Introduction
피부는 신체에서 가장 큰 기관이다. 그것은 외부 환경과 내부 장기 사이에 장벽을 만듭니다. 또한, 피부는 유체 손실, 환경 적 영향, 상처 감염으로부터 몸을 보호하고, 체온을 조절 한 것을 돕는다. 인해 노출 된 위치에, 피부는 종종, 기계적, 열적 또는 화학적 외상에 의해 영향을 받는다. 피부 자체 수리의 일반적으로 사용하는 것은 아니지만, 감염, 산소, 정맥 자족 여러 지역 요인 손상된 상처 치유 될 수 있습니다. 상처 치유는 비만, 알코올 중독, 흡연, 약물, 영양, 당뇨병과 같은 질환 등의 전신적인 요인에 의해 방해 할 수있다. (2)
(I) 염증 상, (II) 및 증식 (III) 리모델링 단계 : 상처 치유 과정은 3 단계로 나눌 수있다. 피부에 손상되면, 복잡한 신호 캐스케이드 상처의 폐쇄로 이어지는 시작합니다. 3손상 후 상처 출혈과 혈병이 형성된다. 섬유 아 세포는 혈액 응고로 이동하고 이후 년 동안 리모델링되어 새로운 조직으로 대체.
생물학적 과정의 기본 피부 복구 전류 이해는 제한된다. 작은 동물과 돼지 모델은 상처 치유를 연구하는 데 사용되었다. 그러나, 이러한 결과는 직접 종 특이 차이에 의해 인체에 전달 될 수 없다. 이러한 생체 내 모델에 추가하여, 상처 치료의 일부 양태들은 4 선택된 긁 모델 고도로 표준화. 불멸화 세포주 또는 일차 세포에 기초한 생체 외 단층 배양 스크래칭을 통해 상처 상황을 시뮬레이션에 의해 연구 할 수 있지만, 충분히 반영되지 않는다 복잡한 생체 내 생리. 5 이차원 모델은 또한, 삼차원 인간 피부 등가물 피부병 연구 개발되어왔다. 이 모델의 피부 부분은 GE 있습니다nerated 탈세 포화 진피 6 콜라겐 히드로 겔, 7,8 글리코 9 또는 합성 재료 등 다양한 지지체를 사용. (10)이 피부 등가물을 채용, 상피 간엽 상호 작용 (11)의 역할을, 재 상피화, 섬유 아세포 및 각질 세포 및 간 세포 누화 다른 성장 인자의 영향이 연구 될 수있다. 또한,이 모델은 섬유 아세포가 부상 영역으로 마이그레이션하는 방법과 화학 주성 인자가 조직 재생에 영향을 미치는 방법에 대한 새로운 지식을 습득하는데 유용하다. (12)
상처 치유 모델 자체의 생성뿐만 아니라 도전이지만, 또한 모델의 고도로 표준화 상처 문제가 확립. 일반적인 기술은 상처 스크래치 테스트, 13 화상, 14 테이프 마모, 15 열 손상, 16 흡입 물집, 17 액체 질소, 18 레이저, 19 있습니다 만들 수 있습니다 18 메쉬 작업자 6 생검 펀치. 이러한 방법 20 대부분 같은 함정이있다. 수동으로 구현 부상 표준화 및 여러 테스트를 사이에 재생하기 어렵습니다. 크기, 형상 및 상처의 깊이 연구 사이에서 변화하고, 따라서 연구 데이터의 품질이 저하. 정의 피부 상처 용 레이저의 사용은 비교적 용이하지만 표준화 화상 상처를 흉내 낸 상황에 이르게 할 수있다. 레이저에 의해 적용 열 괴사 조직으로 이어질 수 있습니다 단백질 변성, 혈소판 응집 또는 혈관 수축을 일으킬 수 있습니다.
대안적인 접근법에서, 우리는 우리가 멸균 조건 하에서 정확한 정의 및 피부 상처를 생성 할 수있는 자동화 된 상처 소자 (AWD)를 개발 하였다. 깊이 및 속도의 침투뿐만 아니라 드릴 헤드의 회전 수 등을 파라미터 상흔을 규제 할 수있다. 이 연구에서 우리는 집에서 개발 한 전체 두께 피부 등가물과 AWD를 결합 (피트Gangatirkar 등에 의해 발표 된 프로토콜에 비교할 SE). (8) 피부 상당의 피부 층은 내가 하이드로 콜라겐에 포함 된 인간 피부 섬유 아세포 (HDF)로 구성되어있다. 진피층에서 인간의 표피 각질 형성 세포 (HEK)은 시드입니다. 공기 - 액체 계면에서 2 주 이내에 HEK 여러 중요한 세포층과 각질층 이루어지는 표피를 구축. 이 모델의 생성 외에도,이 연구는 FTSE에 정의 된 정확한 상처를 만들 수있는 AWD를 사용하는 방법을 보여줍니다.
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Protocol
주 : 프로토콜 24 전층 피부 등가물의 제조를 위해 설계된다. 피부 섬유 아세포와 표피의 각질 형성 세포 인간 21, 22 동의서 사전 얻었다. 이전에 출판 된 프로토콜에 따라 피부 생검에서 분리하고, 연구는 율리우스 막시밀리안 대학 뷔르츠부르크의 인간 연구에 대한 기관 윤리위원회에 의해 승인되었다 (182 투표 / 10).
피부 구성 요소 1. 생산
- 6 mg / ml의 최종 농도로 0.1 % 아세트산과 콜라겐 녹인다. 겔 중화 용액의 경우, 232.5 ml의 DMEM 배, 7.5 ml의 소 태아 혈청, 7.5 ㎖의 3 M HEPES, 2.5 ml의 콘드로이틴 설페이트 (5 ㎎ / ㎖)를 혼합한다. 얼음 젤 중화 솔루션과 콜라겐 솔루션을 유지합니다. 삽입 / 피부 당량 당 겔의 500 μl를 계산합니다.
주 : 겔 중화 용액 콜라겐 용액 처리장의 두 부분과 혼합 될 수있는 바와 같이콜라겐의 양을 두 번 다시. - 24 웰 플레이트에 24 삽입을 놓습니다.
- 10 ml의 DMEM, 270 XG에 5 분 동안 원심 분리기에 인간의 피부 섬유 아세포 (HDF)를 재현 탁하고 세포를 계산합니다. g X 270에서 5 분 동안 필요한 HDF의 양 (500 μL 콜라겐 젤 당 5 × 10 4 세포)와 원심 분리기 세포를 추출합니다.
- 4 ml의 기포를 생성하지 않고 겔 중화 용액 냉각에 재현 탁 HDF를 조심스럽게 상층 액을 제거하고. 이 단계에서 콜라겐 젤의 조기 응고를 방지하기 위해 가능한 한 빨리 작업을해야합니다.
- 콜라겐 용액 8ml를 가진 용액을 재현 탁.
- 다단계 피펫으로 콜라겐 세포 혼합물을 가지고 각 삽입 빠르게 혼합물의 500 μl를 입력합니다. 인큐베이터에서 20 분 동안 젤을 품어 (37 ° C, 5 % CO 2) 젤 굳어진합니다.
- 웰당 2ml의 둘 베코 변형 이글 DMEM 배지 + 10 % 소 태아 혈청 (FCS)에서 겔을 담근다및 인큐베이터에서 24 시간 (37 ° C, 5 % CO 2)를 위해 그것을 품어.
인간의 표피 각질 형성 세포의 2. 추가 (HEK)
- 24 시간 후 배지를 제거합니다. 50 ㎍ / ml의 최종 농도로 초순수 인간 피브로넥틴 단백질을 녹인다. 피브로넥틴 용액 25 μL에 해당하는 각각의 피부를 커버. 배양기에서 30 분 동안 젤을 인큐베이션 (37 ℃, 5 % CO 2).
- 한편, 10 ㎖ KGM-2를 재현 탁 및 HEK KGM-2 + 5 %의 FCS 준비로 1 × 106 세포 / ml의 세포 농도를 설정한다. 각 겔에 씨앗 1 × 10 5 HEK. 인큐베이터에서 45 분 (37 ° C, 5 % CO 2) 세포가 준수 할 수 있도록 젤을 품어.
- 인큐베이터에서 KGM-2 + 준비 5 % FCS와 문화를 (37 ° C, 5 % CO 2)와 젤을 담그지.
전체 두께 피부 등가물 3. 문화 (FTSE)
- 6~7일에 대한 문화 FTSEFCS 농도 (5 %, 2 %, 0 % FCS)을 내림차순. 다음으로 낮은 FCS 농도가 2-3 일마다 매체를 변경합니다. 이를 위해, 완전히 매체를 제거하고 신선한 매체의 1.6 ml를 추가합니다.
- 7 일에서 완전히 매체를 제거합니다.
참고 : 그렇게하는 동안 피펫의 끝 FTSE 표면을 만지지 마십시오. - 모든 멸균 집게로 6 웰 플레이트의 한 우물에 삽입 놓습니다. FTSE 표면을 젖은 가지 않도록 잘 당 1.5 ml의 공수 매체를 추가합니다. 추가로 14 일 동안 2-3 일마다 중간 변경합니다.
주 : 배지의 충전 레벨은 FTSE의 메 니스 커스에 달려있다.
4. 조직 학적 분석
- 고정 및 FTSE의 파라핀 삽입
- 실온에서 2 시간 동안 조직을 신선한 24 웰 플레이트에 삽입을 전송하고 잘 1.6 ml의 각 % 파라 포름 알데히드 (4)를 추가하여 조직을 수정하고 배양, 배양 배지를 제거합니다. 주의! Paraformaldehyd이 독성, 흄 후드를 조작 할 수 있습니다. 이전조직 포함 카세트 FTSE. 물로 세척하여 남아있는 고정 제를 제거하고 상행 에탄올 농도를 사용하여 조직을 탈수.
- 중간에 수직 절단에 의한 피부 등가를 나눈다. 아래쪽 절단면과 파라핀 채워진 금속베이스 몰드의 두 조각을 놓는다. 백업으로 금형의 상단에있는 조직 카세트를 추가합니다.
- 적합한 현미경 슬라이드에 슬라이드를 장착, 3-5 μm의 조각을 잘라 straitening에 대한 40 ° C의 물을 욕조에 그들을 떠. 완전히 건조 조각.
- 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)과 면역 조직 화학 (IHC) 염색
- 장소는 랙에 슬라이드와 60 ° C에서 1 시간 동안 배양한다. 파라핀이 용융되어 있는지 확인합니다. 얼룩은 표준화 개요 염색으로 H & E와 조각을 재수.
- H & E 염색을 위해 에탄올 50 %, 4 배 탈 이온수, 1 배 헤 마톡 실린, 1X 염산-E 1X와 에탄올로 2 배, 에탄올로 3 배, 크 실롤으로 70 %를 96 %를 4 배 유리 염색 큐벳을 준비thanol (13.7 ml의 1 M 염산 광고 200 ml의 50 % 에탄올), 1X 탭 물, 1X 에오신 및 배 2- 프로판올 (100 ㎖ 탈 이온수에 1g의 에오신).
- 장소는 크 실롤의 I에서 10 분 deparaffinize과 슬라이드를 재수하는 크 실롤 II에서 10 분을 슬라이드. 딥 에탄올 50 % 에탄올 70 %와 3 배에서 3 배, 에탄올에 에탄올 96 % I, 배에 96 % II를 3 배를 슬라이드. 탈 이온수에서 슬라이드를 돌립니다. 헤 마톡 실린 염색, 염산 - 에탄올 딥 배를 구분합니다. 탈 물에 씻어. 청소법를 들어, 장소는 수돗물에 5 분을 슬라이드. 에오신 염색의 경우, 장소는 에오신에서 1 분 슬라이드 탈 이온수에 나중에 씻으십시오. 탈수 법, 딥 슬라이드 에탄올 96 % 에탄올에 70 %, 2 × 2 배 및 2- 프로판올 II에서 5 분 동안 2- 프로판올 I에서 5 분 동안 놓으 크 실롤에서 5 분 I 및 크 실롤 II에서 5 분. H & E 염색 한 후, 세포 핵은 빨간색으로 염색 블루, 세포질과 세포 외 기질에 염색.
- 항원 검색을 위해, 자일 렌으로 파라핀을 제거하고 염색에 대한 슬라이스 재수. 장소 조각증기 밥솥에 미리 가열 된 10 mM에서 20 분 구연산 완충액 (pH 6)에 대한 탈 파라핀과 재수 조각을 요리하고.
- 액체 구충제 슬라이드 마커 펜 또는 다이아몬드 스타일러스 세척 버퍼에 넣어 슬라이드 (PBS 버퍼 + 0.5 % Polysorbat 20)과 원 조각.
- 수분 챔버에서 슬라이드를 놓습니다. 각 슬라이스에 100 ㎕의 3 % 과산화수소 용액을 첨가하여, 내인성 퍼 옥시 다제를 차단. 주의! 피부와 눈에 접촉 한 경우, 대단히 유해 함. 개인 보호 장비를 처리합니다. 워시는 세탁 버퍼에 슬라이드.
- 차 항체를 적용하고 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 세척은 세척 버퍼로 3 회 슬라이드. 여기부터, 샘플은 어둠 속에서 유지되어야한다.
- 결합 특이 항원 - 항체의 검출을 위해 비오틴 - 스트렙 타비 딘 탐지 시스템을 사용합니다.
- 1 분 동안 헤 마톡 실린 핵을 Counterstain과. 탈수 및 슬라이드를 탑재합니다.
- 역 현미경을 사용하여 이미지 샘플.
- 70 % 에탄올 및 자외선과 작업 영역을 소독하여 AWD를 준비한다. 원하는 크기의 드릴 헤드를 확인합니다 (예를 들어, 1mm)가 부착되어있다.
- 멸균 집게를 사용하여 멸균 샘플 캐리어 플레이트의 지정된 영역으로 피부 등가물을 놓습니다. 드릴링 헤드 아래의 소켓에 샘플 캐리어 플레이트를 놓습니다.
- 스핀 속도 : 다음과 같이 상처 매개 변수를 설정하는 제어 소프트웨어를 사용하여 15,000 RPM을; 침투 : 1.5 mm; 추진 : 100 Hz에서. 이들 파라미터는 개별적으로 각각의 샘플 유형에 대해 정의 될 필요가있다. 전송 AWD에 매개 변수 부상을 입었습니다.
- 절차를 상처 시작합니다. 소켓에서 샘플 캐리어 플레이트를 제거합니다. 전송 멸균 집게를 사용하여 배양에 사용되는 인서트로 다시 FTSE 부상.
- 중생의 조사를 위해 인큐베이터에 상처 FTSE의 문화 (37 ° C, 5 % CO 2)를 진행합니다. 알대체적으로, 언제든지 조직 학적 분석을위한 모델을 사용합니다.
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Representative Results
고립 된 HDF와 HEK는 형태와 일반적인 마커의 발현 모두 다르다. HEK의 형태가 볼일 형태에 의해 설명 될 수있는 반면 HDF는 전형적인 스핀들 형상의 형태를 보였다. 세포 FTSE 위해 사용하기 전에 면역 조직 화학 염색 (도 1)을 특징으로 하였다. HDF는 멘틴 (그림 1A), 섬유 아 세포 마커에 대한 긍정적이다. 차 HEK 매우 초기 분화 단백질 아세포-14 (그림 1B)하지만 거의없는 늦은 각질 세포의 분화 단백질 아세포-10 (그림 1C)을 표현한다.
초대 배양에 이어, 우리는 세포 배양 플라스크에서 세포를 분리하고 FTSE의 생성을 위해 그들을 사용. FTSE는 공기 - 액체 인터페이스 (그림 2B)에서 14 일 배양 한 다음 submers에서 칠일 매체 조건 (그림 2A)에 대한 배양 하였다. 이 과정에서, F크게 TSE 계약. 21 일 이내 HEK (그림 2C-E) 확산된다. 모델의 표면이 공기와 증가 칼슘 농도에 의해 노출되도록 방식으로 중간 레벨을 변경하여 HEK 다른 분화 상태에서 케 라티노 사이트의 몇몇 중요한 세포의 층으로 구성되는 다세포 표피로 분화하도록 자극 된 그리고 각질층 (그림 2E).
원시 인간의 피부와 FTSE (그림 2E)의 헤 마톡 및 에오신 염색을 비교 (그림 2 층)가이 분명하게 피부의 FTSE 모방 조직 학적 구조가. 이것은 또한 면역 조직 화학 염색과 (그림 3)에 의해 설명 될 수있다. 콜라겐 I 하이드로 겔의 HDF는 멘틴에 대한 일차 항체 (그림 3A, E)으로 염색 할 수있다. 각질 세포 아세포-14의 positiv 이루어지는 표피층을 형성E 세포 (도 3b, F)과 후반 아세포 분화 마커-10는 상기 문헌-기저 층 (도 3c, G)로 표현된다. 또한, 각질층은 필라 그린 (도 3d, H)에 대한 긍정적이다.
이십일일 배양 기간 후, AWD는 FTSE 피부에 상처를 생성하는 데 사용 하였다. 도 4a에 도시 된 바와 같이, AWD은 멸균 조건을 보장하는 폐쇄 박스 시스템으로 구성된다. 도 4b에서, 상처 공정의 개략도 설명된다. FTSE는 샘플 캐리어 플레이트에 고정되어 있습니다. 그러한 속도와 드릴 헤드 (도 4d)의 회전 수를 낮추는 등의 파라미터의 설정을 포함하는 전체 상처 프로세스뿐만 아니라, 침투 깊이가 제어 컴퓨터가 지원된다. 부상 절차는 전면 창을 통해 상처 또는 모든 단계 동안에 기록 고해상도 카메라로 광학적으로 모니터링 할 수있다 절차. 크기, 형상 및 상처 상해의 깊이 (도 4C)을 개별적으로 조정할 수있다.
초기 분화 케라틴 섬유 아세포-14 (B)과 후반 차별화 섬유 아세포 그림 1. 전체 두께 피부 등가물의 건설에 사용되는 세포의 특성. 멘틴 (A)에 대한 기본 인간 피부 섬유 아 세포의 면역 조직 화학 염색과 표피의 각질 형성 세포의 -10 (C). 긍정적 인 염색 갈색 색상으로 표시됩니다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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도 배양 조건 전층 피부 등가물의 성숙 2. 변화. 전층 피부의 육안 이미지 submers 조건 (A) 및 공기 - 액체 계면 (B)에서 십사일 하에서 7 일간 배양 등가물. 다양한 발달 단계에있는 전층 피부 등가물의 헤 & 에오신 염색의 비교 : 공기 - 액체 계면에서 칠일 (C), 십사일 (7 일 공기 - 액체 계면, D AT) 및 이십일일 (후 14 일에, E). 원시 인간의 피부 (F)의 헤 마톡 및 에오신 염색. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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전체 두께 피부 등가물의 그림 3. 특성 전체 두께 피부 등가물의 면역 조직 화학 염색의 비교. (A - D) 및 기본 인간의 피부 - 멘틴에 대한 (E H) (A, E), 아세포-14 (B, F), 아세포-10 (C, G)와 필라 그린 (D, H). 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
전층 피부 등가물에 제어 상처 그림 4. 자동 부상 장치. 자동 상처 장치 (AWD)은 멸균 공조를 제공합니다상처 제어 절차 (A) 중 NS. 첨부 된 컴퓨터 (CPU)가 AWD를 제어한다. 전층 피부 등가물 (ftSEs)가 샘플 캐리어 플레이트 (SCP)에 배치되어, 샘플 형태의 편차는 상처 절차를 트리거 배리어 광 (LB)에 의해 등화된다. 상처 모양이 사용 드릴링 헤드 (DH)에 따라 달라집니다. 1mm 직경은 2mm 내지 (C, 상향 영상) (C, 저급 화상) 범위. 상처 절차를 모니터 및 문서 품질 관리 (D)에 대해 기록 할 수있다. 헤 마톡 실린 및 에오신은 1mm 드릴링 헤드 (E)를 사용하는 자동화 된 장치가 상처 부상 전층 피부 상당 단면 스테인드. 모든 스케일 바는 2mm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
시험 관내 세포에서 세포가 보통 플라스틱 표면에 부착하는 이차원 세포 배양 물에서 확장된다. 그러나 이러한 배양 조건은 세포가 생체 내에서 성장하는 생리 학적 입체 조건을 반영하지 않습니다. 입체 조건에서 세포는 자연 세포 - 세포 및 세포 - 매트릭스 첨부 파일을 형성 할 수 및 3 차원으로 이동한다. 세포 이동 및 행렬 생성은 상처 치유의 핵심 요소로서, 특히 생체 내 상황 닮은 피부 상처 치유에서 의미있는 데이터를 생성하기 위해 요동한다.
인간 차 세포로 구성되어 우리가 개발 FTSE 이러한 조건을 모방하고 피부 및 피부의 표피층을 모두 반영하기 위하여. 공기 - 액체 계면에서 배양 2 주 동안 HEK 상이한 분화 단계 및 각질층에서 각질 세포의 여러 층으로 구성 표피를 형성한다. Furthermore, 진피층이 하이드로 겔은 I 콜라겐에 내장 HDF, 구성된다. 배양 시간 동안, HDF는 모델 (도 2B)의 상당한 수축을 초래 진피 성분을 개조.
재현 및 표준화 상처를 준비하기 위해, 우리는 AWD를 개발했다. 컴퓨터 제어 시스템을 정의하고 정확한 피부 손상 (그림 4)을 설정할 수 있습니다. 부상의 의도 연구, 깊이, 형상 및 크기에 따라서는 적응 될 수있다. 그러나, AWD와 FTSE의 형태의 기술 사양으로 인해, 그것은 100 μm의 재현성 최소한의 침투를 설정하는 것이 좋습니다. AWD는 폐쇄 상자 시스템에서 무균 조건에서 작동하고 모든 구성 요소가 고압 증기 멸균, 소독 용액 또는 자외선에 의해 살균 할 수있다. 절차 부상에 대비 한 샘플은 샘플 캐리어 플레이트로 전달 될 필요가있다. 이 판을 용이하게샘플의 정확한 위치. 또한 샘플 및 샘플 캐리어 플레이트의 밀착성 상처 절차 동안 제자리에 샘플을 유지하기에 충분하다. 상처 절차 자체는 전면 창을 통해 또는 근접 위치에서 모든 단계를 기록하는 고해상도 카메라에 의해 광학적으로 모니터링 할 수 있습니다. 상처를 생성하는 조직을 발굴하기 위해 레이저를 사용하는 다른 시스템과 달리, AWD는 회전 드릴을 사용한다. 따라서, 더 열은 기계적인 상처를 조사 할 중요한 임시 수입하는 절차 동안 적용되지 않습니다. 또한 드릴링 헤드의 구체적인 형상은 상처 채널로부터 물질 제거를 보장한다. 부상 절차 위에서 언급 한 경험적으로 결정 상처 매개 변수를 사용하는 것은 FTSE 또는 기본 피부 샘플을 하나의 특정 생리 학적 특성에 맞게 조절할 수 있습니다. 이 방법은 표피 층의 박리와 같은 의도하지 않은 임의의 바람직하지 않은 부작용을 최소화 할 수 있고, 재현성이 상처 성공률로 수행90 %.
이 연구 개발 FTSE 부분적 정확하게 피부의 생체 내 상황을 모방하고, 따라서 상처 치료 연구를위한 모델로서 사용될 수 있음을 보여준다. 이러한 혈관, 혈액 응고와 면역계의 효과와 같은 상처 치유 과정의 중요한 측면은 모델이 결여되어 있지만, 표피 중간 엽 세포 - 매트릭스 상호 작용은 삼차원 고도로 표준화 된 환경에서 효과적으로 요약된다. 또, AWD 피부 상처 모델에서 표준화를 생성 할 수 있음을 보여준다. 조합 기술 모두는 상처 치유 및 회복 과정을 지원 물질 및 약물의 효과를 조사하기 위하여 사용될 수있다. 더 자세히 생체 내 상황을 모방하기 위해, FTSE는 멜라닌 피부 종양 세포 또는 미세 혈관 내피 세포와 같은 다른 세포에 의해 확장 될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin EDTA (1:250) 0.5% in DPBS | PAA | L11-003 | 0.05% |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Collagen (6 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Produced in house | ||
| Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml) | Life Technologies | 33016-015 | |
| Inserts | Nunc | 140627 | |
| 6 well plate | Nunc | 140685 | |
| 24 well plate | Nunc | 142485 | |
| Microscope slides | R. Langenbrinck | 03-0070 | |
| Fibroblasts culturing (500 ml): | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-092 | 89% (445 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 10% (50 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Keratinozyten culture medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | 89% (445 ml) |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Gel neutralization solution (250 ml): | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine | PAA | G0001,3010 | 93% (232.5 ml) |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-1g | 1% (2.5 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 3% (7.5 ml) |
| HEPES | Sigma | H3375-1kg | 3% (7.5 ml) |
| Skin model submers medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Fetal calf serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 5%-2% (25 ml-10 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Skin model air-liquid interface medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack | Promocell | C-39011 | adding only supplements: insulin, hydrocortisone, epinephrine, transferrin, CaCl2 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| CaCl2 (300 mM) | Sigma | C7902-500g | 0.62% (3.1 ml) |
| Histology: | |||
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| CK14 antibody | Sigma | HPA023040-100µl | |
| CK10 antibody | Dako | M7002 | |
| Filaggrin antibody | Abcam | ab81468 | |
| H&E staining: | |||
| Mayer´s Haemalaun | AppliChem | A0884,2500 | |
| Xylol | Sigma Aldrich | 296325-4X2L | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-4X2.5L | |
| HCl | Sigma Aldrich | H1758-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | E4009-5G | |
| 2-Propanolol | Sigma Aldrich | I9516-500ML | |
| Mounting Medium | Sigma Aldrich | M1289-10ML | |
References
- Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. The skin: an indispensable barrier. Exp Dermatol. 17, 1063-1072 (2008).
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