Introduction
त्वचा शरीर का सबसे बड़ा अंग है। यह बाहरी वातावरण और आंतरिक अंगों के बीच एक बाधा पैदा करता है। इसके अलावा, त्वचा द्रव नुकसान, पर्यावरणीय प्रभावों, चोटों और संक्रमण से शरीर की रक्षा करता है और शरीर का तापमान एक विनियमित करने में मदद करता है। कारण इसकी उजागर स्थान के लिए, त्वचा अक्सर, यांत्रिक थर्मल या रासायनिक आघात से प्रभावित है। त्वचा स्वयं की मरम्मत का आम तौर पर सक्षम है हालांकि, इस तरह के संक्रमण, ऑक्सीजन, और शिरापरक प्रचुरता के रूप में कई स्थानीय कारकों बिगड़ा घाव भरने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। घाव भरने में भी मोटापा, शराब, धूम्रपान, दवा, पोषण और मधुमेह जैसे रोगों के रूप में प्रणालीगत कारकों से दखल किया जा सकता है। 2
(मैं) भड़काऊ चरण (ii) प्रफलन और (iii) remodeling के चरण: घाव भरने की प्रक्रिया तीन चरणों में विभाजित किया जा सकता है। त्वचा को चोट करने पर, एक जटिल संकेत-झरना घाव को बंद करने के लिए अग्रणी शुरू होता है। 3चोट के बाद, घाव से खून बह रहा है और एक खून का थक्का का गठन किया है। Fibroblasts खून का थक्का में कदम और बाद में पिछले कुछ वर्षों में remodeled है जो नए ऊतक के साथ बदलें।
जैविक प्रक्रियाओं अंतर्निहित त्वचीय मरम्मत की वर्तमान समझ सीमित है। छोटे जानवर और सुअर मॉडल घाव भरने का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इन परिणामों सीधे प्रजाति विशिष्ट मतभेद के कारण मनुष्य के लिए स्थानांतरित नहीं किया जा सकता है। इन vivo में मॉडल के अलावा, घाव भरने के कुछ पहलुओं 4 ये scratching मॉडल अत्यधिक मानकीकृत कर रहे हैं। अमर सेल लाइनों या प्राथमिक कोशिकाओं के आधार पर इन विट्रो monolayer संस्कृतियों के scratching के माध्यम से एक घाव स्थिति का अनुकरण द्वारा अध्ययन किया जा सकता है, लेकिन पर्याप्त रूप से प्रतिबिंबित नहीं करते परिसर में विवो फिजियोलॉजी। 5 दो आयामी मॉडल के अलावा, तीन आयामी मानव त्वचा समकक्ष dermatological अनुसंधान के लिए विकसित किया गया है। इन मॉडलों के चमड़े का हिस्सा जीई हैंnerated decellularized डर्मिस, 6 कोलेजन हाइड्रोजेल, 7,8 glycosaminoglycans 9 या सिंथेटिक सामग्री सहित विभिन्न scaffolds के प्रयोग से। 10 इन त्वचा समकक्ष रोजगार, उपकला-mesenchymal बातचीत 11 की भूमिका, पुनः epithelialization, fibroblasts और केरेटिनकोशिकाओं और बीच सेलुलर crosstalk विभिन्न विकास कारकों के प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है। इसके अलावा, इन मॉडलों fibroblasts के घायल क्षेत्र में विस्थापित और कैसे chemotactic कारकों ऊतक पुनर्जनन को कैसे प्रभावित करती बारे में नए ज्ञान हासिल करने के लिए उपयोगी होते हैं। 12
घाव भरने मॉडल ही की न केवल पीढ़ी चुनौती दे रहा है, लेकिन यह भी एक मॉडल में एक अत्यधिक मानकीकृत घाव समस्याग्रस्त है स्थापित करने के लिए। आम तकनीकों घाव खरोंच परीक्षण, 13 जलता है, 14 टेप घर्षण, 15 थर्मल चोट, 16 सक्शन छाले, 17 तरल नाइट्रोजन, 18 लेजर, 19 कर रहे हैं बनाने के लिए 18 meshers 6 और बायोप्सी घूंसे। इन तरीकों में से 20 अधिकांश एक ही नुकसान है। मैन्युअल रूप से लागू की चोट लगने के मानकीकरण के लिए और कई परीक्षणों के बीच पुन: पेश करने के लिए मुश्किल हैं। आकार, आकृति और घाव की गहराई से अध्ययन के बीच भिन्न है और इस तरह के अनुसंधान डेटा की गुणवत्ता ख़राब। परिभाषित त्वचा लोग घायल हो गए के लिए लेजर का उपयोग अपेक्षाकृत आसानी से मानकीकृत लेकिन जला घाव नकल उतार एक ऐसी स्थिति की ओर जाता है किया जा सकता है। लेजर द्वारा लागू गर्मी परिगलित ऊतक को जन्म दे सकता है, जो प्रोटीन विकृतीकरण, प्लेटलेट्स एकत्रीकरण या वाहिकाओं कसना, पैदा कर सकता है।
एक वैकल्पिक दृष्टिकोण में, हम हमारे बाँझ शर्तों के तहत परिभाषित और सटीक त्वचीय घाव उत्पन्न करने के लिए अनुमति देता है जो एक स्वचालित लोग घायल हो गए डिवाइस (AWD), विकसित की है। गहराई और गति पैठ के रूप में अच्छी तरह से ड्रिल सिर की क्रांतियों की तरह लोग घायल हो गए मापदंडों, विनियमित किया जा सकता है। इस अध्ययन में, हम घर में विकसित पूर्ण मोटाई त्वचा समकक्ष के साथ AWD संयुक्त (एफटीGangatirkar एट अल द्वारा प्रकाशित एक प्रोटोकॉल के लिए तुलना कर रहे हैं कि एसई)। 8 त्वचा बराबर की त्वचीय परत मैं हाइड्रोजेल एक कोलेजन में एम्बेडेड रहे हैं जो मानव त्वचीय fibroblasts (HDF), से बना है। त्वचीय परत पर, मानव एपिडर्मल केरेटिनकोशिकाओं (HEK) वरीयता प्राप्त कर रहे हैं। हवा तरल इंटरफेस में दो सप्ताह के भीतर HEK कई महत्वपूर्ण सेल परतों और एक परत corneum से बना एक एपिडर्मिस का निर्माण। इस मॉडल की पीढ़ी इसके अलावा, इस अध्ययन FTSE में परिभाषित और सटीक घाव बनाने के लिए AWD के उपयोग से पता चलता है।
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Protocol
नोट: प्रोटोकॉल 24 पूर्ण मोटाई त्वचा समकक्ष के उत्पादन के लिए बनाया गया है। त्वचीय fibroblasts और एपिडर्मल केरेटिनकोशिकाओं मानव 21,22 अवगत सहमति पहले से प्राप्त हुई थी। एक पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुसार त्वचा बायोप्सी से अलग थे और अध्ययन जूलियस-Maximilians-विश्वविद्यालय वुर्जबर्ग के मानव अनुसंधान पर संस्थागत नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (182 वोट / 10)।
त्वचीय घटक की 1. उत्पादन
- 6 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 0.1% एसिटिक एसिड के साथ कोलेजन भंग। जेल निराकरण समाधान के लिए, 232.5 मिलीलीटर 2x DMEM, 7.5 मिलीलीटर भ्रूण बछड़ा सीरम, 7.5 मिलीलीटर 3 एम HEPES, 2.5 मिलीलीटर chondroitin सल्फेट (5 मिलीग्राम / एमएल) मिश्रण। बर्फ पर जेल निराकरण समाधान और कोलेजन समाधान रखें। डालने / त्वचा समकक्ष प्रति जेल के 500 μl की गणना।
नोट: जेल निराकरण समाधान कोलेजन समाधान prepa के दो भागों के साथ मिश्रित किया जाएगाकोलेजन की राशि दोगुना कर रहे हैं। - एक 24 अच्छी तरह से थाली में 24 आवेषण रखें।
- 10 मिलीलीटर DMEM, 270 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र में मानव त्वचीय fibroblasts (HDF) Resuspend और कोशिकाओं की गिनती। जी एक्स 270 पर 5 मिनट के लिए आवश्यक HDF की राशि (500 μl कोलेजन जेल प्रति 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं) और अपकेंद्रित्र कोशिकाओं निकालें।
- 4 मिलीलीटर हवा के बुलबुले के उत्पादन के बिना जेल निराकरण समाधान ठंडा में HDF resuspend ध्यान से सतह पर तैरनेवाला निकालें और। इस कदम से कोलेजन जैल के समय से पहले solidifying से बचने के लिए जितनी जल्दी हो सके काम करने के लिए सुनिश्चित करें।
- कोलेजन समाधान के 8 मिलीलीटर के साथ समाधान Resuspend।
- एक multistep-विंदुक के साथ कोलेजन सेल मिश्रण ले लो और प्रत्येक डालने में जल्दी मिश्रण के 500 μl भरें। एक मशीन में 20 मिनट के लिए जैल सेते (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) जैल जमाना करने के लिए।
- अच्छी तरह से प्रति 2 मिलीलीटर Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) + 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) में जैल डूबऔर एक मशीन में 24 घंटा (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) के लिए यह सेते हैं।
मानव epidermal केरेटिनकोशिकाएं 2. अलावा (HEK)
- 24 घंटे के बाद मध्यम निकालें। 50 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए ultrapure पानी के साथ फ़ाइब्रोनेक्टिन मानव प्रोटीन भंग। Fibronectin समाधान के 25 μl के साथ बराबर प्रत्येक चमड़े का कवर। एक मशीन में 30 मिनट के लिए जैल सेते (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2)।
- इस बीच, 10 एमएल केजीएम -2 में HEK resuspend और केजीएम -2 5 तैयार% एफसीएस के साथ 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के लिए सेल एकाग्रता निर्धारित किया है। प्रत्येक जेल पर बीज 1 एक्स 10 5 HEK। इनक्यूबेटर में 45 मिनट (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) कोशिकाओं पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए के लिए जैल सेते हैं।
- इनक्यूबेटर में केजीएम-2 के लिए तैयार 5% एफसीएस और संस्कृति उन्हें (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) के साथ जैल डुबोना।
पूर्ण मोटाई त्वचा समकक्ष 3. संस्कृति (FTSE)
- 6-7 दिनों के लिए संस्कृति FTSEएफसीएस-एकाग्रता (5%, 2%, और 0% एफसीएस) उतरते में। अगले कम एफसीएस एकाग्रता के साथ हर 2-3 दिनों मध्यम बदलें। इस के लिए, पूरी तरह से मध्यम हटाने और ताजा माध्यम से 1.6 मिलीलीटर जोड़ने।
- दिन 7 पर, पूरी तरह से मध्यम निकालें।
नोट: जबकि ऐसा करने पिपेट की नोक के साथ FTSE सतह को छुआ तक नहीं। - हर बाँझ संदंश के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में डालने रखें। FTSE सतह गीला करने के लिए नहीं, यह सुनिश्चित करें अच्छी तरह से प्रति 1.5 मिलीलीटर एयरलिफ्ट मध्यम जोड़ें। अतिरिक्त 14 दिनों के लिए हर 2-3 दिनों मध्यम बदलें।
नोट: मध्यम के भरने के स्तर FTSE का meniscus के लिए निर्भर है।
4. histological विश्लेषण
- फिक्सिंग और FTSE की आयल एम्बेडिंग
- आरटी पर 2 घंटे के लिए ऊतकों ताजा 24 अच्छी तरह से प्लेट में सम्मिलित करता है हस्तांतरण और अच्छी तरह से 1.6 मिलीलीटर प्रत्येक के लिए% paraformaldehyde के चार में से जोड़कर ऊतकों को ठीक करने और सेते हैं, संस्कृति के माध्यम से निकालें। सावधानी! Paraformaldehyd विषैला होता है, धूआं हुड के तहत हेरफेर। स्थानांतरणएक ऊतक एम्बेडिंग कैसेट को FTSE। पानी से धोने से शेष लगानेवाला निकालें और आरोही इथेनॉल सांद्रता का उपयोग ऊतक निर्जलीकरण।
- बीच में एक खड़ी कटौती से त्वचा बराबर विभाजित करते हैं। नीचे की तरफ कटौती सतहों के साथ एक तेल से भरे धातु आधार मोल्ड में दो टुकड़े रखें। एक समर्थन के रूप में ढालना के शीर्ष पर ऊतक कैसेट जोड़ें।
- उपयुक्त खुर्दबीन स्लाइड पर स्लाइड माउंट, 3-5 माइक्रोन स्लाइस काटें और straitening के लिए एक 40 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान पर उन्हें तैरने लगते हैं। अच्छी तरह से सूखे स्लाइस।
- Hematoxylin और eosin (एच एंड ई) और immunohistochemical (आईएचसी) धुंधला
- जगह रैक में स्लाइड और 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। आयल पिघल रहा है कि सुनिश्चित करें। दाग एक मानकीकृत सिंहावलोकन धुंधला के रूप में एच एंड ई के साथ स्लाइस rehydrated।
- एच एंड ई धुंधला के लिए इथेनॉल 50%, 4x विआयनीकृत पानी, 1x hematoxylin, 1x एचसीएल-ए के साथ 1x, इथेनॉल के साथ 2x, इथेनॉल के साथ 3x, xylol साथ 70% 96% 4x कांच धुंधला cuvettes को तैयारthanol (13.7 मिलीलीटर 1 एम एचसीएल विज्ञापन 200 मिलीलीटर 50% इथेनॉल), 1x टैब पानी, 1x eosin और 2x 2-propanol (100 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी में 1 ग्राम eosin)।
- प्लेस xylol मैं में 10 मिनट और deparaffinize और स्लाइड rehydrate करने xylol द्वितीय में 10 मिनट स्लाइड। डुबकी इथेनॉल 50% इथेनॉल में 70% और 3x में 3x, इथेनॉल में इथेनॉल 96% मैं, 3x में 96% द्वितीय 3x स्लाइड। विआयनीकृत पानी में स्लाइड्स घुमाएँ। Hematoxylin डाई, एचसीएल-इथेनॉल में डुबकी 2x अंतर करने के लिए। विआयनीकृत पानी में कुल्ला। नील के लिए, जगह टैब पानी में 5 मिनट के स्लाइड। Eosin धुंधला के लिए, जगह eosin में 1 मिनट स्लाइड और विआयनीकृत पानी में बाद में धो लें। निर्जलीकरण के लिए, डुबकी स्लाइड इथेनॉल 96% में इथेनॉल में 70%, 2x 2x और 2-propanol द्वितीय में 5 मिनट के लिए, 2-propanol मैं में 5 मिनट के लिए उन्हें जगह, xylol में 5 मिनट मैं और xylol द्वितीय में 5 मिनट। एच एंड ई धुंधला करने के बाद, सेल नाभिक लाल रंग में दाग रहे हैं, नीले, कोशिका द्रव्य और बाह्य मैट्रिक्स में दाग रहे हैं।
- प्रतिजन पुनः प्राप्ति के लिए, xylene साथ आयल को हटाने और धुंधला के लिए स्लाइस rehydrate। प्लेस स्लाइसभाप कुकर में पूर्व गर्म 10 मिमी में 20 मिनट साइट्रेट बफर (पीएच 6) के लिए deparaffinized और rehydrated स्लाइस खाना बनाना और।
- एक तरल से बचाने वाली क्रीम स्लाइड मार्कर पेन या हीरे की लेखनी से धोने बफर में जगह स्लाइड (पीबीएस बफर + 0.5% Polysorbat 20) और वृत्त स्लाइस।
- एक नमी कक्ष में स्लाइड रखें। प्रत्येक टुकड़ा पर 100 μl 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान जोड़कर, अंतर्जात peroxidase अवरुद्ध करें। सावधानी! त्वचा और आंख से संपर्क के मामले में बहुत खतरनाक। व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण के साथ संभाल। धो धोने बफर में स्लाइड।
- प्राथमिक एंटीबॉडी लागू करें और आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। धो धोने बफर के साथ तीन बार स्लाइड। यहाँ से, नमूने अंधेरे में रखा जाना चाहिए।
- बाध्यकारी विशिष्ट प्रतिजन एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए बायोटिन streptavidin पहचान प्रणाली का प्रयोग करें।
- एक मिनट के लिए Hematoxylin साथ नाभिक Counterstain। निर्जलीकरण और स्लाइड माउंट।
- एक उलटा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि नमूने हैं।
- 70% इथेनॉल और पराबैंगनी प्रकाश के साथ काम कर क्षेत्र disinfecting द्वारा AWD तैयार करें। इच्छित आकार की ड्रिलिंग सिर सुनिश्चित करें (उदाहरण के लिए, 1 मिमी) से जुड़ा हुआ है।
- बाँझ संदंश का उपयोग autoclaved नमूना वाहक थाली के नामित क्षेत्रों में त्वचा समकक्ष रखें। ड्रिलिंग सिर नीचे सॉकेट में नमूना वाहक थाली रखें।
- स्पिन वेग: इस प्रकार है: लोग घायल हो गए मापदंडों सेट करने के लिए नियंत्रण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें 15,000 आरपीएम; प्रवेश: 1.5 मिमी; प्रणोदन: 100 हर्ट्ज। इन मानकों को व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक नमूना प्रकार के लिए परिभाषित करने की आवश्यकता है। स्थानांतरण AWD करने के लिए पैरामीटर लोग घायल हो गए।
- प्रक्रिया घायल हो गए शुरू करो। सॉकेट से नमूना वाहक थाली निकालें। स्थानांतरण बाँझ संदंश का उपयोग संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया आवेषण में वापस FTSE घायल हो गए।
- उत्थान की जांच के लिए इनक्यूबेटर में घायल FTSE की संस्कृति (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) के साथ आगे बढ़ें। अलternatively, किसी भी समय ऊतकीय विश्लेषण के लिए मॉडल का उपयोग करें।
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Representative Results
पृथक HDF और HEK आकृति विज्ञान में और ठेठ मार्करों की अभिव्यक्ति में दोनों भिन्न होते हैं। HEK की आकृति विज्ञान एक cobblestone आकारिकी द्वारा वर्णित किया जा सकता है, जबकि HDF, ठेठ धुरी आकार आकृति विज्ञान दिखाया। कोशिकाओं FTSE के लिए उन्हें का उपयोग करने से पहले immunohistochemical धुंधला (चित्रा 1) द्वारा विशेषता थे। HDF vimentin (चित्रा 1 ए), fibroblasts के लिए एक मार्कर के लिए सकारात्मक रहे हैं। प्राथमिक HEK अत्यधिक जल्दी भेदभाव प्रोटीन cytokeratin-14 (चित्रा 1 बी), लेकिन लगभग कोई देर keratinocyte भेदभाव प्रोटीन cytokeratin-10 (चित्रा 1C) व्यक्त करते हैं।
प्राथमिक संस्कृति के बाद, हम सेल संस्कृति बोतल से कोशिकाओं को अलग और FTSE की पीढ़ी के लिए उन्हें इस्तेमाल किया। FTSE हवा तरल इंटरफेस (चित्रा 2B) में 14 दिनों के संस्कृति द्वारा पीछा submers के तहत 7 दिन मध्यम शर्तों (2A चित्रा) के लिए सुसंस्कृत थे। इस प्रक्रिया के दौरान, चकाफी त्से अनुबंध। 21 दिनों के भीतर HEK (चित्रा -2 ई) proliferating हैं। मॉडलों की सतह से हवा करने के लिए और बढ़ती कैल्शियम एकाग्रता से अवगत कराया है कि इस तरह के रास्ते में मध्यम स्तर से बदल रहा है, HEK अलग भेदभाव राज्यों में केरेटिनकोशिकाओं के कई महत्वपूर्ण सेल परतों से बना है कि एक बहु सेलुलर एपिडर्मिस में अंतर करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं और एक परत corneum (चित्रा 2 ई)।
देशी मानव त्वचा के साथ FTSE (चित्रा 2 ई) के Haematoxylin और eosin धुंधला मुकाबले (चित्रा 2 एफ) यह स्पष्ट हो जाता है त्वचा की FTSE mimics ऊतकीय वास्तुकला कि। यह आगे immunohistochemical stainings (चित्रा 3) के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है। कोलेजन मैं हाइड्रोजेल में HDF vimentin के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी (चित्रा 3 ए, ई) के साथ दाग जा सकता है। केरेटिनकोशिकाओं cytokeratin-14 Positiv से बना एक एपिडर्मल परत फार्मई कोशिकाओं (चित्रा 3 बी, एफ) और देर से भेदभाव मार्कर cytokeratin-10 सुप्रा-बेसल परतों (चित्रा -3 सी, जी) में व्यक्त किया है। इसके अलावा, परत corneum filaggrin (चित्रा 3 डी, एच) के लिए सकारात्मक है।
21 दिन संस्कृति अवधि के बाद, AWD FTSE में त्वचीय घाव उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। चित्रा -4 ए में दिखाया गया है, AWD बाँझ शर्तों सुनिश्चित करने के लिए एक बंद बॉक्स-प्रणाली के रूप में निर्माण किया है। 4B चित्रा में लोग घायल हो गए प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध ड्राइंग प्रदर्शन किया है। FTSE एक नमूना वाहक थाली पर तय कर रहे हैं। ऐसी गति और ड्रिल सिर (चित्रा 4D) की क्रांतियों को कम करने के रूप में मानकों की स्थापना सहित पूरे लोग घायल हो गए प्रक्रिया है, साथ ही प्रवेश की गहराई नियंत्रित कंप्यूटर सहायता प्रदान की है। घायल प्रक्रिया एक सामने खिड़की के माध्यम से या लोग घायल हो गए दौरान सभी कदम है कि रिकॉर्ड एक उच्च संकल्प कैमरा द्वारा ऑप्टिकली नजर रखी जा सकती प्रक्रिया। आकार, आकृति और घाव चोट की गहराई (चित्रा 4C) को व्यक्तिगत रूप से समायोजित किया जा सकता है।
जल्दी भेदभाव केरातिन रेशा cytokeratin-14 (बी) और देर से भेदभाव रेशा cytokeratin के लिए चित्रा 1. पूर्ण मोटाई त्वचा समकक्ष के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं की विशेषता। Vimentin (ए) के लिए प्राथमिक मानव त्वचीय fibroblasts की immunohistochemical धुंधला और एपिडर्मल केरेटिनकोशिकाओं की -10 (सी)। सकारात्मक धुंधला भूरे रंग से दिखाया गया है। स्केल सलाखों 100 माइक्रोन से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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चित्रा संस्कृति की स्थिति और पूर्ण मोटाई त्वचा समकक्ष की परिपक्वता की 2. परिवर्तन। पूर्ण मोटाई त्वचा के macroscopic तस्वीरें submers शर्तों (ए) और हवा तरल इंटरफेस (बी) में 14 दिनों के अंतर्गत 7 दिनों के लिए सुसंस्कृत समकक्ष। विभिन्न विकास के चरणों में पूर्ण मोटाई त्वचा समकक्षों के Haematoxylin और eosin धुंधला की तुलना: हवा तरल इंटरफेस में 7 दिन (सी), 14 दिनों (7 दिनों हवा तरल इंटरफेस, डी) और 21 दिन (14 दिनों के बाद, ई)। देशी मानव त्वचा (एफ) के Haematoxylin और eosin धुंधला। स्केल सलाखों 100 माइक्रोन से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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पूर्ण मोटाई त्वचा समकक्ष चित्रा 3. विशेषता पूर्ण मोटाई त्वचा समकक्षों के immunohistochemical धुंधला की तुलना। (ए - डी) और देशी मानव त्वचा - vimentin के लिए (ई एच) (ए, ई), cytokeratin-14 (बी, एफ), cytokeratin-10 (सी, जी) और filaggrin (डी, एच)। स्केल सलाखों 100 माइक्रोन से संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पूर्ण मोटाई त्वचा समकक्ष पर नियंत्रित लोग घायल हो गए के लिए चित्रा 4. स्वचालित लोग घायल हो गए डिवाइस। स्वचालित लोग घायल हो गए डिवाइस (AWD) बाँझ conditio प्रदान करता हैनियंत्रित लोग घायल हो गए प्रक्रिया (ए) के दौरान एन एस। एक संलग्न कंप्यूटर (सीपीयू) AWD नियंत्रित करता है। पूर्ण मोटाई त्वचा समकक्ष (ftSEs) नमूना वाहक प्लेट (एससीपी) पर रखा जाता है, नमूना आकृति विज्ञान में विचलन लोग घायल हो गए प्रक्रिया से चलाता है, जो एक प्रकाश बाधा (पौंड), से बराबरी कर रहे हैं। घाव आकार का इस्तेमाल किया ड्रिलिंग सिर (डीएच) पर निर्भर करता है। व्यास 1 मिमी 2 मिमी (सी, ऊपरी छवि) (सी, कम छवि) से चलता है। लोग घायल हो गए प्रक्रिया पर नजर रखी है और प्रलेखन और गुणवत्ता प्रबंधन (डी) के लिए रिकॉर्ड किया जा सकता है। Hematoxylin और eosin एक 1 मिमी ड्रिलिंग सिर (ई) का उपयोग कर स्वचालित लोग घायल हो गए डिवाइस के साथ घायल एक पूर्ण मोटाई त्वचा समकक्ष के पार अनुभाग दाग। सभी पैमाने सलाखों 2 मिमी संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इन विट्रो कोशिकाओं में आमतौर पर कोशिकाओं प्लास्टिक की सतहों का पालन करना है जिसमें दो आयामी सेल संस्कृतियों में विस्तार कर रहे हैं। हालांकि, इन संस्कृति शर्तों कोशिकाओं vivo में बढ़ने में जो शारीरिक तीन आयामी स्थिति को प्रतिबिंबित नहीं करते। तीन आयामी शर्तों के तहत, कोशिकाओं प्राकृतिक सेल सेल और सेल-मैट्रिक्स संलग्नक फार्म कर सकते हैं और तीन आयामों में आ जाते हैं। सेल प्रवास और मैट्रिक्स पीढ़ी घाव भरने के महत्वपूर्ण तत्व हैं के रूप में विशेष रूप से इन विवो स्थिति की समानता चिकित्सा त्वचीय घाव में, सार्थक डेटा उत्पन्न करने के लिए निर्णायक है।
मानव प्राथमिक कोशिकाओं से बना रहे हैं कि हम FTSE विकसित इन शर्तों की नकल और चमड़े और त्वचा की एपिडर्मल परत दोनों को प्रतिबिंबित करने के लिए आदेश में। हवा तरल इंटरफेस में संस्कृति के दो सप्ताह के दौरान, HEK अलग भेदभाव चरणों और एक परत corneum में केरेटिनकोशिकाओं की कई परतों से बना एक एपिडर्मिस के रूप में। एफurthermore, त्वचीय परत मैं हाइड्रोजेल एक कोलेजन में एम्बेडेड रहे हैं जो HDF, से बना है। संस्कृति समय के दौरान, HDF मॉडल (चित्रा 2 बी) की एक महत्वपूर्ण संकोचन में जो परिणाम त्वचीय घटक, फिर से तैयार।
प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मानकीकृत घावों को तैयार करने के लिए, हम एक AWD विकसित की है। कंप्यूटर नियंत्रित मशीन परिभाषित और सटीक त्वचीय चोटों (चित्रा 4) निर्धारित कर सकते हैं। चोट के अनुसंधान के उद्देश्य, गहराई, आकृति और आकार पर निर्भर करता है अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि, AWD और FTSE की आकृति विज्ञान की तकनीकी विशिष्टताओं के कारण, यह 100 माइक्रोन reproducibility के एक न्यूनतम प्रवेश सेट करने के लिए सिफारिश की है। AWD एक बंद बॉक्स-प्रणाली में बाँझ शर्तों के तहत काम कर रही है और सभी घटकों वाष्पदावी, कीटाणुशोधन समाधान या पराबैंगनी प्रकाश द्वारा निष्फल किया जा सकता है। लोग घायल हो गए प्रक्रिया के लिए तैयारी में नमूने एक नमूना वाहक थाली को हस्तांतरित करने की जरूरत है। यह प्लेट एक की सुविधानमूने की सही स्थिति। इसके अलावा नमूना और नमूना वाहक थाली के बीच आसंजन लोग घायल हो गए प्रक्रिया के दौरान जगह में नमूने रखने के लिए पर्याप्त है। लोग घायल हो गए प्रक्रिया ही एक सामने खिड़की के माध्यम से या एक क्लोज़-अप की स्थिति से सभी कदम है कि रिकॉर्ड एक उच्च संकल्प कैमरा द्वारा ऑप्टिकली पर नजर रखी जा सकती है। एक घाव उत्पन्न करने के लिए ऊतक खुदाई लेसरों का उपयोग करने वाले अन्य प्रणालियों के विपरीत, AWD एक घूर्णन ड्रिल कार्यरत हैं। इस प्रकार, कोई गर्मी यांत्रिक घाव की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण विशेषाधिकार है, जो प्रक्रिया के दौरान लागू किया जाता है। इसके अतिरिक्त, ड्रिलिंग सिर के विशिष्ट आकार घाव चैनल से सामग्री हटाने सुनिश्चित करता है। घायल प्रक्रिया से ऊपर उल्लेख किया empirically निर्धारित लोग घायल हो गए मापदंडों का उपयोग FTSE या देशी त्वचा के नमूनों या तो विशिष्ट शारीरिक गुणों को पूरा करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। इस तरह एपिडर्मल परतों के बिना किसी खास उद्देश्य सेना की टुकड़ी की तरह किसी भी अवांछनीय दुष्प्रभाव को कम से कम किया जा सकता है और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य लोग घायल हो गए एक सफलता दर के साथ प्रदर्शन90% की।
इस अध्ययन में विकसित FTSE आंशिक रूप से सही रूप में त्वचा के vivo स्थिति की नकल है और इस तरह घाव भरने के अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में नियोजित किया जा सकता है कि यह दर्शाता है। ऐसे वाहिका संरचना, खून का थक्का और प्रतिरक्षा प्रणाली के प्रभाव के रूप में घाव भरने की प्रक्रिया के महत्वपूर्ण पहलुओं को मॉडल में कमी कर रहे हैं, हालांकि एपिडर्मल-mesenchymal और सेल-मैट्रिक्स बातचीत एक तीन आयामी अत्यधिक मानकीकृत वातावरण में recapitulated है। इसके अलावा, हम AWD त्वचा मॉडल में मानकीकृत घावों को उत्पन्न करता है कि दिखा सकता है। संयोजन में, दोनों प्रौद्योगिकियों घाव भरने और घाव भरने की प्रक्रिया का समर्थन करने वाले पदार्थों और दवाओं के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। और अधिक बारीकी से vivo में स्थिति की नकल करने के लिए, FTSE ऐसे melanocytes, त्वचा ट्यूमर कोशिकाओं या सूक्ष्म संवहनी endothelial कोशिकाओं के रूप में अन्य कोशिकाओं से बढ़ाया जा सकता है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin EDTA (1:250) 0.5% in DPBS | PAA | L11-003 | 0.05% |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Collagen (6 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Produced in house | ||
| Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml) | Life Technologies | 33016-015 | |
| Inserts | Nunc | 140627 | |
| 6 well plate | Nunc | 140685 | |
| 24 well plate | Nunc | 142485 | |
| Microscope slides | R. Langenbrinck | 03-0070 | |
| Fibroblasts culturing (500 ml): | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-092 | 89% (445 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 10% (50 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Keratinozyten culture medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | 89% (445 ml) |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Gel neutralization solution (250 ml): | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine | PAA | G0001,3010 | 93% (232.5 ml) |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-1g | 1% (2.5 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 3% (7.5 ml) |
| HEPES | Sigma | H3375-1kg | 3% (7.5 ml) |
| Skin model submers medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Fetal calf serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 5%-2% (25 ml-10 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Skin model air-liquid interface medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack | Promocell | C-39011 | adding only supplements: insulin, hydrocortisone, epinephrine, transferrin, CaCl2 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| CaCl2 (300 mM) | Sigma | C7902-500g | 0.62% (3.1 ml) |
| Histology: | |||
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| CK14 antibody | Sigma | HPA023040-100µl | |
| CK10 antibody | Dako | M7002 | |
| Filaggrin antibody | Abcam | ab81468 | |
| H&E staining: | |||
| Mayer´s Haemalaun | AppliChem | A0884,2500 | |
| Xylol | Sigma Aldrich | 296325-4X2L | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-4X2.5L | |
| HCl | Sigma Aldrich | H1758-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | E4009-5G | |
| 2-Propanolol | Sigma Aldrich | I9516-500ML | |
| Mounting Medium | Sigma Aldrich | M1289-10ML | |
References
- Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. The skin: an indispensable barrier. Exp Dermatol. 17, 1063-1072 (2008).
- Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89, 219-229 (2010).
- Kirsner, R. S., Eaglstein, W. H. The wound healing process. Dermatol Clin. 11, 629-640 (1993).
- Cory, G. Scratch-wound assay. Methods Mol Biol. 769, 25-30 (2011).
- Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents. J Biotechnol. 122 (3), 372-381 (2006).
- Harrison, C. A., Heaton, M. J., Layton, C. M., Mac Neil, S. Use of an in vitro model of tissue-engineered human skin to study keratinocyte attachment and migration in the process of reepithelialization. Wound Repair Regen. 14 (2), 203-209 (2006).
- Wilkins, L. M., Watson, S. R., Prosky, S. J., Meunier, S. F., Parenteau, N. L. Development of a bilayered living skin construct for clinical applications. Biotechnol Bioeng. 43 (8), 747-756 (1994).
- Gangatirkar, P., Paquet-Fifield, S., Li, A., Rossi, R., Kaur, P. Establishment of 3D organotypic cultures using human neonatal epidermal cells. Nat Protoc. 2 (1), 178-186 (2007).
- Boyce, S. T. Skin substitutes from cultured cells and collagen-GAG polymers. Med Biol Eng Comput. 36 (6), 791-800 (1998).
- El-Ghalbzouri, A., Lamme, E. N., van Blitterswijk, C., Koopman, J., Ponec, M. The use of PEGT/PBT as a dermal scaffold for skin tissue engineering. Biomaterials. 25 (5), 2987-2996 (2004).
- Maas-Szabowski, N., Shimotoyodome, A., Fusenig, N. E. Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism. J Cell Sci. 112 (Pt 12), 1843-1853 (1999).
- Coolen, N. A., Vlig, M., vanden Bogaerdt, A. J., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Development of an in vitro burn wound model. Wound Repair Regen. 16 (4), 559-567 (2008).
- Oberringer, M., Meins, C., Bubel, M., Pohlemann, T. A new in vitro wound model based on the co-culture of human dermal microvascular endothelial cells and human dermal fibroblasts. Biol Cell. 99 (4), 197-207 (2007).
- Cribbs, R. K., Luquette, M. H., Besner, G. E. A standardized model of partial thickness scald burns in mice. J Surg Res. 80 (1), 69-74 (1998).
- Reed, J. T., Ghadially, R., Elias, P. M. Skin type, but neither race nor gender, influence epidermal permeability barrier function. Arch Dermatol. 131 (10), 1134-1138 (1995).
- Pilcher, B. K., et al. Keratinocyte collagenase-1 expression requires an epidermal growth factor receptor autocrine mechanism. J Biol Chem. 274 (15), 10372-10381 (1999).
- Blank, I. H., Miller, O. G. A method for the separation of the epidermis from the dermis. J Invest Dermatol. 15 (1), 9-10 (1950).
- El Ghalbzouri, A., et al. Fibroblasts facilitate re-epithelialization in wounded human skin equivalents. Lab Invest. 84 (1), 102-112 (2004).
- Vaughan, M. B., et al. A reproducible laser-wounded skin equivalent model to study the effects of aging in vitro. Rejuvenation Res. 7 (2), 99-110 (2004).
- Geer, D. J., Swartz, D. D., Andreadis, S. T. In vivo model of wound healing based on transplanted tissue-engineered skin. Tissue Eng. 10 (7-8), 1006-1017 (2004).
- Bell, E., et al. The reconstitution of living skin. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 2s-10s (1983).
- Asselineau, D., Prunieras, M. Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication. Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 219-222 (1984).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
