Introduction
La peau est le plus grand organe du corps. Il crée une barrière entre l'environnement extérieur et les organes internes. En outre, la peau protège le corps contre la perte de liquide, influences de l'environnement, des blessures et des infections et aide à réguler la température corporelle 1. Grâce à sa situation exposée, la peau est souvent affectée par un traumatisme mécanique, thermique ou chimique. Bien que la peau est généralement capable d'auto-réparation, de multiples facteurs locaux tels que l'infection, l'oxygénation, et la suffisance veineuse peuvent conduire à la guérison des plaies. La cicatrisation des plaies peut également être perturbé par des facteurs systémiques que l'obésité, l'alcoolisme, le tabagisme, les médicaments, la nutrition et les maladies telles que le diabète. 2
Le processus de la cicatrisation peut être divisé en trois phases: (i) la phase inflammatoire, (ii) la prolifération et de la (iii) la phase de remodelage. Après une blessure de la peau, une cascade complexe de signal commence, conduisant à la fermeture de la plaie. 3Après une blessure, la plaie saigne et un caillot de sang se forme. Fibroblastes se déplacent dans le caillot de sang et le remplacer par un nouveau tissu qui est ensuite remodelé au fil des ans.
La compréhension actuelle de la réparation cutanée processus biologiques sous-jacent est limitée. Petits modèles animaux et de porcs ont été utilisées pour étudier la cicatrisation des plaies. Cependant, ces résultats ne peuvent être directement transmises à l'homme en raison des différences spécifiques à l'espèce. En plus de ces modèles in vivo, certains aspects de la cicatrisation des plaies peuvent être étudiés en simulant une situation de la plaie par l'intermédiaire de rayer in vitro des cultures monocouches à base sur des lignées cellulaires immortalisées ou des cellules primaires. 4 Ces modèles de grattage sont très normalisées, mais ne reflètent pas suffisamment la la physiologie complexe in vivo. 5 Outre les modèles en deux dimensions, les équivalents en trois dimensions peau humaine ont été développés pour la recherche dermatologique. La partie cutanée de ces modèles sont geexonéré en utilisant divers échafaudages comprenant derme décellularisées, 6 hydrogels de collagène, 7,8 glycosaminoglycanes 9 ou de matériaux synthétiques. 10 L'utilisation de ces équivalents de peau, le rôle des interactions épithélium-mésenchyme 11, la ré-épithélialisation, la diaphonie cellulaire entre les fibroblastes et les kératinocytes et la influence de différents facteurs de croissance peut être étudiée. En outre, ces modèles sont utiles pour acquérir de nouvelles connaissances sur la façon dont les fibroblastes migrent dans la zone blessés et comment les facteurs chimiotactique influencent la régénération des tissus. 12
Non seulement la génération du modèle de cicatrisation de la plaie elle-même est difficile, mais également pour établir une plaie hautement standardisée en un modèle est problématique. Techniques communes visant à créer des blessures sont des tests à gratter, 13, 14 brûlures bande abrasion, 15 blessure thermique, 16 ampoules d'aspiration, de l'azote liquide 17, 18, 19 lasers 18 mailleurs 6 et poinçons de biopsie. 20 La plupart de ces méthodes ont les mêmes pièges. Blessures mises en œuvre manuellement sont difficiles à normaliser et à reproduire entre plusieurs tests. Taille, forme et la profondeur de la plaie varient entre les études et donc nuisent à la qualité des données de recherche. L'utilisation de laser pour blessure défini de la peau peut être relativement facile à normaliser mais conduit à une situation imitant des brûlures. La chaleur appliquée par laser peut provoquer la dénaturation des protéines, l'agrégation des plaquettes ou des navires constriction, ce qui peut conduire à des tissus nécrosés.
Dans une autre approche, nous avons développé un dispositif automatisé de blessure (AWD), ce qui nous permet de générer plaies cutanées définis et précis dans des conditions stériles. Blessant paramètres, comme la profondeur et la vitesse de pénétration ainsi que les révolutions de la tête de forage peuvent être réglementés. Dans cette étude, nous avons combiné l'AWD avec la pleine épaisseur équivalents développés en interne de la peau (ftSE) qui sont comparables à un protocole publié par Gangatirkar et al. 8 La couche dermique de l'équivalent de peau est constitué de fibroblastes dermiques humains (HDF), qui sont noyés dans un collagène I hydrogel. Sur la couche dermique, kératinocytes épidermiques humains (HEK) sont ensemencées. Dans les deux semaines à l'interface air-liquide du hek accumuler un épiderme composé de plusieurs couches de cellules vitales et un stratum corneum. Outre la génération de ce modèle, cette étude montre l'utilisation de la traction intégrale pour créer blessures bien précises à FTSE.
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Protocol
NOTE: Le protocole est conçu pour la production de 24 équivalents de pleine épaisseur de la peau. Fibroblastes dermiques et les kératinocytes épidermiques humains ont été isolés à partir de biopsies de la peau selon un protocole précédemment publié. 21,22 consentement éclairé a été obtenu au préalable et l'étude a été approuvé par le comité d'éthique institutionnels sur la recherche humaine de Julius-Maximilians-Université de Würzburg (voter 182 / 10).
1. Production de composants cutanée
- Dissoudre le collagène avec de l'acide acétique à 0,1% à une concentration finale de 6 mg / ml. Pour la solution de neutralisation du gel, mélanger 232,5 ml 2x DMEM, 7,5 ml de sérum de veau foetal, 7,5 ml de 3 M HEPES, 2,5 ml de sulfate de chondroïtine (5 mg / ml). Conserver la solution de neutralisation de gel et de solution de collagène sur la glace. Calculer 500 pi de gel par équivalent insert / peau.
NOTE: Comme la solution de gel de neutralisation sera mélangé avec deux parties d'une solution de collagène prépare double du montant de collagène. - Placez 24 insertions dans une plaque à 24 puits.
- Reprendre fibroblastes dermiques humains (HDF) dans 10 ml de DMEM, centrifugeuse pendant 5 min à 270 xg et compter les cellules. Extraire la quantité nécessaire de HDF (5 x 10 4 cellules par 500 pi gel de collagène) et centrifuger les cellules pendant 5 min à 270 x g.
- Eliminer le surnageant et remettre en suspension avec précaution dans le HDF 4 ml refroidis solution de neutralisation du gel sans produire de bulles d'air. De cette étape assurez-vous de travailler aussi vite que possible pour éviter la solidification prématurée des gels de collagène.
- Remettre en suspension de la solution avec 8 ml d'une solution de collagène.
- Prenez le collagène cellules-mélange avec un plusieurs étapes-pipette et remplir rapidement 500 pi de mélange dans chaque insert. Incuber les gels pendant 20 minutes dans un incubateur (37 ° C, 5% CO 2) à gélifier les gels.
- Immerger les gels dans 2 ml de milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) + 10% de sérum de veau foetal (FCS) par puitset incuber pendant 24 heures dans un incubateur (37 ° C, 5% CO 2).
2. Ajout de kératinocytes épidermiques humains (HEK)
- Retirez milieu après 24 h. Dissoudre protéine humaine de la fibronectine avec de l'eau ultra-pure à une concentration finale de 50 pg / ml. Couvrir chaque derme équivalent avec 25 pi de solution de fibronectine. Incuber les gels pendant 30 minutes dans un incubateur (37 ° C, 5% CO 2).
- Dans le même temps, remettre en suspension le hek dans 10 ml KGM-2 et régler la concentration de cellules de 1 x 10 6 cellules / ml avec KGM-2 prêt + 5% de FCS. Seed 1 x 10 5 Hek sur chaque gel. Incuber les gels pendant 45 minutes dans l'incubateur (37 ° C, 5% CO 2) pour permettre aux cellules d'adhérer.
- Immerger les gels avec KGM-2 prêt + 5% de FCS et leur culture dans l'incubateur (37 ° C, 5% CO 2).
3. Culture de équivalents plein épaisseur de la peau (FTSE)
- FTSE de Culture pour 6-7 joursen diminuant FCS-concentration (5%, 2% et 0% de FCS). Changer le support tous les 2-3 jours de la prochaine concentration inférieure FCS. Pour cela, supprimer complètement le moyen et ajouter 1,6 ml de milieu frais.
- Au jour 7, supprimer complètement moyenne.
REMARQUE: Ne touchez pas la surface FTSE avec le bout de la pipette en le faisant. - Lieu tous les insérer dans une puits d'une plaque à 6 puits avec des pinces stériles. Ajouter 1,5 ml de milieu de transport aérien par puits, veiller à ne pas mouiller la surface FTSE. Changer le milieu tous les 2-3 jours pour 14 jours supplémentaires.
NOTE: Le niveau du milieu de remplissage est au ménisque du FTSE.
4. Analyse histologique
- Fixation et paraffine-encastrement du FTSE
- Retirez milieu de culture, transférer inserts en plaques à 24 puits frais et fixer les tissus en ajoutant 1,6 ml de paraformaldéhyde 4% dans chaque puits et incuber les tissus pendant 2 heures à la température ambiante. Attention! Paraformaldehyde est toxique, manipuler sous une hotte. TransfertL'indice FTSE une cassette de tissu-enrobage. Retirer fixatif restant par lavage avec de l'eau et de déshydrater le tissu en utilisant des concentrations d'éthanol ascendant.
- Diviser l'équivalent de peau par une coupe verticale au milieu. Placer les deux pièces dans un moule de base métallique rempli de paraffine surfaces de coupe vers le bas. Ajouter la cassette de tissus au-dessus du moule en tant que support.
- Couper 3-5 um tranches et les faire flotter sur un bain d'eau à 40 ° pour les opprimer, les lamelles sur des lames de microscope appropriés. Tranches sécher complètement.
- Hématoxyline & éosine (H & E) et immunohistochimique (IHC) coloration
- Placer les lames dans le rack et incuber pendant 1 heure à 60 ° C. Assurez-vous que la paraffine est fondue. Stain réhydraté tranches avec H & E comme un aperçu coloration standardisée.
- Par coloration H & E préparer 4x cuvettes de coloration de verre avec du xylol, 3x avec de l'éthanol à 96%, 2 fois avec de l'éthanol 70%, 1 x avec de l'éthanol à 50%, 4x eau désionisée, 1x hématoxyline, 1x HCl-eTHANOL (13,7 ml de HCl 1 M ad 200 ml 50% d'éthanol), l'eau du robinet 1x, 1x éosine (éosine 1 g dans 100 ml d'eau désionisée) et 2x 2-propanol.
- Placer les lames 10 min dans du xylol I et 10 min dans du xylol II Déparaffiner et réhydrater diapositives. Tremper les lames 3x dans l'éthanol 96% I, 3x dans l'éthanol 96% II, 3x dans l'éthanol 70% et 3x dans l'éthanol 50%. Tournez lames à l'eau déminéralisée. Pour différencier hématoxyline colorant, 2x plongeon dans HCl-éthanol. Rincer à l'eau déminéralisée. Pour bleuissement, placer les lames 5 min dans l'eau du robinet. Pour éosine, le lieu glisse 1 min dans l'éosine et laver ensuite dans de l'eau déminéralisée. Pour la déshydratation, plaques d'immersion 2x dans l'éthanol 70%, 2x dans l'éthanol 96% et les placer pendant 5 min dans 2-propanol I, pendant 5 min dans 2-propanol II, 5 min dans du xylol I et 5 min dans du xylol II. Après coloration H & E, des noyaux cellulaires sont colorés en bleu, le cytoplasme et la matrice extracellulaire sont colorées en rouge.
- Pour la récupération de l'antigène, enlever la paraffine avec du xylène et de se réhydrater tranches pour la coloration. Placer les tranchesen cuiseur à vapeur et faire cuire les tranches déparaffinées et réhydratées pendant 20 min dans préchauffées tampon citrate 10 mM (pH 6).
- Placer les lames dans du tampon de lavage (tampon PBS + 0,5% Polysorbat 20) et les tranches de cercle avec un marqueur liquide répulsif de glissement ou de diamant stylet.
- Placer les lames dans une chambre humide. Bloquer la peroxydase endogène, par addition de 100 ul de solution à 3% de peroxyde d'hydrogène sur chaque tranche. Attention! Très dangereux en cas de contact avec la peau et les yeux. Manipuler avec équipement de protection individuelle. Laver les lames dans du tampon de lavage.
- Appliquer un anticorps primaire et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Laver les lames trois fois avec du tampon de lavage. A partir de là, les échantillons doivent être conservés dans l'obscurité.
- Utiliser le système de détection de la biotine-streptavidine pour la détection de la liaison antigène-anticorps spécifique.
- Noyaux Counterstain à l'hématoxyline pendant 1 min. Déshydrater et monter diapositives.
- échantillons de l'image en utilisant un microscope inversé.
- Préparer le AWD en désinfectant la zone de travail avec 70% d'éthanol et la lumière ultraviolette. Assurez-vous que la tête de forage de la taille désirée (par exemple, 1 mm) est fixé.
- Placez équivalents de peau dans les régions désignées de la plaque de support de l'échantillon autoclave en utilisant des pinces stériles. Placer la plaque de support d'échantillon dans la douille au-dessous de la tête de forage.
- Utilisez le logiciel de commande pour régler les paramètres blessant comme suit: vitesse de rotation: 15000 tours par minute; pénétration: 1,5 mm; propulsion: 100 Hz. Ces paramètres doivent être définis pour chaque type d'échantillon individuellement. Transfert blessant paramètres au stade AWD.
- Procédure de départ blessant. Retirer échantillon plaque de support de la prise. Transfert blessé FTSE retour dans des inserts utilisés pour la culture à l'aide de pinces stériles.
- Procéder à la culture de FTSE blessés dans l'incubateur (37 ° C, 5% de CO 2) pour l'étude de la régénération. Alvariante, utiliser les modèles pour l'analyse histologique à tout moment.
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Representative Results
La isolée HDF et Hek diffèrent à la fois dans la morphologie et de l'expression de marqueurs typiques. HDF a montré la morphologie typique broche en forme, alors que la morphologie de Hek peut être décrit par une morphologie pavée. Les cellules ont été caractérisées par une coloration immunohistochimique (Figure 1) avant de les utiliser pour FTSE. Le HDF sont positives pour la vimentine (Figure 1A), un marqueur de fibroblastes. HEK primaire exprimer très précoce de différenciation protéine cytokératine-14 (figure 1B), mais presque pas de retard de différenciation des kératinocytes protéine cytokératine-10 (Figure 1C).
Après culture primaire, nous détachons les cellules des flacons de culture de cellules et les ont utilisés pour la génération de l'indice FTSE. L'indice FTSE ont été cultivées pendant 7 jours sous submers conditions moyennes (figure 2A), suivie par une culture de 14 jours à l'interface air-liquide (figure 2B). Pendant ce processus, le ftSE contrat de manière significative. Dans les 21 jours de la Hek se multiplient (figure 2C-E). En changeant le niveau moyen, de telle sorte que la surface des modèles est exposé à l'air et par augmentation de la concentration de calcium, l'hek sont stimulées à se différencier en un épiderme multi-cellulaires qui se compose de plusieurs couches de cellules vitales de kératinocytes dans différents états de différenciation et un stratum corneum (Figure 2E).
En comparant la coloration hématoxyline & éosine de FTSE (figure 2E) avec la peau humaine native (figure 2F), il devient évident que l'architecture imite FTSE histologique de la peau. Ceci peut être encore démontrée par des colorations immunohistochimiques (figure 3). Le HDF dans le collagène I hydrogel peut être coloré avec des anticorps primaires contre la vimentine (Figure 3A, E). Les kératinocytes forment une couche épidermique composé de la cytokératine-14 positivcellules e (figure 3B, F) et la fin du marqueur de différenciation cytokératine-10 est exprimé dans les couches supra-basale (figure 3C, G). En outre, la couche cornée est positif pour la filaggrine (figure 3D, H).
Après la période de culture de 21 jours, l'AWD a été utilisé pour générer des plaies cutanées de l'indice FTSE. Comme le montre la figure 4A, la traction intégrale est conçu comme un système en forme de boîte fermée afin d'assurer des conditions stériles. Sur la figure 4B, une vue schématique du procédé de la blessure est démontrée. L'indice FTSE sont fixés sur une plaque de support de l'échantillon. L'ensemble du processus de blessures, y compris le réglage des paramètres tels que la vitesse et les révolutions de la tête de forage (figure 4D) abaissant ainsi que la profondeur de pénétration est contrôlé par ordinateur assistés. La procédure peut être blessant surveillée optiquement via une fenêtre avant ou par une caméra haute résolution qui enregistre toutes les étapes au cours de la blessure procédure. Taille, forme et la profondeur de la blessure de la plaie peuvent être ajustés individuellement (figure 4C).
Figure 1. Caractérisation des cellules utilisées pour la construction des pleins équivalents de peau d'épaisseur. De coloration immunohistochimique de fibroblastes primaires dermiques humains pour la vimentine (A) et des kératinocytes épidermiques pour la différenciation précoce kératine filament cytokératine-14 (B) et la fin de la différenciation filament cytokératine -10 (C). Coloration positive est représenté par la couleur brune. Barres d'échelle indiquent 100 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 2. Évolution de conditions de culture et maturation de pleine épaisseur équivalents de peau. Images macroscopiques de la peau pleine épaisseur équivalents cultivées pendant 7 jours sous submers conditions (A) et 14 jours à l'interface air-liquide (B). Comparaison des hématoxyline & éosine de pleine épaisseur équivalents de peau à différents stades de développement: Après 7 jours (C), 14 jours (7 jours à l'interface air-liquide, D) et 21 jours (14 jours à l'interface air-liquide, E). Hématoxyline & éosine de la peau humaine native (F). Barres d'échelle indiquent 100 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3. Caractérisation des pleins équivalents de peau d'épaisseur de comparaison de la coloration immunohistochimique de pleine épaisseur équivalents de peau. (A - D) et de la peau humaine native (E - H) pour la vimentine (A, E), la cytokératine-14 (B, F), la cytokératine-10 (C, G) et la filaggrine (D, H). Barres d'échelle indiquent 100 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. automatique Blessant Dispositif pour blessure contrôlée sur les équivalents de peau totale. Le dispositif de blessure automatisé (AWD) fournit condition stérilens au cours de la procédure de blessures contrôlée (A). Un ordinateur connecté (CPU) contrôle la traction intégrale. Les équivalents de peau de pleine épaisseur (ftSEs) sont placés sur la plaque de support d'échantillon (SCP), les écarts dans l'échantillon morphologie sont égalisées par une barrière lumineuse (LB), ce qui déclenche la procédure de la blessure. La forme de la plaie dépend de la tête de forage utilisée (DH). Le diamètre varie de 1 mm (C, image du haut) à 2 mm (C, image inférieure). La procédure de la blessure est surveillée et peut être enregistré pour la documentation et de la gestion de la qualité (D). Hématoxyline & éosine colorés coupe transversale d'un équivalent plein de la peau d'épaisseur blessé avec le dispositif de blessure automatisé utilisant une tête de forage de 1 mm (E). Toutes les barres d'échelle indiquent 2 mm. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Dans les cellules in vitro sont généralement étendu dans des cultures cellulaires bidimensionnelles, dans lequel les cellules adhèrent aux surfaces plastiques. Cependant, ces conditions de culture ne reflètent pas les conditions physiologiques en trois dimensions dans laquelle les cellules se développent in vivo. Dans des conditions tridimensionnelles, les cellules peuvent former des attachements cellule-cellule et cellule-matrice naturelles et de migrer dans les trois dimensions. Surtout dans la plaie cutanée guérison de la ressemblance de la situation in vivo est crucial pour générer des données significatives, comme la migration cellulaire et la production de la matrice sont des éléments clés de la cicatrisation des plaies.
Pour imiter ces conditions, nous avons développé FTSE qui sont composées de cellules primaires humaines et refléter à la fois la voie cutanée et la couche épidermique de la peau. Durant les deux semaines de culture à l'interface air-liquide, la HEK former un épiderme constitué de plusieurs couches de kératinocytes dans différentes phases de différenciation et un stratum corneum. Fan outre, la couche dermique est composée de HDF, qui sont noyés dans un collagène I hydrogel. Pendant le temps de culture, le HDF remodeler le composant dermique, qui se traduit par une contraction importante des modèles (Figure 2B).
Pour préparer blessures reproductibles et standardisées, nous avons développé un AWD. La machine commandée par ordinateur peut définir blessures cutanées bien précises (Figure 4). Selon la recherche, la profondeur, la forme et la taille prévue de la blessure peut être adapté. Toutefois, en raison des spécifications techniques de la traction intégrale et la morphologie de l'indice FTSE, il est recommandé de définir une pénétration minimale de 100 um reproductibilité. La traction intégrale fonctionne dans des conditions stériles dans un système de boîte fermée et tous les composants peut être stérilisé par autoclave, solutions de désinfection ou de la lumière ultraviolette. En vue de la procédure de blesser les échantillons doivent être transférés à une plaque de support d'échantillon. Cette plaque facilite uneposition exacte des échantillons. En outre, l'adhésion entre l'échantillon et la plaque de support de l'échantillon est suffisante pour maintenir les échantillons en place pendant la procédure de la blessure. La procédure de la blessure elle-même peut être contrôlée optiquement via une fenêtre avant ou par une caméra haute résolution qui enregistre toutes les étapes d'une position de close-up. Contrairement à d'autres systèmes qui utilisent des lasers pour creuser tissus pour générer une blessure, l'AWD utilise un forage rotatif. Ainsi, aucune chaleur ne est appliquée pendant la procédure, ce qui est un avantage indirect vitale pour enquêter blessures mécaniques. De plus, la forme spécifique de la tête de forage assure un enlèvement de matière provenant du canal de blessure. Utiliser les paramètres d'blessantes déterminées empiriquement mentionnés ci-dessus la procédure blessant peut être ajusté pour répondre propriétés physiologiques spécifiques soit du FTSE ou des échantillons natifs de la peau. De cette façon, aucun des effets secondaires indésirables tels que détachement involontaire de couches épidermiques peut être minimisée et blessures reproductible effectuée avec un taux de réussitede 90%.
Cette étude démontre que le FTSE développés imitent en partie la situation in vivo de la peau avec précision et peuvent donc être utilisées comme un modèle pour les études de la cicatrisation. Bien que des aspects importants du processus de guérison de la plaie, tels que l'effet du système vasculaire, le caillot de sang et le système immunitaire font défaut dans le modèle, le épiderme-mésenchymateuse et cellule-matrice interaction est récapitulée dans un environnement hautement standardisée tridimensionnel. En outre, nous avons pu montrer que l'AWD génère blessures standardisés dans les modèles de la peau. En combinaison, deux techniques peuvent être utilisées pour étudier la cicatrisation et l'effet des substances et des médicaments qui favorisent le processus de guérison. Afin d'imiter de plus près la situation in vivo, le FTSE peut être prolongée par d'autres cellules comme les mélanocytes, des cellules tumorales de la peau ou des cellules endothéliales microvasculaires.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin EDTA (1:250) 0.5% in DPBS | PAA | L11-003 | 0.05% |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Collagen (6 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Produced in house | ||
| Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml) | Life Technologies | 33016-015 | |
| Inserts | Nunc | 140627 | |
| 6 well plate | Nunc | 140685 | |
| 24 well plate | Nunc | 142485 | |
| Microscope slides | R. Langenbrinck | 03-0070 | |
| Fibroblasts culturing (500 ml): | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-092 | 89% (445 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 10% (50 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Keratinozyten culture medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | 89% (445 ml) |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Gel neutralization solution (250 ml): | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine | PAA | G0001,3010 | 93% (232.5 ml) |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-1g | 1% (2.5 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 3% (7.5 ml) |
| HEPES | Sigma | H3375-1kg | 3% (7.5 ml) |
| Skin model submers medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Fetal calf serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 5%-2% (25 ml-10 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Skin model air-liquid interface medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack | Promocell | C-39011 | adding only supplements: insulin, hydrocortisone, epinephrine, transferrin, CaCl2 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| CaCl2 (300 mM) | Sigma | C7902-500g | 0.62% (3.1 ml) |
| Histology: | |||
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| CK14 antibody | Sigma | HPA023040-100µl | |
| CK10 antibody | Dako | M7002 | |
| Filaggrin antibody | Abcam | ab81468 | |
| H&E staining: | |||
| Mayer´s Haemalaun | AppliChem | A0884,2500 | |
| Xylol | Sigma Aldrich | 296325-4X2L | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-4X2.5L | |
| HCl | Sigma Aldrich | H1758-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | E4009-5G | |
| 2-Propanolol | Sigma Aldrich | I9516-500ML | |
| Mounting Medium | Sigma Aldrich | M1289-10ML | |
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