Introduction
Fadenpilze sind ausgezeichnete Modellsysteme zur Untersuchung von Entwicklungsprozessen. Sie bieten mehrere experimentelle Vorteile wie billige Anbau, eine hohe Zahl von Nachkommen und genetische Zugänglichkeit. Der letzte Punkt ist von besonderer Bedeutung für den Bau der Transformanten, die die Untersuchung der Bedeutung der so weit nicht charakterisierte Gene für verschiedene zelluläre Mechanismen ermöglichen. Filamentöse Pilze haben wesentlich zur Aufklärung von mehreren Elementen und Mechanismen der zellulären Qualitätskontrolle Wege wie Protease-Aktivität zum Abbau von anomalen Proteinen mitochondrialen Dynamik zum Aufrechterhalten mitochondrialen Integrität und autophagy zur Entfernung von Überschuß und / oder gestörte Zellkomponenten und zum Aufrechterhalten Zelllebensfähigkeit in Zeiten der Hungersnot 1,2,3.
Es gibt verschiedene experimentelle Techniken für das Studium der Autophagie in Fadenpilzen 2 zur Verfügung: (i) Untersuchung der Vakuolen if enthaltenen dichten phage Stellen bei Proteasen werden durch Transmissionselektronenmikroskopie 4 inhibiert, (ii) Darstellung von Autophagosomen durch Überwachen GFP-Atg8 Brennpunkte über Fluoreszenzmikroskopie 5,6 und (iii) Detektion angesäuert autophagosomalen Strukturen unter Verwendung der Fluoreszenzfarbstoff monodansyl Cadaverin 7.
Hier wird ein neues Verfahren zum Züchten von Penicillium chrysogenum zur autophagy Studien vorgestellt. Das wichtigste Element ist der "Hunger-Pad", das lediglich aus 1% Agarose in sterilisierte Leitungswasser gelöst. Zusätzliche Verbindungen (zB Stressoren, Abfänger, autophagy Modulatoren) auf die Unterlage so lange sie keine Autofluoreszenz angezeigt hinzugefügt. Das Kissen wird in Objektträgern, die einen flachen zentralen Hohlraum enthalten, entfernt. Dieses Pad in impft entweder mit einer Sporensuspension oder mit kleinen Mycelfragmente. Letzteres ist sinnvoll, wenn die Belastung von Interesse nicht sporulate effizient (zB Δ ATG1 Stämme 8). Die Objektträger werden in feuchten Kammern positioniert, um ein Austrocknen der Probe zu verhindern (diese können einfach mit leeren Pipettenspitze Boxen gebaut werden) und bei Raumtemperatur inkubiert. P. chrysogenum ist in der Lage, für ein paar Tage unter diesen Bedingungen wachsen. Autophagie kann mikroskopisch durch vakuoläre Erweiterung, die eine positive Marker für Pilz Autophagie ist zu beachten. In diesem Beitrag einem P. chrysogenum Stamm (Wisconsin 54-1255) verwendet wird, das grünes fluoreszierendes Protein, das an Peroxisomen durch ihre C-terminalen "SKL" Sequenz 9 ausgerichtet ist bildet. Daher ist es möglich, die Verschlechterung von Peroxisomen überwachen. Es ist möglich, unter Verwendung von geeigneten Lokalisierungssignale kenn auch andere Kompartimente der Zelle (zB Mitochondrien) und ihre Abbau analysieren. Obwohl Daten aus P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) wird hier dargestellt, ist es durchaus möglich,um den "Hunger-Pad 'Methode auch für andere Fadenpilze verwenden (zB Neurospora crassa, Sordaria macrospora, Aspergillus-Arten, etc.).
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Protocol
1. Herstellung von P. chrysogenum für die Hungerversuche
- Wenn der P. chrysogenum-Stamm von Interesse auf Reis ('grüne Reis ") gehalten, legen 2-3 Reiskörner mit sporenbildende Mycel in eine 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen abgedeckt. Füllen sie mit 500 ul YGG (10 g / l KCl, 20 g / l Glucose, 10 g / l Hefe-Stickstoffbase, 5 g / l K 2 HPO 4, 20 g / l Hefeextrakt).
- Das Röhrchen vortexen für 30 Sekunden, so dass Sporen aus dem Reis effizient zu lösen.
- Das Röhrchen für 1 Tag bei Raumtemperatur (zB zwischen 20 und 25 ° C).
- Bereiten Sie eine 1/50 Verdünnung dieser Sporensuspension in sterilem Leitungswasser, gut mischen.
- Wenn der P. chrysogenum-Stamm von Interesse auf einer Agarplatte (zB YGG Agarplatte) gehalten wird, übertragen kleine Stücke von dem Mycel in eine 1,5-ml-Mikroröhrchen mit 400 ul sterilem Leitungswasser und etwa 100 mg glArschperlen mit Hilfe eines sterilen Zahnstocher oder Pipettenspitze.
- Vortex das Rohr für 2 Minuten, so dass das Myzel fragmentiert. Mit den Inhalt des Röhrchens sofort.
2. Vorbereitende Arbeiten für die Kultivierung von P. chrysogenum auf Starvation Pads
- Wechseln Sie auf einer Heizplatte und setzen Sie ihn auf etwa 60 ° C.
- Man löst 2 g Agarose in 100 ml Wasser durch Kochen der Lösung in einem Mikrowellenofen zu nutzen. Darauf achten, dass diese Lösung nach dem Erhitzen völlig klar. Wenn es nicht ist, zu kochen, bis es wieder die Agarose vollständig gelöst ist. Lassen Sie die Agaroselösung abkühlen auf etwa 60 ° C vor dem Gebrauch.
- Füllen 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (2-4, abhängig von der Anzahl der Proben) mit 400 ul sterilem Leitungswasser jeweils (keine zusätzlichen Verbindungen zugesetzt) oder 400-x ul (Zugabe von x & mgr; l der Lösung der Verbindung in Schritt 2.5) und sie auf der Heizplatte für mindestens 1 min, so daß der Water innen erwärmt sich.
- Platzieren Objektträger, die einen zentralen Hohlraum für mindestens 1 min enthalten auf der Heizplatte.
- Fügen Sie 400 ul 2% igen der Lösung in der 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und kurz vortexen. Nach diesem Schritt, wenn gewünscht, fügen Sie zusätzliche Verbindungen (dh 1 uM Rapamycin). Wenn dies geschehen ist, Wirbel kurz nachdem jeder zusätzliche Substanz in das Röhrchen pipettiert. Setzen Sie die Rohre wieder auf die Heizung Tabelle vorzeitige Erstarrung zu verhindern.
HINWEIS: Das Gesamtvolumen der Mikrozentrifugenröhrchen sollten 800 ul sein.
3. Vorbereitung der Objektträger mit einem Gehalt Starvation Pads
- Pipette 140 ul der Agarose-Lösung in den Hohlraum des Objektträgers (die immer noch auf der Heizplatte befindet). Versuchen Sie zu vermeiden, die Luftblasen, wenn möglich.
- Unmittelbar danach ein Deckglas auf den Agarose-Lösung.
Hinweis: das wird in einer flachen Oberfläche führen. - Setzen Sie den MikroRahmen Rutsche auf dem Labortisch für ca. 4 min, damit das Agarose-Pad zu verfestigen.
- Entfernen Sie vorsichtig das Deckglas aus der Agarose-Pad, indem Sie sie mit Hilfe einer Daumen oder Zeigefinger (Handschuhe, um eine Verunreinigung zu vermeiden!).
- Legen Sie die Objektträger mit dem Pad in einen Nassraum, um ein Austrocknen zu verhindern. Empfehlung: Verwenden Sie eine leere Spitze-Box, die noch der Einsatz zur Aufnahme der Pipettenspitzen. Hinzufügen sterilem Wasser auf die Tabelle, so dass der Boden bedeckt. Legen Sie die Objektträger auf den Einsatz und schließen Sie die Box.
4. Impfen des Hunger-Pads mit P. chrysogenum und Inkubation
- Pipette 5 ul der Sporen 1/50 Verdünnung (wenn die Kulturen wurden für Reis angebaut) oder 5 & mgr; l der unverdünnten Lösung, die Mycel-Fragmente auf der Mitte des Hunger Pad (wenn die Kulturen wurden auf einer Agarplatte gezüchtet).
- Schließen Sie den Nassraum und wickeln Sie es in eine Plastiktüte (dieser dient alszusätzlichen Schutz vor Austrocknung der Hunger-Pads). Achten Sie darauf, das Kästchen zu viel, da sonst die Impfung Tropfen gestört werden zu bewegen.
- Bewahren Sie die Box verpackt bei RT für mindestens 20 Stunden vor der Analyse der Proben.
5. Mikroskopische Analyse der Proben
- Nach 20 h Inkubation werden die Proben bereit für die mikroskopische Analyse; legen Sie die Objektträger auf trockenen Tissue-Papier (der Boden neigt nass werden).
- Pipette eine kleine Menge Wasser (ca. 50 ul) auf die Hunger-Pad. Setzen Sie ein Deckglas auf das Pad und Squeeze-out überschüssige Wasser. Entfernen Sie das überschüssige Wasser mit einem Papiertaschentuch.
- Legen Sie die Objektträger auf die Beobachtung Tisch des Fluoreszenzmikroskops. Um einen Überblick über Myzelwachstum erhalten, verwenden Sie ein 20X Ziel. Verwenden 63X oder 100X Ziele für die Untersuchung der Lokalisation von GFP in den Hyphen. Um allmähliche Austrocknen der Probe zu verhindern nicht die Proben zu analysierenlänger als 15 Minuten, bevor sie sie wieder in den Nassraum.
- Wiederholen 5.3 in regelmäßigen Abständen (zB nach 40 h und 60 h Wachstum).
HINWEIS: Die Probe kann wieder in die feuchte Kammer gestellt werden. Es ist nicht notwendig, um das Deckglas zu entfernen, da sie sich nicht auf Myzelwachstum.
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Representative Results
Um die Nützlichkeit des Protokolls über Peroxisomen Abbau in der P. detailliert zeigen chrysogenum-Stamm Ws54-1255 (GFP-SKL) analysiert. In diesem Stamm GFP-SKL ist in der Regel in die Peroxisomen 9 importiert. Dies führt zu dem Auftreten von mehrfachen Kugelformen, wenn die Probe durch Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Wenn Autophagie auftritt, vergrößern Vakuolen. GFP-SKL wird durch Autophagie (pexophagy) in Vakuolen integriert. Aufgrund der Tatsache, dass GFP ist resistent gegen den Abbau durch Proteasen Vakuole es Etiketten diese Organellen 10. Daher sind die beiden Parameter für die Beobachtung Autophagie (pexophagy) in diesem Stamm, Vakuole Erweiterung und Lokalisierung von GFP-SKL zu Vakuolen, werden bequem durch Fluoreszenzmikroskopie überwacht.
Bei 20 h Inkubation wird GFP nicht in Vakuolen (Abbildung 1) beobachtet. Auch ist Vakuole Erweiterung nicht statt. Jedoch bei 40 h Wachstum GFP-markierten Vakuolenwerden in einigen der Hyphen sichtbar, was darauf hinweist Autophagie (pexophagy) aktiv (Abbildung 1) zu werden. Bei 60 Stunden Wachstum wurde die Menge an GFP-markierten Vakuolen weiter erhöht. Als negative Kontrolle wurde ein Δ ATG1 Mutante von P. chrysogenum wurde verwendet (Δ ATG1 (GFP-SKL)) (Abbildung 2). Weder vergrößerte noch GFP-markierten Vakuolen können in diesem Stamm beobachtet werden. Als positive Kontrolle ist die autophagy stimulierenden Medikament Rapamycin verwendet (Abbildung 3). Nach 40 h Wachstum GFP-markierten Vakuolen sichtbar. Bei 60 Stunden, werden die Hyphen komplett mit riesigen GFP enthaltenden Vakuolen (Abbildung 3) gefüllt. Dies deutet darauf hin, dass, wie erwartet, hier nimmt massiven Autophagie Ort. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, die Gültigkeit des experimentellen Aufbaus.
Abb. 2: Lokalisierung von GFP-SKL in Δ ATG1 (GFP-SKL) während der Kultivierung auf Hunger Pads zu den angegebenen Zeiten wurden die Kulturen auf Hunger Pads gewachsen mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Repräsentative Bilder werden für jeden Zeitpunkt dargestellt. Entsprechende Hellfeldbereiche sind unter jeder Fluoreszenz gezeigtKanal Bild. Maßstabsbalken: 10 um. 
Fig. 3: Lokalisierung von GFP-SKL in Ws54-1255 (GFP-SKL) mit Rapamycin zur Induktion autophagy behandelten zu den angegebenen Zeiten Kulturen auf Hunger Pads mit 1 uM Rapamycin, gezüchtet wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Repräsentative Bilder werden für jeden Zeitpunkt dargestellt. Entsprechende Hellfeldbereiche sind unter jeder Fluoreszenzkanal Bild gezeigt. Weiß "v": GFP-SKL zu Vakuolen Angabe Peroxisomen Abbau lokalisiert. Maßstabsbalken: 10 um.
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Discussion
Die hier vorgestellte Methode ermöglicht die bequeme und reproduzierbare Untersuchung der Autophagie in P. chrysogenum. Beispielsweise kann es zum Screening der Wirksamkeit von verschiedenen Verbindungen, ob sie zur Modulation der autophagy Reaktion dieses Pilzes sind oder nicht verwendet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass mit Rapamycin Hemmung der TOR-Signalisierung führt zu einer deutlichen Induktion der Autophagie in P. chrysogenum, die auch für andere Organismen 11 gezeigt.
Es ist möglich, Myzelien auf Hunger Pads für die Analyse in feinere Mikroskope (zB konfokalen Laser-Scanning-Mikroskope) gezüchtet verwenden. Es spielt keine Rolle, ob die Probe unter dem Ziel, über dem Ziel (inverse Mikroskop) setzen. Verschiedene fluoreszierende Proteine, bestimmte Fächer gezielt verwendet werden, um das Schicksal der verschiedenen Organellen während der Autophagie (zB Mitochondrien zu überwachen -> mitophagy; endoplasmatischen reticulum -> ER-phagy, etc).. Zusammenfassend ist die hier beschriebene Technik erstreckt sich das Spektrum von Methoden zur mikroskopisch Studium Pilze 12.
Das Protokoll ist in der Regel unkompliziert und einfach zu bedienen. Allerdings ist es sehr wichtig, dass die Hunger Pads nie da desiccate in Artefakte und Zelltod führen. Daher wird nachdrücklich empfohlen, dass (i) die Objektträger mit dem noch flüssigen Agarose-Lösung werden sofort von der Heizplatte entfernt (Schritt 3.3), (ii), dass das Deckglas für die Herstellung einer flachen Oberfläche wird aus dem Hunger-Pad nach einem entfernt maximal 5 min (Schritte 3.3 und 3.4), (iii) dass der Objektträger wird immer in der nassen Kammer gehalten wird, wenn nicht analysiert (Schritte 3.5 und 5.4) und (iv) die mikroskopische Analyse nicht mehr als 15 min dauern (Schritt 5.3). Ein weiterer wichtiger Aspekt ist, dass der Ausgangsbetrag der Sporen oder Mycel-Fragmente auf den Hunger Pad pipettiert sollte nicht zu hoch sein oderzu niedrig. Dies kann leicht durch Verdünnung der Stamm gesteuert werden, indem sterilem Leitungswasser. Die 1/50 in 1.1.3 beschriebenen Verdünnung eignet sich gut für P. chrysogenum Sporensuspensionen. Es ist die empfohlene Verdünnung für den Einsatz mit unseren Pilze aber möglicherweise einige Anpassungen erfordern.
Eine Beschränkung des Verfahrens besteht darin, daß es nicht ratsam Zeitraffer-Imaging Experimente für mehr als 15 min. Dies ist aufgrund der allmählichen Austrocknung des Hungerkissen, sobald es aus der nassen Kammer entfernt. Wenn längere Beobachtungszeiten nötig sind, ist es möglich, kleine Mengen an sterilem Leitungswasser an den Rand des Hunger Pad hinzuzufügen, obwohl dies nicht eine Austrocknung in zentralen Gebieten der Unterlage zu verhindern. Eine weitere Einschränkung ist, dass das Verfahren nicht streng quantitativ. In Einzellern ist es möglich, Ereignisse pro Zelle punkten (zB Menge an Zellen, die GFP in der Vakuole). Demgegenüber P. chrysogenum als ein filamentöser Pilz ist charactevon einem mehrzelligen Architektur zusammengefasst. Die Zellen werden durch Septen, die eine zentrale Pore, die den Durchgang von Zytoplasma und Organellen ermöglicht enthalten unterteilt. Daher Proben kann nur analysiert "halb quantitativ '(zB Anzahl der Hyphen, die GFP zu Vakuolen lokalisiert). Zur Bedeutung zu erreichen, ist es sehr wichtig, dass die Zahl der Hyphen analysiert hoch genug ist (mindestens 80 pro Zeitpunkt und Zustand geprüft aber definitiv vorzuziehen).
Die Nutzung der Hunger-Pads für die Untersuchung Autophagie kann leicht für die Verwendung in anderen Fadenpilzen angepasst werden. Daher ist die hier vorgestellten Protokoll nicht nur beschränkt P. chrysogenum. Es sollte auch möglich sein, um es für mit einzellige Pilze, dh Hefen anzupassen. Übertragung des Protokolls zum höheren Organismen (zB Nematoden) erfordert wahrscheinlich speziellere Anpassungen. Es wird interessant sein zu sehen, ob die in dieser Arbeit beschriebenen Verfahren stellt außerdem fest,ihre Verwendung in anderen Bereichen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope slides with central cavity | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | H884.1 | These can be used multiple times after cleaning. |
| Glass beads | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | A553.1 | Diameter: 0.25 - 0.50 mm |
References
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