Introduction
A pele é o maior órgão do corpo. Ela cria uma barreira entre o ambiente externo e os órgãos internos. Além disso, a pele protege o corpo contra a perda de fluido, as influências ambientais, infecções e lesões e ajuda a regular a temperatura do corpo 1. Devido à sua localização exposta, a pele é frequentemente afetada pelo trauma mecânico, térmico ou químico. Embora a pele é geralmente capaz de auto-reparo, múltiplos fatores locais, como infecção, oxigenação e suficiência venosa pode levar a cicatrização de feridas prejudicada. Cicatrização de feridas também pode ser interferido por fatores sistêmicos como a obesidade, alcoolismo, tabagismo, medicação, nutrição e doenças como a diabetes. 2
O processo de cicatrização de feridas pode ser dividida em três fases: (i) a fase inflamatória, (ii) o proliferativas e o (iii) em fase de remodelação. Após lesão da pele, um sinal complexo inicia-cascata, levando ao encerramento da ferida. 3Após um traumatismo, a ferida é sangramento e um coágulo sanguíneo é formado. Os fibroblastos passar para o coágulo de sangue e substituí-lo por um novo tecido que seja posteriormente remodelada ao longo dos anos.
O entendimento atual da reparação cutânea processos biológicos subjacente é limitado. Pequenos modelos animais e de suínos têm sido usados para estudar a cicatrização de feridas. No entanto, estes resultados não podem ser transferidos diretamente para os seres humanos devido a diferenças específicas de cada espécie. Em adição a estes modelos in vivo, alguns aspectos da cicatrização de feridas pode ser estudado através da simulação de uma situação de ferida através de riscar em culturas de monocamada in vitro com base em linhas celulares imortalizadas ou células primárias. 4 Estes modelos riscar são altamente padronizados, mas não suficientemente reflectir o fisiologia complexo in vivo. Além disso 5 modelos bidimensionais, tridimensionais equivalentes de pele humana foram desenvolvidas para a investigação dermatológica. A parte dérmica desses modelos são generated utilizando diversos suportes, incluindo derme decelularizados, 6 hidrogéis colágeno, 7,8 glicosaminoglicanos 9 ou materiais sintéticos. 10 Empregando estas equivalentes de pele, o papel das interações epitélio-mesenquimal 11, a re-epitelização, o crosstalk celular entre fibroblastos e queratinócitos e a influência de diferentes factores de crescimento pode ser estudada. Além disso, estes modelos são úteis para obter novos conhecimentos sobre como fibroblastos migram para a área ferida e como fatores quimiotáticos influenciar a regeneração dos tecidos 12.
Não só geração do próprio modelo a cicatrização de feridas é um desafio, mas também para estabelecer uma ferida altamente padronizada em um modelo é problemático. As técnicas comuns para criar as feridas são testes de risco, 13 queimaduras, 14 de fita de abrasão, 15 lesões térmicas, 16 blisters de sucção, nitrogênio líquido 17, 18, 19 lasers 18 meshers 6 e punções. 20 A maioria desses métodos têm as mesmas armadilhas. Lesões implementadas manualmente são difíceis de padronizar e se reproduzir entre vários testes. O tamanho, forma e profundidade da ferida variar entre estudos e, assim, prejudicar a qualidade dos dados de pesquisa. O uso do laser para ferir a pele pode ser definido de forma relativamente fácil padronizado, mas conduz a uma situação que imita queimaduras. O calor aplicado por laser pode provocar a desnaturação da proteína, agregação de plaquetas constrição ou navios, o que pode levar ao tecido necrótico.
Em uma abordagem alternativa, foi desenvolvido um dispositivo ferimento automatizado (AWD), que nos permite gerar feridas cutâneas definidas e precisas em condições estéreis. Parâmetros ferindo, como profundidade e velocidade de penetração, bem como as revoluções da cabeça de perfuração pode ser regulada. Neste estudo, nós combinamos o AWD com em casa desenvolvidos espessura completa equivalentes de pele (ftSE), que são comparáveis a um protocolo publicado por Gangatirkar et al. 8 a camada dérmica da pele equivalente é composta por fibroblastos dérmicos humanos (HDF), que são incorporados em colagénio I um hidrogel. Na camada dérmica, os queratinócitos epidérmicos humanos (HEK) são semeadas. Dentro de duas semanas na interface ar-líquido da HEK construir-se uma epiderme composta de várias camadas de células vitais e um estrato córneo. Para além da geração de este modelo, este estudo mostra a utilização do AWD para criar feridas definidos e precisos em FTSE.
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Protocol
NOTA: O protocolo é concebido para a produção de 24 equivalentes de pele de espessura completa. Human fibroblastos dérmicos e queratinócitos epidérmicos foram isolados a partir de biópsias de pele de acordo com um protocolo publicado anteriormente. 21,22 Foi obtido consentimento informado de antemão e que o estudo foi aprovado pelo comitê de ética institucional em pesquisa humana dos Julius-Maximilians-Universidade Würzburg (votar 182 / 10).
1. Produção de componente dérmico
- Dissolve-se o colagénio com ácido acético a 0,1% para uma concentração final de 6 mg / ml. Para a solução de neutralização do gel, misturar 232,5 mL 2x DMEM, 7,5 ml de soro fetal de vitelo, 7,5 ml de 3 M de HEPES, 2,5 ml de sulfato de condroitina (5 mg / ml). Mantenha solução neutralização gel e solução de colágeno no gelo. Calcule 500 mL de gel por insert / pele equivalente.
NOTA: Como a solução de neutralização gel será misturado com duas partes de solução de colágeno prepare dupla quantidade de colágeno. - Coloque 24 inserções em uma placa de 24 poços.
- Ressuspender fibroblastos dérmicos humanos (HDF) em 10 ml de DMEM, centrifuga-se durante 5 min a 270 xg e contar as células. Extrai-se a quantidade necessária de HDF (5 x 10 4 culas por 500 ul de gel de colagénio) e centrifuga-se as células durante 5 min a 270 x g.
- Remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o HDF em 4 ml de solução arrefecida de neutralização de gel, sem a produção de bolhas de ar. A partir deste passo certifique-se de trabalhar tão rápido quanto possível para evitar a solidificação prematura de géis de colagénio.
- Ressuspender a solução com 8 ml de solução de colagénio.
- Leve o colágeno-cell-mistura com um de vários passos-pipeta e preencher rapidamente 500 mL de mistura em cada inserção. Incubar os géis durante 20 minutos numa incubadora (37 ° C, 5% CO 2) cristalizar os géis.
- Submergir os géis em 2 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) + 10% de soro fetal de vitelo (FCS) por poçoe incubar-lo durante 24 horas numa incubadora (37 ° C, 5% CO 2).
2. A adição de queratinócitos epidérmicos humanos (HEK)
- Remova o meio após 24 horas. Dissolver proteína fibronectina humana com água ultrapura até uma concentração final de 50 ug / ml. Cobrir cada equivalente dérmico com 25 ml de solução de fibronectina. Incubar os géis durante 30 minutos numa incubadora (37 ° C, 5% CO 2).
- Entretanto, ressuspender o hek em 10 ml de KGM-2 e definir a concentração de células para 1 x 10 6 células / ml com KGM-2 pronto + 5% FCS. Semente de 1 x 10 5 células HEK em cada gel. Incubar géis durante 45 minutos na incubadora (37 ° C, 5% CO 2) para permitir que as células a aderirem.
- Submerse os géis com KGM-2 pronto + FCS a 5% e cultura los na incubadora (37 ° C, 5% CO 2).
3. Cultura do pleno Equivalentes da espessura da pele (FTSE)
- FTSE Cultura para 6-7 diasem concentração decrescente de FCS (5%, 2%, e 0% de FCS). Mudar a forma a cada 2-3 dias com a próxima menor concentração FCS. Para isso, remover completamente o meio e adicionar 1,6 ml de meio fresco.
- No dia 7, remova o meio completamente.
NOTA: Não toque na superfície do FTSE com a ponta da pipeta ao fazê-lo. - Coloque todos os inserir em um poço de uma placa de 6 bem com uma pinça estéril. Adicionar 1,5 ml de meio de transporte aéreo por poço, certifique-se para não molhar a superfície FTSE. Mudar meio cada 2-3 dias durante mais 14 dias.
NOTA: O nível de enchimento do meio é até o menisco do FTSE.
4. Análise Histológica
- Fixação e parafina-incorporação do FTSE
- Remover o meio de cultura, transferir insertos em placas de 24 poços frescas e fixar tecidos por adição de 1,6 ml de paraformaldeído a 4% a cada poço e incuba-se os tecidos durante 2 h à TA. Cuidado! Paraformaldehyd é tóxico, manipular sob coifa. TransferênciaO FTSE a uma cassete a incorporação de tecidos. Remover fixador restante por lavagem com água e desidratar o tecido usando concentrações de etanol crescente.
- Divida a pele equivalente por um corte vertical no meio. Coloque as duas peças em um molde de base de metal cheio de parafina com superfícies de corte para baixo. Adicionar a cassete de tecido na parte superior do molde como um suporte.
- Corte fatias de 3-5 mm e flutuar-los em um banho de 40 ° C água para straitening, montar os slides em lâminas de microscópio adequados. Fatias secarem completamente.
- Hematoxilina e Eosina (H & E) e imuno-histoquímica (IHQ) coloração
- Colocar as lâminas em prateleira e incubar durante 1 hora a 60 ° C. Certifique-se de que a parafina é derretida. Stain fatias com H & E reidratadas como uma coloração visão geral padronizado.
- Para a coloração com H & E preparar 4x cuvetes de vidro para coloração com xilol, 3x com etanol a 96%, 2x com etanol a 70%, 1x com etanol a 50%, 4x de água desionizada, 1x hematoxilina, 1x HCl-pThanol (13,7 ml de 1 M de HCl ad 200 ml de etanol a 50%), 1x separador de água, 1x eosina (1 g eosina em 100 ml de água desionizada) e 2 x 2-propanol.
- Colocar as lâminas 10 min em xilol I e 10 min em xilol II para Desparafinar e reidratar slides. Dip desliza 3x em etanol a 96% I, 3x em etanol a 96% II, 3x com etanol a 70% e 3 x em 50% de etanol. Gire as lâminas em água deionizada. Para diferenciar corante hematoxilina, 2x mergulho na HCl-etanol. Enxágüe em água deionizada. Para blueing, lugar desliza 5 min no separador de água. Para eosina, lugar desliza 1 min em eosina e lavar depois em água deionizada. Para a desidratação, dip slides 2x em etanol a 70%, 2x em etanol a 96% e colocá-las durante 5 min em 2-propanol I, durante 5 min em 2-propanol II, 5 min em xilol I e 5 min em xilol II. Depois de H & E coloração, núcleos de células são coradas em azul, citoplasma e matriz extracelular estão manchadas de vermelho.
- Para a recuperação antigênica, remover a parafina com xileno e reidratar fatias para a coloração. Coloque as fatiasna panela a vapor e cozinhe fatias desparafinizadas e reidratadas por 20 min em pré-aquecido 10 mM tampão citrato (pH 6).
- Colocar as lâminas em tampão de lavagem (PBS tampão + 0,5% polissorbato 20) e fatias de círculo com um repelente de slides caneta stylus líquido ou diamante.
- Colocar as lâminas em câmara úmida. O bloqueio da peroxidase endógena, por adição de 100 ul solução de peróxido de hidrogénio a 3% para cada fatia. Cuidado! Muito perigoso em caso de pele e dos olhos contato. Manusear com equipamentos de proteção individual. Lave as lâminas em tampão de lavagem.
- Aplicar o anticorpo primário e incubar durante 1 h à TA. Lave as lâminas três vezes com tampão de lavagem. Daqui em diante, as amostras devem ser mantidas no escuro.
- Use sistema de detecção biotina-estreptavidina para a detecção da ligação antigénio-anticorpo específico.
- Núcleos contracorante com Hematoxilina de 1 min. Desidratar e montar slides.
- Amostras de imagem usando um microscópio invertido.
- Prepare o AWD por desinfecção da área de trabalho com etanol a 70% e luz ultravioleta. Certifique-se que a cabeça de perfuração do tamanho desejado (por exemplo, 1 mm), está ligado.
- Coloque equivalentes de pele em áreas designadas da placa de suporte da amostra autoclavado usando uma pinça estéril. Coloque a placa de suporte à tomada de amostra abaixo da cabeça de perfuração.
- Use o software de controle para definir os parâmetros ferindo da seguinte forma: a velocidade de rotação: 15.000 rpm; penetração: 1,5 milímetros; propulsão: 100 Hz. Esses parâmetros devem ser definidos para cada tipo de amostra individualmente. Transferência ferindo parâmetros para o AWD.
- Comece ferindo procedimento. Retire a placa transportadora amostra da tomada. Transferência feridos FTSE volta em pastilhas usadas para a cultura usando uma pinça estéril.
- Continuar com a cultura de FTSE feridos na incubadora (37 ° C, 5% CO 2) para a investigação de regeneração. Alternatively, usar os modelos para a análise histológica em qualquer momento.
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Representative Results
O HDF e hek isolado diferem tanto na morfologia e na expressão de marcadores típicos. O HDF mostraram morfologia típica forma de fuso, ao passo que a morfologia de hek pode ser descrito por uma morfologia de paralelepípedos. As células foram caracterizadas por coloração imuno-histoquímica (Figura 1) antes de utilizá-los para FTSE. O HDF são positivas para a vimentina (Figura 1A), um marcador para os fibroblastos. Primário HEK altamente expressar proteína diferenciação precoce citoqueratina-14 (Figura 1B) mas quase nenhuma proteína diferenciação de queratinócitos tarde citoqueratina-10 (Figura 1C).
Seguindo cultura primária, que independente das células aos balões de cultura de células e os usou para a geração de FTSE. O FTSE foram cultivadas durante 7 dias sob condições de meio de submers (Figura 2A), seguido por uma cultura de 14 dias na interface ar-líquido (Figura 2B). Durante este processo, o fcontrato TSE significativamente. No prazo de 21 dias, a Hek estão a proliferar (figura 2C-E). Ao alterar o nível médio, de tal forma que a superfície dos modelos é exposta ao ar e através do aumento da concentração de cálcio, a hek são estimuladas a diferenciarem-se em uma epiderme multi-celulares que é composto por várias camadas de células vitais dos queratinócitos em diferentes estados de diferenciação e um estrato córneo (Figura 2E).
Comparando-se a coloração das FTSE (Figura 2E) Haematoxylin & Eosina com a pele humana nativa (Figura 2F) torna-se óbvio que imita FTSE arquitetura histológica da pele. Isto pode ser adicionalmente demonstrada por colorações imunohistoquímicas (Figura 3). O HDF em que o hidrogel de colagénio podem ser coradas com os anticorpos primários contra vimentina (Figura 3A, E). Os queratinócitos formar uma camada epidérmica composto de citoqueratina-14 positive células (Figura 3B, F) e a diferenciação marcador tardio citoqueratina-10 é expresso nas camadas supra-basais (Figura 3C, G). Além disso, o estrato córneo é positivo para filagrina (Figura 3D, H).
Após período de cultura de 21 dias, o AWD foi utilizado para gerar feridas cutâneas no FTSE. Como mostrado na Figura 4A, o AWD é construído como um sistema de caixa fechada para garantir condições estéreis. Na Figura 4B, um desenho esquemático do processo de ferimentos é demonstrada. O FTSE são fixadas numa placa de suporte da amostra. O processo inteiro ferimento, incluindo a configuração de parâmetros tais como a velocidade e rotações da cabeça de perfuração (Figura 4D) a redução, bem como a profundidade de penetração é controlada por computador assistido. O procedimento ferindo pode ser monitorado opticamente através de uma janela da frente ou por uma câmera de alta resolução que registra todas as etapas durante o ferimento procedimento. O tamanho, forma e profundidade da lesão da ferida pode ser ajustada individualmente (Figura 4C).
Figura 1. Caracterização de células utilizadas para a construção de equivalentes de pele de espessura completa. Coloração imuno-histoquímica de fibroblastos dérmicos humanos primários para vimentina (A) e de queratinócitos epidérmicos para a diferenciação precoce de filamentos de queratina citoqueratina-14 (B) e o filamento de citoqueratina diferenciação tardia -10 (C). A coloração positiva é mostrado pela cor marrom. Barras de escala indicam 100 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 2. As alterações de condições de cultura e a maturação de toda a espessura da pele equivalentes. Imagens macroscópicas da pele de espessura total equivalentes cultivadas durante 7 dias sob condições de submers (A) e 14 dias na interface ar-líquido (B). Comparação de Hematoxilina e Eosina coloração de espessura completa equivalentes de pele em diferentes estágios de desenvolvimento: Após 7 dias (C), 14 dias (7 dias na interface ar-líquido, D) e 21 dias (14 dias na interface ar-líquido, E). Hematoxilina e Eosina coloração da pele humana nativa (F). Barras de escala indicam 100 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3. Caracterização dos equivalentes de pele de espessura completa Comparação de coloração imuno-histoquímica de espessura completa equivalentes de pele. (A - D) e pele humana nativa (E - H) para vimentina (A, E), citoqueratina-14 (B, F), citoqueratina-10 (C, G) e filagrina (D, H). Barras de escala indicam 100 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Dispositivo automático Ferimento por ferimento controlada em equivalentes de espessura total da pele. O dispositivo ferimento automatizado (AWD) fornece conditio estérilns durante o procedimento de ferimento controlada (A). Um computador conectado (CPU) controla o AWD. Os equivalentes de pele de espessura completa (ESCJ) são colocados sobre a placa de suporte de amostras (SCP), desvios na morfologia da amostra são equalizados por uma barreira de luz (LB), o que desencadeia o processo de ferimento. A forma ferida depende da cabeça de perfuração usado (DH). O diâmetro varia de 1 mm (C, imagem superior) a 2 mm (C, imagem inferior). O procedimento de ferimento é monitorado e podem ser gravados para documentação e de gestão da qualidade (D). Hematoxilina e Eosina coradas secção transversal de um equivalente de pele de espessura completa feridos com o ferimento dispositivo automatizado usando uma cabeça de perfuração de 1 mm (E). Todas as barras de escala indicam dois milímetros. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Em células in vitro são normalmente expandido em culturas de células de duas dimensões, em que as células aderem a superfícies de plástico. No entanto, estas condições de cultura não reflectem as condições tridimensionais fisiológicas em que as células crescem in vivo. Sob condições tridimensionais, as células podem formar ligações célula-célula e célula-matriz naturais e migrar em três dimensões. Especialmente na cura de feridas cutâneas a semelhança da situação in vivo é essencial para gerar dados significativos, como a migração celular e geração de matriz são elementos-chave da cicatrização.
A fim de simular estas condições nós desenvolvidos FTSE que são compostos de células humanas primárias e reflectir tanto a via cutânea e a camada epidérmica da pele. Durante duas semanas de cultura na interface ar-líquido, o hek formar uma epiderme composta de várias camadas de queratinócitos em diferentes fases de diferenciação e um estrato córneo. Furthermore, a camada dérmica é composta de HDF, que são incorporados em colagénio I um hidrogel. Durante o tempo de cultura, o HDF remodelar o componente dérmico, o que resulta num encolhimento significativo dos modelos (Figura 2B).
Para preparar feridas reprodutíveis e padronizados, desenvolvemos um AWD. A máquina controlada por computador pode definir lesões cutâneas bem definidas e precisas (Figura 4). Dependendo da investigação destinada, a profundidade, a forma e o tamanho da lesão pode ser adaptado. No entanto, devido às especificações técnicas do AWD e a morfologia do FTSE, recomenda-se para definir uma penetração mínima de 100 um reprodutibilidade. O AWD está operando em condições estéreis em um sistema de caixa fechada e todos os componentes podem ser esterilizados em autoclave, as soluções de desinfecção ou luz ultravioleta. Na preparação para o procedimento ferindo as amostras têm de ser transferidos para uma placa de suporte da amostra. Esta placa facilita umaposição exacta das amostras. Além disso, a aderência entre a amostra e a placa de suporte da amostra é suficiente para manter as amostras no lugar durante o processo de ferimento. O próprio processo de ferimento pode ser monitorado opticamente através de uma janela da frente ou por uma câmera de alta resolução que grava todos os passos de uma posição de aproximação. Ao contrário de outros sistemas que usam lasers para escavar tecido para gerar uma ferida, o AWD emprega uma broca rotativa. Assim, sem o calor é aplicado durante o procedimento, que é um pré-requisito vital para investigar feridas mecânicas. Além disso, a forma específica da cabeça de perfuração garante uma remoção de material a partir do canal de ferida. Usando parâmetros ferindo empiricamente determinados atrás mencionadas, o procedimento ferindo pode ser ajustada para satisfazer as propriedades fisiológicas dos animais ou a FTSE ou amostras de pele nativa. Desta forma, quaisquer efeitos secundários indesejáveis, como desprendimento não intencional das camadas epidérmicas podem ser minimizados e o ferimento reprodutível realizada com uma taxa de sucessode 90%.
Este estudo demonstra que o FTSE desenvolvidos mimetizar parcialmente a situação in vivo de pele com precisão e, portanto, pode ser utilizado como um modelo para estudos de cicatrização de feridas. Apesar de alguns aspectos importantes do processo de cicatrização da ferida, tais como o efeito da vasculatura, o coágulo de sangue e o sistema imune está deficiente no modelo, a interacção epidérmico-mesenquimal e célula-matriz, se condensa num ambiente altamente padronizado tridimensional. Além disso, podemos mostrar que o AWD gera feridas padronizadas em modelos de pele. Em combinação, ambas as tecnologias podem ser utilizadas para investigar a cicatrização de feridas e o efeito de substâncias e fármacos que suportam o processo de cura. A fim de simular a situação in vivo mais de perto, o FTSE pode ser estendido por outras células, tais como melanócitos, células tumorais ou células endoteliais da pele micro-vascular.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin EDTA (1:250) 0.5% in DPBS | PAA | L11-003 | 0.05% |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Collagen (6 mg/ml in 0.1% acetic acid) | Produced in house | ||
| Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml) | Life Technologies | 33016-015 | |
| Inserts | Nunc | 140627 | |
| 6 well plate | Nunc | 140685 | |
| 24 well plate | Nunc | 142485 | |
| Microscope slides | R. Langenbrinck | 03-0070 | |
| Fibroblasts culturing (500 ml): | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-092 | 89% (445 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 10% (50 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Keratinozyten culture medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | 89% (445 ml) |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Gel neutralization solution (250 ml): | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine | PAA | G0001,3010 | 93% (232.5 ml) |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-1g | 1% (2.5 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 3% (7.5 ml) |
| HEPES | Sigma | H3375-1kg | 3% (7.5 ml) |
| Skin model submers medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Fetal calf serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 5%-2% (25 ml-10 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Skin model air-liquid interface medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack | Promocell | C-39011 | adding only supplements: insulin, hydrocortisone, epinephrine, transferrin, CaCl2 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| CaCl2 (300 mM) | Sigma | C7902-500g | 0.62% (3.1 ml) |
| Histology: | |||
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| CK14 antibody | Sigma | HPA023040-100µl | |
| CK10 antibody | Dako | M7002 | |
| Filaggrin antibody | Abcam | ab81468 | |
| H&E staining: | |||
| Mayer´s Haemalaun | AppliChem | A0884,2500 | |
| Xylol | Sigma Aldrich | 296325-4X2L | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-4X2.5L | |
| HCl | Sigma Aldrich | H1758-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | E4009-5G | |
| 2-Propanolol | Sigma Aldrich | I9516-500ML | |
| Mounting Medium | Sigma Aldrich | M1289-10ML | |
References
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