Introduction
皮膚は体の最大の器官である。これは、外部環境と内部器官の間の障壁を作成します。さらに、皮膚は、流体損失、環境の影響、傷害および感染から身体を保護し、体温1を調節するのに役立つ。 、その暴露の場所に、皮膚は、多くの場合、機械的、熱的または化学的な外傷の影響を受けます。皮膚の自己修復が可能な一般的であるが、そのような感染症、酸素、および静脈充足などの複数の局所因子は、創傷治癒障害をもたらすことができる。創傷治癒はまた、肥満、アルコール依存症、喫煙、薬物療法、栄養、糖尿病などの疾患などの全身的な要因によって干渉することができます。2
（i）の炎症段階、（ii）の増殖および（iii）リモデリング段階：創傷治癒の過程は3段階に分けることができる。皮膚への損傷時には、複雑な信号カスケードは、傷の閉鎖につながる、開始します。3損傷後、創傷は出血し、血餅が形成される。線維芽細胞は、血液凝固に移動し、その後年間で改装された新しい組織と交換してください。
皮膚の修復の基礎となる生物学的プロセスの現在の理解は限られている。小動物およびブタモデルは創傷治癒を研究するために使用されてきた。しかし、これらの結果は、直接に種特異的な違いに起因するヒトに転送することができない。これらのin vivoモデルに加えて、創傷治癒のいくつかの側面は、不死化細胞株または初代細胞に基づくin vitroで単層培養物のスクラッチを介して、創傷の状況をシミュレートすることによって調べることができる4これらのスクラッチモデルは高度に標準化されているが、十分に反映していない複合体のin vivo生理学5の二次元モデルの他には、三次元のヒト皮膚同等物は、皮膚科学研究のために開発されている。これらのモデルの皮膚部分は、葛ある脱細胞化真皮、6コラーゲンハイドロゲル、7,8グリコサミノグリカン9または合成材料を含む様々な足場を使用してnerated。10これらの皮膚同等物、上皮間葉相互作用11の役割、再上皮、線維芽細胞およびケラチノサイトの間に細胞のクロストークや採用異なる成長因子の影響を研究することができる。さらに、これらのモデルは、線維芽細胞が創傷領域内に移動し、どのように走化性因子は、組織再生にどのように影響するかについての新しい知識を得るために有用である。12
創傷治癒モデル自体の唯一ではない世代は挑戦的であるだけでなく、モデル性の高い標準化された傷を確立することは問題がある。傷を作成するための一般的な技術は、スクラッチテスト、13火傷、14テープ摩耗、15熱傷、16吸引水疱、17液体窒素、18レーザー、19アール、18メッシャー6と生検パンチ。20これらのメソッドのほとんどは、同じ落とし穴を持っている。手動で実装けがを標準化し、複数のテストの間で再現することが困難である。サイズ、形状、および傷の深さは、研究の間で変化するので、研究データの品質を損なう。定義された皮膚の創傷のためのレーザーの使用は、比較的容易に標準化されたが、火傷を模倣する状況をもたらすことができる。レーザーによって加えられた熱は、壊死組織につながることができ、タンパク質の変性、血小板の凝集や血管収縮を引き起こす可能性があります。
別のアプローチでは、我々は、私たちは、無菌条件下で定義されており、正確な皮膚創傷を生成することができ、自動化創傷デバイス（AWD）を、開発しました。浸透深さと速度のようなパラメータを創傷ならびにドリルヘッドの回転を規制することができる。本研究では、家の中で開発された全層皮膚等価物とAWDを組み合わせた（FTGangatirkar らによって公開プロトコルに匹敵するSE）。8皮膚同等物の真皮層は、I型コラーゲンは、ヒドロゲルに埋め込 まれたヒト皮膚線維芽細胞（HDF）、から構成されている。真皮層の上に、ヒト表皮ケラチノサイト（HEK）は播種。二週間以内に、気液界面でのHEKは、いくつかの重要な細胞層からなる表皮と角質層を構築する。このモデルの生成に加えて、本研究では、FTSEで定義され、正確な傷を作成するためのAWDの使用を示している。
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Protocol
注：プロトコルは24全層皮膚同等物の生産のために設計されている。ヒト皮膚線維芽細胞と表皮角化細胞は、以前に公開されたプロトコルに従って、皮膚生検から単離した。21,22インフォームドコンセントが事前に得られたものであり、研究はユリウスマクシミリアン大学ヴュルツブルクの人間研究に制度的倫理委員会によって承認された（182投票/ 10）。
皮膚コンポーネントの1。生産
- を6mg / mlの最終濃度まで0.1％酢酸を有するコラーゲンを溶解する。ゲル中和溶液は、232.5ミリリットル2回DMEM、7.5ミリリットルのウシ胎児血清、7.5ミリリットル3 M HEPES、2.5ミリリットルコンドロイチン硫酸（5ミリグラム/ ml）を混合する。氷の上でゲル中和溶液とコラーゲン溶液を保管してください。挿入/肌当量当たりゲルの500μlのを計算します。
NOTE：ゲル中和溶液は、コラーゲン溶液のprepaの2つの部分と混合されるようにコラーゲンの倍の量の再。 - 24ウェルプレートに24のインサートを置きます。
- 10ミリリットルDMEM、270×gで5分間遠心分離器でヒト皮膚線維芽細胞（HDF）を再懸濁し、細胞を数える。 G X 270で5分間に必要なHDFの量（500μlのコラーゲンゲルあたり5×10 4細胞）と遠心細胞を抽出します。
- 上清を除去し、慎重に気泡を発生させずに、ゲル中和液を冷却して4ミリリットルでHDFを懸濁します。このステップから、コラーゲンゲルの早期凝固を避けるために、可能な限り高速に動作することを確認してください。
- コラーゲン溶液8mlの溶液を再懸濁する。
- マルチステップ·ピペットでコラーゲン - 細胞混合物を取り、各挿入で急速混合物500μlのを埋める。ゲルをゼリー状にするために、インキュベーター（37℃、5％CO 2）中で20分間ゲルをインキュベートする。
- ウェル当たり2ミリリットルダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）+ 10％ウシ胎児血清（FCS）でゲルを沈めるインキュベーター（37℃、5％CO 2）で24時間静置する。
ヒト表皮ケラチノサイト（HEK）2.追加
- 24時間後に培地を除去します。を50μg/ mlの最終濃度になるように超純水でフィブロネクチンヒトタンパク質を溶解する。フィブロネクチン溶液25μlの各真皮同等物をカバーしています。インキュベーター（37℃、5％CO 2）中で30分間ゲルをインキュベートする。
- その間、10mlのKGM-2でHEKを再懸濁し、KGM-2 5 +準備％FCSで1×10 6細胞/ mlに細胞濃度を設定する。各ゲル上の種子1×10 5 HEK。細胞が付着できるように、インキュベーター（37℃、5％CO 2）中で45分間ゲルをインキュベートする。
- インキュベーター（37℃、5％CO 2）中で、5％FCS +準備し、培養それらKGM-2を有するゲルを沈める。
全層皮膚等価物の3.文化（FTSE）
- 6-7日間培養しFTSEFCS濃度（5％、2％、および0％FCS）降順。次に低いFCS濃度が2〜3日ごとに培地を変更します。このために、完全に培地を除去し、新鮮な培地の1.6ミリリットルを追加します。
- 7日目に、完全培地を除去。
注：そうしながら、ピペットの先端でFTSE表面に触れないでください。 - 滅菌ピンセットで6ウェルプレートの1ウェルに挿入するたびに配置します。 FTSE表面を濡らしていないことを確認、ウェル当たり1.5ミリリットル空輸媒体を追加します。さらに14日間、2〜3日ごとに培地を変更します。
注：メディアの充填レベルは、FTSEのメニスカスまでです。
4.組織学的分析
- 固定し、FTSEのパラフィン包埋
- 培地を除去、新鮮な24ウェルプレートにインサートを転送し、各ウェルに、4％パラホルムアルデヒド、1.6を加えて組織を固定し、室温で2時間、組織をインキュベートする。注意！パラホルムアルデヒドは、ヒュームフードの下で操作し、有毒である。転送組織埋め込みカセットにFTSE。水で洗浄することにより、残りの固定液を除去し、昇順エタノール濃度を用いて組織を脱水。
- 真ん中の縦のカットによる皮膚同等物を分割します。下向きに切断面を持つパラフィン充填金属ベース金型に2枚を配置します。バッキングとして金型の上に組織カセットを追加します。
- 適切な顕微鏡スライド上にスライドマウント、3-5程度のスライスをカットし、straitening、40℃の水浴上でそれらをフロート。徹底的に乾燥スライス。
- ヘマトキシリン＆エオシン（H＆E）および免疫組織化学（IHC）染色
- 場所は、ラックに挿入し、60℃で1時間インキュベートする。パラフィンが溶融していることを確認します。ステインは、標準化された概要染色などのH＆Eとのスライスを再水和。
- H＆E染色のために50％エタノール、4倍の脱イオン水、1×ヘマトキシリン、1×塩酸、電子を1倍、エタノールで2回、エタノールで3回、キシロールで70％96％4倍ガラス染色キュベットを準備thanol（13.7ミリリットル1 MのHCl広告200ミリリットルの50％エタノール）、1×タブ水、1×エオシン及び2×2プロパノール（100ミリリットルの脱イオン水中1グラムのエオシン）。
- 場所はスライドを脱パラフィンし、再水和するキシロールIIにキシロールIおよび10分で10分をスライド。ディップは、エタノール50％エタノール70％、3回で3回、エタノールでエタノール96％I、3回で96％IIを3回スライドさせる。脱イオン水でスライドを回転させます。ヘマトキシリン染料を区別するために、塩酸 - エタノールで2倍を浸し。脱イオン水ですすいでください。ブルーイングのために、場所は、タブの水に5分をスライド。エオシン染色のために、場所はエオシンで1分をスライドし、脱イオン水で、その後洗い流してください。脱水、ディップスライドはエタノール96％エタノール中で70％、2×2×2-プロパノールII中で5分間、2プロパノールI中で5分間に置き、キシロール中で5分間IキシロールIIで5分。 H＆E染色した後、細胞核が赤く染色される青色、細胞質と細胞外マトリックスに染色される。
- 抗原回復のために、キシレンでパラフィンを除去し、染色のためのスライスを再水和。スライスを配置スチームクッカーでと、予熱した10 mMのクエン酸緩衝液（pH 6）で20分間脱パラフィンし、再水和のスライスを調理。
- 撥液性スライドマーカーペンまたはダイヤモンド針を有する洗浄緩衝液の代わりスライド（PBS緩衝液+ 0.5％ポリソルベート20）、円スライス。
- 湿気チャンバー内でスライドを置きます。各スライスに100μlの3％過酸化水素溶液を添加することにより、内因性ペルオキシダーゼをブロックする。注意！皮膚や眼への接触の場合は非常に危険な。個人用保護具を取り扱ってください。洗浄は、洗浄緩衝液中でスライドする。
- 一次抗体を適用し、室温で1時間インキュベートする。洗浄は、洗浄緩衝液で3回スライドさせる。ここから先、サンプルは暗所に保管する必要があります。
- 特異的な抗原 - 抗体結合の検出のためにビオチン - ストレプトアビジンの検出システムを使用する。
- 1分間ヘマトキシリンで核を対比。スライドを脱水し、マウントします。
- 逆顕微鏡を用いた画像のサンプル。
- 70％エタノールおよび紫外光で作業領域を消毒することでAWDを準備します。目的のサイズ（ 例えば、1ミリメートル）のドリルヘッドが装着されていることを確認します。
- 滅菌ピンセットを用いて、オートクレーブ処理サンプルキャリアプレートの指定された領域に皮膚等価物を置きます。ドリルヘッド下のソケットにサンプルキャリアプレートを置きます。
- スピン速度：次のように創傷のパラメータを設定する制御ソフトウェアを使用して、15,000 rpmでの、浸透：1.5ミリメートル。推進：100ヘルツ。これらのパラメータは、個別に各サンプルタイプのために定義される必要がある。 AWDに創傷パラメータを転送します。
- 手続きが負傷開始します。ソケットからサンプルキャリアプレートを取り外します。転送には、滅菌ピンセットを用いて培養に用いるインサートに戻すFTSEを負傷した。
- 再生の調査のためのインキュベーター（37℃、5％のCO 2）で負傷FTSEの文化に進みます。アルternatively、任意の時点で、組織学的分析のためのモデルを使用しています。
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Representative Results
孤立したHDFとHEKは、形態で、典型的なマーカーの発現の両方で異なっている。 HEKの形態は敷石状形態によって説明することができるのに対し、HDFは、典型的な紡錘状の形態を示した。細胞は、FTSEのためにそれらを使用する前に、免疫組織化学的染色（ 図1）によって特徴付けられた。 HDFは、線維芽細胞のマーカーであるビメンチン（ 図1A）に陽性である。主要HEKは非常初期分化タンパク質、サイトケラチン14（ 図1B）が、ほぼ無後期ケラチノサイト分化タンパク質、サイトケラチン10（ 図1C）を発現する。
初代培養の後、我々は、細胞培養フラスコから細胞を剥がし、FTSEの生成のためにそれらを使用する。 FTSEは気液界面（ 図2B）で14日間培養したsubmers培地条件（ 図2A）の下で7日間培養した。このプロセス中、fはかなり東証契約。 21日以内にHEKは（ 図2C-E）増殖している。モデルの表面が空気にカルシウム濃度を増加させることによって露出されるように、中レベルを変更することにより、HEK、異なる分化状態でケラチノサイトのいくつかの重要な細胞層から構成されている多細胞の表皮に分化するように刺激されていると角質層 （ 図2E）。
天然のヒトの皮膚で、FTSE（ 図2E）のヘマトキシリン＆エオシン染色を比較すると（ 図2F）は 、それが明らかになった皮膚のFTSE模倣組織学的ア ーキテクチャという。これはさらに、免疫組織化学的染色（ 図3）によって示すことができる。コラーゲンIのヒドロゲル中のHDFは、ビメンチンに対する一次抗体（ 図3A、E）で染色することができる。ケラチノサイトは、サイトケラチン14 positivからなる表皮層を形成する電子細胞（ 図3B、F）および後期分化マーカーサイトケラチン10は、超相基底層（ 図3C、G）で表される。さらに、 角質層は、フィラグリン（ 図3D、H）に対して陽性である。
21日間の培養期間後、AWDは、FTSEにおける皮膚創傷を作製した。 図4Aに示すように、AWDは、無菌状態を確保するために、密閉箱系として構成されている。 図4Bに、創傷のプロセスの概略図が示されている。 FTSEは、サンプルキャリアプレートに固定されている。そのような速度及びドリルヘッド（ 図4D）の回転数を低下させるなどのパラメータの設定を含む全創傷工程、ならびに浸透深さを制御するコンピュータが補助される。負傷の手順は、フロントウィンドウを介して、または創傷中にすべてのステップを記録し、高解像度カメラで光学的に監視することができます手順。創傷傷害の大きさ、形状及び深さ（ 図4C）を個別に調整することができる。
初期分化ケラチンフィラメントサイトケラチン14（B）および後期分化フィラメントサイトケラチン図1.全層皮膚等価物の構築のために使用される細胞のキャラクタリゼーション。ビメンチン（A）の一次ヒト皮膚線維芽細胞の免疫組織化学的染色及び表皮角化細胞の-10（C）。陽性染色は茶色で示されている。スケールバーは、100μmを示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図2.培養条件および全層皮膚等価物の成熟の変化。全層皮膚の肉眼写真は、気液界面（B）でsubmers条件（A）及び14日の下で7日間培養当量。異なる発達段階における全層皮膚等価物のヘマトキシリン＆エオシン染色の比較：気液界面での7日間（C）、14日（7日気液界面、D）を行い、21日目（14日後、 E）。天然のヒトの皮膚（F）のヘマトキシリン＆エオシン染色。スケールバーは、100μmを示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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全層皮膚同等の図3キャラ全層皮膚同等物の免疫組織化学的染色の比較（A - D）およびネイティブヒト皮膚-ビメンチン（E H）（A、E）、サイトケラチン14（B、F）サイトケラチン10（C、G）およびフィラグリン（D、H）。スケールバーは、100μmを示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
全層皮膚同等物に制御さ創傷図4.自動創傷デバイス。自動化された創傷デバイス（AWD）は、無菌conditioを提供しています制御創傷手順（A）中のNS。接続されたコンピュータ（CPU）AWDを制御します。全層皮膚等価物（ftSEs）は、サンプルキャリアプレート（SCP）上に配置され、サンプルの形態における偏差は創傷手順をトリガする光バリア（LB）によって等化される。傷の形状が使用されるドリルヘッド（DH）に依存します。直径は、1mmから2mm（C、上部画像）（C、下部画像）の範囲である。創傷処置が監視され、文書化と品質管理（D）のために記録することができる。ヘマトキシリン＆エオシンで1mmのドリルヘッド（E）を用いて自動創傷デバイスで創傷の全層皮膚同等の断面を染色した。すべてのスケールバーは、2mmを示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
インビトロで細胞は通常、細胞がプラスチック表面に付着した二次元細胞培養物中で増殖させる。しかしながら、これらの培養条件は、細胞が生体内で成長する生理学的三次元の条件を反映していない。三次元の条件の下では、細胞は、天然の細胞 - 細胞および細胞 - マトリックスの添付ファイルを形成することができ、三次元に遊走する。特にin vivoでの状況の類似治癒皮膚創傷における細胞遊走及びマトリックスの生成は、創傷治癒の重要な要素であるように、意味のあるデータを生成することが極めて重要である。
これらの条件を模倣するために、我々は、ヒト初代細胞で構成され、皮膚および皮膚の表皮層の両方を反映していることFTSEを開発した。空気-液体界面での培養の2週間、HEK、異なる分化段階でケラチノサイトのいくつかの層から成る表皮と角質層を形成する。 Furthermore、真皮層は、I型コラーゲンは、ヒドロゲル中に埋め込まれているHDF、から構成されている。培養時間の間、HDFは、モデル（ 図2B）の有意な収縮をもたらす真皮成分を、改造。
再現性があり、標準化された傷を準備するために、我々はAWDを開発しました。コンピュータ制御マシンが定義されており、正確な皮膚傷害（ 図4）を設定することができます。傷害の意図された研究、深さ、形状および大きさに応じて適合させることができる。しかし、AWDとFTSEの形態の技術仕様のため、それは100μmの再現性の最小限の浸透を設定することをお勧めします。 AWDは、密閉箱システムにおいて無菌条件下で動作しているすべてのコンポーネントは、オートクレーブ、消毒溶液または紫外線によって滅菌することができる。創傷処置の準備のためのサンプルは、サンプルキャリアプレートに転送する必要がある。このプレートは、容易にサンプルの正確な位置。さらに、試料と試料キャリアプレートとの間の接着は、創傷処置中に所定の位置に試料を保持するのに十分である。創傷手順自体は、フロントウィンドウを介して、またはクローズアップ位置からのすべてのステップを記録する高解像度カメラで光学的に監視することができる。傷を生成するために、組織を掘削するレーザーを使用する他のシステムとは異なり、AWDは、回転ドリルを採用しています。このように、全く熱が機械的な傷を調査するための不可欠な役得である手順、中に適用されません。さらに、ドリルヘッドの具体的な形状は、創傷チャンネルからの材料除去を確実にします。創傷処置上記の経験的に決定された創傷のパラメータを使用することはFTSEまたは天然の皮膚サンプルのいずれかの特定の生理学的特性を満たすように調整することができる。この方法は、表皮層の意図しない剥離のような任意の望ましくない副作用を最小限に抑えることができ、再現性の創傷は、成功率で行う90％。
この研究は、開発FTSEが一部正確に皮膚のインビボ状況を模倣するため、創傷治癒研究のためのモデルとして用いることができることを示している。そのような血管系、血液凝固および免疫系の効果と創傷治癒プロセスの重要な態様は、モデルに欠けているが、上皮 - 間葉及び細胞 - マトリックス相互作用は、三次元の高度に標準化された環境で要約されている。さらに、我々はAWD皮膚モデルで標準化された傷を生成することを示すことができた。組み合わせて、両方の技術は、創傷治癒、治癒プロセスを支援する物質や薬剤の効果を調査するために使用することができる。より密接にin vivoでの状況を模倣するために、FTSEは、メラニン細胞、皮膚腫瘍細胞または微小血管内皮細胞などの他の細胞によって拡張することができる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin EDTA (1:250) 0.5% in DPBS | PAA | L11-003 | 0.05% |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Collagen (6 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Produced in house | ||
| Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml) | Life Technologies | 33016-015 | |
| Inserts | Nunc | 140627 | |
| 6 well plate | Nunc | 140685 | |
| 24 well plate | Nunc | 142485 | |
| Microscope slides | R. Langenbrinck | 03-0070 | |
| Fibroblasts culturing (500 ml): | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-092 | 89% (445 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 10% (50 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Keratinozyten culture medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | 89% (445 ml) |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Gel neutralization solution (250 ml): | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine | PAA | G0001,3010 | 93% (232.5 ml) |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-1g | 1% (2.5 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 3% (7.5 ml) |
| HEPES | Sigma | H3375-1kg | 3% (7.5 ml) |
| Skin model submers medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Fetal calf serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 5%-2% (25 ml-10 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Skin model air-liquid interface medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack | Promocell | C-39011 | adding only supplements: insulin, hydrocortisone, epinephrine, transferrin, CaCl2 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| CaCl2 (300 mM) | Sigma | C7902-500g | 0.62% (3.1 ml) |
| Histology: | |||
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| CK14 antibody | Sigma | HPA023040-100µl | |
| CK10 antibody | Dako | M7002 | |
| Filaggrin antibody | Abcam | ab81468 | |
| H&E staining: | |||
| Mayer´s Haemalaun | AppliChem | A0884,2500 | |
| Xylol | Sigma Aldrich | 296325-4X2L | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-4X2.5L | |
| HCl | Sigma Aldrich | H1758-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | E4009-5G | |
| 2-Propanolol | Sigma Aldrich | I9516-500ML | |
| Mounting Medium | Sigma Aldrich | M1289-10ML | |
References
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