre los puntos, el circuito de tamaño finito o módulos podrían ser capaces de establecer conexiones neuronales espontáneas entre ellos. El diseño de las características fue elegido para crear diferentes tamaños de módulo y la distancia entre módulos para lograr circuitos neuronales aisladas o interconectados que podrían encajar el campo de visión en diferentes aumentos del objetivo (4X, 10X y 20X, el campo de visión para cada aumento es representada por los cuadrados rojos). Las características de cada rectángulo negro discontinua están diseñados para adaptarse a la utilización simultánea de imágenes MEA y calcio. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La Figura 2.PDMS estructuras deposición en un AMUMA. (A) PDMS molde con una forma de anillo (marcado con la flecha roja) montado en un MEA. El molde se utiliza para recubrir el área destinada a la red neuronal de soporte y situado en la periferia de la zona de cultivo (esto está limitado por el anillo montado en el MEA y marcada por la flecha verde). (B) Alineación de una plantilla PDMS en el MEA usando un manipulador micro. (C) PDMS plantilla depositado en el sobre MEA después de la alineación. (D) Imagen de una plantilla PDMS en MEA mediante un aumento de 10x (distancia entre electrodos es de 500 micras). Es posible observar los orificios de las plantillas en correspondencia de los electrodos. La capa adhesiva que favorece la adhesión celular se depositará sólo en las áreas abiertas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3. Las redes neuronales modulares en diferentes DIV. Imagen de campo claro de módulos corticales de ~ 600 x 600μm (A) después de 4 DIV y (B) después de 14 DIV. (C) Nota las interconexiones espontáneas entre los circuitos después de 14 DIV. Las células se sembraron en placas a la densidad celular óptima para los circuitos grandes a organizarse en monocapas, es decir, 750 x 10 3 células / 23 mm de deslizamiento cubierta colocada en una placa de Petri de 35 mm. (D) Uso de PDMS características de medio tamaño y la misma concentración de células, circuitos neuronales organizados en estructuras agrupadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 4. formación de imágenes de calcio de las redes modulares. células corticales (A) (18 DIV) cargadas con el indicador de calcio OGB. Los diferentes colores marcan diferentes módulos. El campo de visión es de 2 x 2 mm. (B) trama de la trama de la actividad espontánea. Los diferentes colores corresponden a las células dentro de los diferentes módulos como se muestra en el panel A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. MEA grabación de las redes modulares. (A) de red modular (neuronas corticales, 21 DIV), compuesto de 3 circuitos distintos que crecen en un MEA 4T. Circuitos neuronales son distantes ~ 600 micras interconectados entre sí. (B) parcela Raster muestran 5 min de electr espontáneagrabación actividad ophysiological. C1, C2 y C3 se corresponden, respectivamente, a la actividad de la agrupación inferior izquierda superior izquierda, la parte inferior derecha y, puesto de manifiesto en diferentes colores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Un protocolo para crecer redes neuronales modulares 2D in vitro compuesto por circuitos funcionalmente interconectados se describe. El procedimiento se basa en modelando una capa de adhesivo celular. Patrones se consigue con PDMS plantillas reproducir la característica negativa de la arquitectura de red deseada. Plantillas de PDMS definen las áreas en las que se deposita la capa adhesiva celular. Una vez que las células se colocan en placas, que espontáneamente se reúnen para las islas recubiertas y auto-organizan en circuitos interconectados activos. Se presentó Grabaciones de redes modulares funcionales grabadas con los AMUMA y de imágenes de calcio.
El protocolo presentado ha sido debidamente modificado en comparación con el procedimiento seguido inicialmente. En primer lugar, los problemas con la alineación de PDMS stencils 'tuvieron que ser tratados. Dado que la alineación tiene que ser alcanzado en el primer intento (una vez que la plantilla ha tocado la superficie, no se recomienda para reubicarlo), este problema ha sido superadoabandonando el procedimiento manual y optando por un nuevo método que consiste en utilizar un manipulador micro para la deposición de la plantilla precisa sobre el área de grabación MEA. Otra cuestión que había que abordar consiste en la prevención de la caída del PDL pasando por debajo de la plantilla alineado (de lo contrario el diseño modelado no se podían obtener). Para ello, una vez que la plantilla se ha alineado y antes de colocar la caída de PDL en él, el dispositivo considerado (MEA o cubreobjetos) tiene que ser dejado en la cámara de vacío durante un período adecuado de tiempo proporcionando así un buen agarre de la misma en el superficie. Lo mismo se ha hecho una vez que la caída de PDL se coloca sobre la plantilla con el fin de eliminar las burbujas de aire que se forman entre el dispositivo y la gota en sí permitiendo así que el PDL para ponerse en contacto con la superficie.
Los pasos críticos del protocolo descrito están representados por: i) la fase de recubrimiento por rotación que debe garantizar llegar "réplicas abiertas" o, al menos, un sufficitemente película delgada sobre las estructuras de SU8 que se pueden quitar fácilmente con unas pinzas; ii) el tratamiento de la superficie de cultivo (hoja de la cubierta o MEA); iii) la colocación de las plantillas de PDMS en él; iv) la fase de recubrimiento, ya que hay casos en el que, si la máscara de PDMS no sella apropiadamente contra el sustrato sobre el que se coloca, podría suceder que la proteína adhesivo pasa por debajo de la máscara comprometiendo así el patrón. Por lo tanto, el proceso de limpieza de los cubreobjetos o AAM es de importancia primaria, así como la alineación de la plantilla PDMS. Actuaciones propias de estos dos pasos aseguran mejores resultados de modelado.
Las limitaciones de esta técnica tienen también que ver tanto con la electrofisiología y la adquisición de imágenes de calcio. En el primer caso, una resolución espacial muy baja (4 - 8 electrodos están incluidos en cada módulo) está presente debido tanto a las dimensiones del circuito único y de la distanc entre electrodose. En el segundo caso, el riesgo consiste en no encontrar la densidad celular óptima que permite la obtención de una capa celular de dos dimensiones, evitando así una adquisición de resolución única célula.
Esta estrategia, que requiere una optimización cuidadosa del recubrimiento, el montaje y los procedimientos de esterilización y la creación de un sistema de micro-alineación costumbre, nos dio algunas ventajas importantes con respecto a las obras se informó anteriormente (por ejemplo, la supervivencia a largo plazo de nuestras células, es decir, hasta 8 semanas in vitro). En concreto, nos proporcionó un confinamiento más estable y fiable a largo plazo 24 con respecto a las estrategias basadas en patrones químicos 23-28.
El procedimiento descrito se basa en placas células corticales en módulos con recubrimiento de PDL, lo que asegura la auto-organización de las redes en las asambleas neuronales conectadas por axones y dendritas paquetes. Para permitir imágenes de calcio en todo el ámbito de la red modularfunciona con una sola célula de resolución, es esencial que el sistema neuronal organiza en una capa 2D. Por lo tanto, es fundamental para optimizar la densidad de células sembradas tanto para evitar la alta densidad, cúmulos celulares o en los otros módulos de baja densidad extremas que reducen la probabilidad de conexión entre módulos.
Aunque las redes neuronales glial en la cultura pierden su organización estructural-in vivo, que espontáneamente se auto-organizan en circuitos funcionales activos que ofrecen la posibilidad de realizar estudios en condiciones experimentales bien controlados. Las dos redes neuronales modulares tridimensionales compuestas de circuitos funcionalmente interconectados descritos en este protocolo proporcionan una potente herramienta para la investigación de la dinámica de la comunicación entre asambleas neuronales y la capacidad de las redes neuronales estructuralmente definidos para generar gran repertorio de motivos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el BRIANBOW Proyecto Europeo (el 7PM Jóvenes Exploradores, Los autores desean agradecer a la Dra Jacopo Tessadori por sus valiosos comentarios sobre el manuscrito, y Silvia Chiappalone por su ayuda en la producción de los gráficos utilizados en el video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS, Sylgard 184 | Dow Corning | ||
| Nalgene vacuum chamber | Thermo | 5305-0609 | |
| Poly-D-lysine PDL | Sigma | P7886 | |
| Silicone grease - SILICAID 1010 | aidchim Ltd | H3375 | |
| Spin coater | Laurell - Technologies Corporation | WS-650-23 | |
| 12-well culture plate | Sigma | CLS3336 | |
| 5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| MEA1060-Inv-BC | Multi Channel Systems | ||
| TC02 | Multi Channel Systems | ||
| Pen Strep | Biological Industries Beit Haemek | 03-033-1c | |
| B-27 | Gibco | 17504044 | |
| glutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| MEM Minimum Essential Medium-Eagle | Biological Industries Beit Haemek | 01-025-1B | |
| Micro Electrode Arrays 4Q | Multi Channel Systems | 60-4QMEA1000iR-Ti-pr | cleaning manual: http://www.multichannelsystems.com |
| Silicon wafer | microchem | SU8-2075 | Preparation protocol: http://www.microchem.com |
References
- Buzsaki, G. Neural syntax: cell assemblies, synapsembles, and readers. Neuron. 68, 362-385 (2010).
- Meunier, D., Lambiotte, R., Bullmore, E. T. Modular and hierarchically modular organization of brain networks. Frontiers in Neuroscience. 4, 200 (2010).
- Levy, O., Ziv, N. E., Marom, S. Enhancement of neural representation capacity by modular architecture in networks of cortical neurons. European Journal of Neuroscience. 35, 1753-1760 (2012).
- Berdondini, L., et al. A microelectrode array (MEA) integrated with clustering structures for investigating in vitro neurodynamics in confined interconnected sub-populations of neurons. Sensors and Actuators B-Chemical. 114, 530-541 (2006).
- Bisio, M., Bosca, A., Pasquale, V., Berdondini, L., Chiappalone, M. Emergence of bursting activity in connected neuronal sub-populations. PloS One. 9, e107400 (2014).
- Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Innate synchronous oscillations in freely-organized small neuronal circuits. PloS One. 5, e14443 (2010).
- Shein-Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. Engineered neuronal circuits: a new platform for studying the role of modular topology. Frontiers in Neuroengineering. 4, 10 (2011).
- Bonifazi, P., et al. In vitro large-scale experimental and theoretical studies for the realization of bi-directional brain-prostheses. Front Neural Circuits. 7, 40 (2013).
- Jungblut, M., Knoll, W., Thielemann, C., Pottek, M. Triangular neuronal networks on microelectrode arrays: an approach to improve the properties of low-density networks for extracellular recording. Biomedical Microdevices. 11, 1269-1278 (2009).
- Marconi, E., et al. Emergent functional properties of neuronal networks with controlled topology. PloS One. 7, e34648 (2012).
- Taylor, A. M., Jeon, N. L. Microfluidic and compartmentalized platforms for neurobiological research. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39, 185-200 (2011).
- Sorkin, R., et al. Compact self-wiring in cultured neural networks. J Neural Eng. 3, 95-101 (2006).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Characterization of polydimethylsiloxane (PDMS) properties for biomedical micro/nanosystems. Biomedical Microdevices. 7, 281-293 (2005).
- Campo, A. G. C. SU-8: a photoresist for high-aspect-ratio and 3D submicron lithography. Journal of Micromechanics and MicroengineeringEmail alert RSS feed. 17, 81-95 (2007).
- Liu, G. T. Y. Kan Y Fabrication of high-aspect-ratio microstructures using SU8 photoresist. Microsystem Technologies. 11, 343-346 (2005).
- Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15, 2973-2984 (1999).
- Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 2, 19-31 (1980).
- Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. New Fixed-Array Multi-Microelectrode System Designed for Long-Term Monitoring of Extracellular Single Unit Neuronal-Activity In vitro. Neuroscience Letters. 6, 101-105 (1977).
- Gross, G. W., Williams, A. N., Lucas, J. H. Recording of spontaneous activity with photoetched microelectrode surfaces from mouse spinal neurons in culture. Journal of Neuroscience Methods. 5, 13-22 (1982).
- Thomas, C. A., Springer, P. A., Loeb, G. E., Berwald-Netter, Y., Okun, L. M. A miniature microelectrode array to monitor the bioelectric activity of cultured cells. Experimental Cell Research. 74, 61-66 (1972).
- Herzog, N., Shein-Idelson, M., Hanein, Y. Optical validation of in vitro extra-cellular neuronal recordings. J Neural Eng. 8, 056008 (2011).
- Maccione, A., et al. A novel algorithm for precise identification of spikes in extracellularly recorded neuronal signals. Journal of Neuroscience Methods. 177, 241-249 (2009).
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab Chip. 9, 404-410 (2009).
- Georger, J. H., et al. Coplanar Patterns of Self-Assembled Monolayers for Selective Cell-Adhesion and Outgrowth. Thin Solid Films. 210, 716-719 (1992).
- Torimitsu, K., Kawana, A. Selective Growth of Sensory Nerve-Fibers on Metal-Oxide Pattern in Culture. Developmental Brain Research. 51, 128-131 (1990).
- Branch, D. W., Corey, J. M., Weyhenmeyer, J. A., Brewer, G. J., Wheeler, B. C. Microstamp patterns of biomolecules for high-resolution neuronal networks. Medical & Biological Engineering & Computing. 36, 135-141 (1998).
- Petrelli, A., et al. Nano-volume drop patterning for rapid on-chip neuronal connect-ability assays. Lab on a Chip. 13, 4419-4429 (2013).
- Boehler, M. D., Leondopulos, S. S., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. Hippocampal networks on reliable patterned substrates. Journal of Neuroscience Methods. 203, 344-353 (2012).
