Introduction
פטריות פילמנטיות הן מערכות מודל מצוינות לחקר תהליכים התפתחותיים. הם מציעים מספר יתרונות ניסיוניים כמו טיפוח זול, מספרים גבוהים של צאצאים ונגישות גנטית. הנקודה האחרונה היא רלוונטית במיוחד לבניית transformants המאפשרים לחקור את החשיבות של גנים, עד כה, uncharacterized למנגנונים תאיים שונים. פטריות פילמנטיות כבר סייעו להבהרה של מספר גורמים ומנגנונים של מסלולי בקרת איכות סלולריות כמו פעילות פרוטאז לפירוק של חלבונים חריגים, דינמיקה של המיטוכונדריה לשמירה על השלמות וautophagy המיטוכונדריה להסרת עודפים ו / או רכיבי תא מתפקדים ולשמירה כדאיות תא בזמנים של 1,2,3 רעב.
ישנן מספר שיטות ניסיוניות זמינות ללימוד autophagy בפילמנטיות פטריות 2: חקירה (i) של vacuoles if הם מכילים גופי autophagic צפופים כאשר פרוטאזות מעוכבת על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים הילוכים 4, (ii) להדמיה של autophagosomes על ידי ניטור מוקדי GFP-Atg8 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 5,6 וכן (iii) זיהוי של מבני autophagosomal acidified באמצעות קדברין monodansyl צבע פלואורסצנטי 7.
כאן, שיטה חדשה של גובר chrysogenum Penicillium ללימודי autophagy מוצגת. האלמנט העיקרי הוא 'פנקס הרעב', שפשוט מורכב של 1% מומסים agarose במים ברז מעוקר. תרכובות נוספות (למשל, לחצים, אוכלי נבלות, מאפנני autophagy) ניתן להוסיף לפנקס כל עוד הם לא להציג אוטומטי הקרינה. הכרית ממוקמת בשקופיות מיקרוסקופ המכילות חלל מרכזי רדוד. פנקס זה במחוסן או עם השעיה נבג או עם שברי תפטיר קטנים. האחרון הוא מומלץ אם המתח של עניין אינו sporulatדואר יעילות (למשל, זני atg1 Δ 8). השקופיות ממוקמות בתאים רטובים (ניתן לבנות האלה בקלות על ידי שימוש בתיבות קצה פיפטה ריקות) כדי למנוע התייבשות של המדגם וטופחו בטמפרטורת חדר. P. chrysogenum הוא מסוגל לגדול לכמה ימים בתנאים אלה. Autophagy ניתן לצפות מיקרוסקופי על ידי הגדלת vacuolar אשר מהווה סמן חיובי לפטריית autophagy. בתרומה זו, P. זן chrysogenum (Wisconsin 54-1255) משמש המהווה חלבון פלואורסצנטי ירוק כי הוא ממוקד לperoxisomes על ידי הרצף 'SKL' C-המסוף שלה 9. לכן ניתן לעקוב אחר השפלה של peroxisomes. זה אפשרי לתייג גם תאים אחרים של התא (לדוגמא, מיטוכונדריה) באמצעות אותות לוקליזציה מתאימים ולנתח שפלתם. למרות נתונים מפ chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) מוצג כאן, זה בהחלט אפשרילהשתמש בשיטת 'פנקס רעב "גם לפטריות פילמנטיות אחרות (למשל, crassa Neurospora, macrospora Sordaria, מיני Aspergillus, וכו').
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת P. chrysogenum לניסויי הרעב
- אם P. זן chrysogenum עניין נשמר על אורז ("אורז ירוק"), מקום 2-3 גרגרי אורז מכוסים המתנבג תפטיר לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge. מלא אותו בYGG 500 μl (10 גר '/ ליטר KCl, 20 גר' / גלוקוז l, 10 גר '/ בסיס חנקן שמרי l, 5 גר' / ליטר K 2 HPO תמצית שמרי 4, 20 גר '/ ליטר).
- מערבולת הצינור למשך 30 שניות כדי שנבגים יכולים להתנתק מהאורז ביעילות.
- דגירה הצינור ליום 1 בטמפרטורת חדר (למשל, בין 20 ל 25 מעלות צלזיוס).
- הכן דילול 1/50 של השעיה נבג זה במים ברז סטרילי, ומערבב היטב.
- אם P. זן chrysogenum עניין נשמר על צלחת אגר (למשל, צלחת אגר YGG), להעביר חתיכות קטנות של התפטיר לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge המכיל 400 μl מים ברז סטרילי וכ GL 100 מ"גחרוזים התחת באמצעות איסוף שן סטרילי או פיפטה קצה.
- מערבולת הצינור למשך 2 דקות, כך שהתפטיר הופך מקוטעת. השתמש בתוכן של הצינור באופן מיידי.
2. שלבי הכנה לטיפוח P. chrysogenum על רפידות רעב
- לעבור על צלחת חימום ולהגדיר אותו כ 60 ° C.
- לפזר 2 גרם של agarose ב100 מ"ל מי ברז על ידי בישול הפתרון במיקרוגל. תשמור על עצמך כי פתרון זה הוא ברור לחלוטין לאחר חימום. אם זה לא, לבשל אותו שוב עד agarose הוא נמס לגמרי. תן פתרון agarose להתקרר כ 60 ° C לפני השימוש.
- מלא 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge (2-4, תלוי במספר דגימות) במים ברז 400 μl סטרילי כל אחת (לא תרכובות נוספות הוסיפו) או 400 x μl (תוספת של x μl של פתרון מתחם בשלב 2.5) ולמקם אותם לצלחת חימום דקות לפחות 1, כך שהוואטאה בתוך מתחמם.
- הנח שקופיות מיקרוסקופ המכילות חלל מרכזי לצלחת חימום דקות לפחות 1.
- להוסיף 400 μl 2% agarose לפתרון בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge ובקצרה מערבולת. לאחר שלב זה אם תרצה בכך, להוסיף תרכובות נוספות (כלומר, rapamycin 1 מיקרומטר). אם זה נעשה, מערבולת בקצרה לאחר כל חומר נוסף הוא pipetted לצינור. שים את הצינורות בחזרה על שולחן החימום כדי למנוע התמצקות מוקדמת.
הערה: הנפח הכולל של צינור microcentrifuge צריך להיות 800 μl.
3. הכנת שקופיות מיקרוסקופ המכילה רפידות רעב
- 140 μl פיפטה של פתרון agarose לתוך החלל של שקופיות מיקרוסקופ (שעדיין נמצא על צלחת החימום). נסה להימנע מבועות במידת האפשר.
- מייד במקום להחליק כיסוי על פתרון agarose.
הערה: זה יגרום משטח שטוח. - שים מיקרושקופית היקף על ספסל המעבדה לכ -4 דקות, כדי לאפשר את כרית agarose כדי לחזק.
- מוציאים בזהירות את coverslip מפנקס agarose ידי הזזה אותו בעזרת אצבע אגודל או מדד (ללבוש כפפות, כדי למנוע זיהום!).
- מניחים את שקופית מיקרוסקופ עם הכרית לחדר רטוב כדי למנוע התייבשות. המלצה: השתמש בתיבת קצה ריקה שעדיין יש להכניס להחזקת הטיפים פיפטה. מוסיף מים סטריליים לתיבה, כך שהחלק התחתון מכוסה. מניחים את שקופיות מיקרוסקופ על ההוספה ולסגור את התיבה.
4. ייחס רפידות הרעב עם פ chrysogenum ודגירה
- 5 μl פיפטה של דילול 1/50 הנבג (אם התרבויות גדלו על אורז) או 5 μl של הפתרון חי מכיל שברי תפטיר (אם התרבויות גדלו על צלחת אגר) על מרכז כרית הרעב.
- סגור את התא הרטוב ולעטוף אותו בשקית ניילון (זה משמש כהגנה נוספת מפני התייבשות של רפידות הרעב). היזהר שלא להזיז את הקופסה יותר מדי כי אחר טיפות החיסון יהיו מוטרדות.
- אחסן את התיבה העטופה בRT לפחות 20 שעות לפני ניתוח הדגימות.
5. ניתוח מיקרוסקופי של הדגימות
- לאחר 20 שעות של דגירה הדגימות מוכנות לניתוח מיקרוסקופי; לשים שקופית מיקרוסקופ על נייר טישו יבש (התחתון נוטה להיות רטוב).
- פיפטה נפח קטן של מים (בערך 50 μl) על כרית הרעב. שים coverslip על הכרית ולסחוט את מים עודפים. הסר את עודפי מים עם נייר טישו.
- שים את שקופיות מיקרוסקופ על שולחן ההתבוננות במיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי לקבל סקירה כללית של צמיחת תפטיר, להשתמש אובייקטיבי 20X. מטרות השימוש 63X או 100X ללימוד הלוקליזציה של ה- GFP בעובש. על מנת למנוע התייבשות הדרגתית של המדגם לא לנתח דגימות ליותר מ -15 דקות לפני שמכניס אותם בחזרה לתוך החדר הרטוב.
- חזור על 5.3 במרווחי זמן קבועים (לדוגמא, לאחר 40 שעות ו -60 שעות של צמיחה).
הערה: המדגם ניתן להחזיר לתא הרטוב. אין צורך להסיר את coverslip כפי שהוא אינו משפיע על צמיחת תפטיר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להדגים את התועלת של הפרוטוקול המפורט לעיל השפלה peroxisome בפ זן chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) נותח. בזן זה GFP-SKL בדרך כלל מיובא לperoxisomes 9. התוצאה היא ההופעה של צורות כדוריות מרובות כאשר המדגם מנותח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אם autophagy מתרחש, vacuoles להגדיל. GFP-SKL הופך שולב vacuoles ידי autophagy (pexophagy). בשל העובדה שGFP הוא עמיד בפני פירוק על ידי פרוטאזות vacuole זה תוויות אברונים אלה 10. לכן שני הפרמטרים להתבוננות autophagy (pexophagy) במתח, הגדלה זו vacuole ולוקליזציה של ה- GFP-SKL לvacuoles, בפיקוח בנוחות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
בגיל 20 שעות של דגירה, GFP הוא לא נצפה בוקואולות (איור 1). כמו כן, הגדלת vacuole אינה מתרחשת. עם זאת, ב -40 שעות של vacuoles שכותרת GFP הצמיחהלהיות גלוי בחלק מהעובש, המצביע על autophagy (pexophagy) להיות פעיל (איור 1). ב 60 שעות של צמיחת כמות vacuoles שכותרת GFP גדלה עוד יותר. כביקורת שלילית מוטציה atg1 Δ של פ chrysogenum נוצל (atg1 Δ (GFP-SKL)) (איור 2). לא ניתן לצפות vacuoles המוגדל ולא שכותרתו GFP בזן זה. כביקורת חיובית, rapamycin התרופה מגרה autophagy משמש (איור 3). אחרי 40 שעות של צמיחת vacuoles שכותרת GFP להיות גלוי. ב 60 שעות, העובש מלא לחלוטין עם vacuoles הענק המכיל GFP (איור 3). ממצא זה מצביע על כך ש, כצפוי, autophagy המסיבי מתרחש כאן. באופן קולקטיבי, תוצאות אלה ממחישות את תוקפו של ניסיוני ההגדרה.
איור 2:. לוקליזציה של ה- GFP-SKL בatg1 Δ (GFP-SKL) במהלך טיפוח על רפידות רעב במועדים המצוינות, תרבויות גדלו על רפידות רעב נותחו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. נציג תמונות מוצגות עבור כל נקודת זמן. מתאים אזורי שדה בהירים מוצג מתחת לכל הקרינהתמונת ערוץ. ברים בקנה מידה: 10 מיקרומטר. 
איור 3:. לוקליזציה של ה- GFP-SKL בWs54-1255 (GFP-SKL) שטופל בRapamycin לאינדוקציה של autophagy במועדים המצוין התרבויות גדלו על רפידות רעב בתוספת 1 מיקרומטר rapamycin נותח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. נציג תמונות מוצגות עבור כל נקודת זמן. אזורים בשדה בהירים המתאימים מוצגים מתחת לכל תמונת ערוץ הקרינה. לבן "v": GFP-SKL מקומי לvacuoles המציין השפלה peroxisome. ברים בקנה מידה: 10 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המוצגת כאן מאפשרת מחקר והנוח לשחזור של autophagy בפ chrysogenum. לדוגמא, ניתן להשתמש בו לסינון היעילות של תרכובות שונות אם הם מסוגלים ויסות תגובת autophagy של פטרייה זו או לא. התוצאות עם rapamycin להוכיח כי עיכוב של איתות TOR מוביל לאינדוקציה בולטת של autophagy בפ chrysogenum שגם הודגם עבור אורגניזמים אחרים 11.
ניתן להשתמש mycelia גדלה על רפידות רעב לניתוח במיקרוסקופים מתוחכמים יותר (לדוגמא, מיקרוסקופי סריקת לייזר confocal). זה לא משנה אם המדגם הוא לשים מתחת ליעד של מעל האובייקטיבי (מיקרוסקופ ההפוכה). חלבוני ניאון שונים הממוקדים לתאים מסוימים יכולים לשמש כדי לפקח על גורלם של האברונים שונים במהלך autophagy (למשל, מיטוכונדריה -> mitophagy; r endoplasmiceticulum -> ER-phagy, וכו ').. לסיכום, הטכניקה המתוארת כאן מרחיבה את הספקטרום של שיטות למיקרוסקופיות לומד פטריות 12.
הפרוטוקול הוא בדרך כלל פשוט וקל לשימוש. עם זאת, זה מאוד חשוב שרפידות הרעב לא לייבש כמו זה יגרום לחפצים ומוות של תאים. לכן הוא מומלץ בחום ש( i) שקופיות מיקרוסקופ המכילות את פתרון agarose עדיין נוזלי יוסרו באופן מיידי מצלחת החימום (שלב 3.3), (ii) שהכיסוי להחליק להכנת משטח שטוח הוסר מפנקס הרעב אחרי מקסימום 5 דקות (שלבים 3.3 ו 3.4), (iii) ששקופית מיקרוסקופ תמיד שמרה בתא הרטוב כאשר אינו מנותח (שלבים 3.5 ו -5.4) ו- (ד) כי ניתוח מיקרוסקופי לא לוקח יותר מ -15 דקות (שלב 5.3). היבט חשוב נוסף הוא כי הסכום התחלתי של נבגים או שברי mycelial pipetted על כרית הרעב צריך להיות לא גבוה מדי אונמוך מדי. זה ניתן לשלוט בקלות על ידי דילול של המניות על ידי שימוש במים ברז סטרילי. דילול 1/50 מתואר ב1.1.3 עובד היטב עבור פ chrysogenum השעיות נבג. זה הדילול המומלץ לשימוש עם הפטריות שלנו, אבל עשוי לדרוש כמה התאמות.
מגבלה של השיטה היא שזה לא מומלץ לניסויי הזמן לשגות הדמיה במשך יותר מ -15 דקות. זאת בשל ההתייבשות ההדרגתית של כרית הרעב לאחר שהוא הוסר מהתא הרטוב. אם יש צורך פעמים תצפית ארוכות יותר ניתן להוסיף כמויות קטנות של מים ברז סטרילי לשולים של משטח הרעב למרות שזה לא מונע התייבשות באזורים מסוימת של הכרית מרכזיות. מגבלה נוספת היא שהשיטה היא לא כמותי בקפדנות. באורגניזמים חד תאיים שאפשר להבקיע אירועים לכל תא (לדוגמא, כמות התאים המכילים GFP בvacuole). בניגוד לכך, P. chrysogenum כפטרייה סיבית היא characterized על ידי ארכיטקטורה רב-תאית. תאים מחולקים לפי septae המכיל נקבובית מרכזי המאפשר את המעבר של ציטופלסמה ואברונים. לכן דגימות ניתן לנתח רק 'חצי כמותית "(לדוגמא, מספר העובש המכיל GFP המקומי לvacuoles). כדי להשיג משמעות חשובה מאוד שמספר העובש ניתח גבוה מספיק (לפחות 80 לכל נקודת זמן ומצב שנבדק, אך יותר הוא בוודאות עדיפה).
הניצול של רפידות רעב ללימוד autophagy ניתן להתאים בקלות לשימוש בפטריות פילמנטיות אחרות. לכן הפרוטוקול המובא כאן אינו מוגבל רק לפ chrysogenum. זה צריך להיות גם ניתן להתאים אותה לעם פטריות חד-תאיות, כלומר שמרים. העברת הפרוטוקול לאורגניזמים גבוהים יותר (למשל, נמטודות) כנראה דורשת התאמות מיוחדות יותר. יהיה מעניין לראות אם השיטה שתוארה בעבודה זו גם מוצאתהשימוש בו בתחומים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope slides with central cavity | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | H884.1 | These can be used multiple times after cleaning. |
| Glass beads | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | A553.1 | Diameter: 0.25 - 0.50 mm |
References
- Fischer, F., Hamann, A., Osiewacz, H. D. Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways. Trends Biochem. Sci. 37 (7), 284-292 (2012).
- Pollack, J. K., Harris, S. D., Marten, M. R. Autophagy in filamentous fungi. Fungal Genet. Biol. 46 (1), 1-8 (2009).
- Scheckhuber, C. Q., Osiewacz, H. D. Podospora anserina: a model organism to study mechanisms of healthy ageing. Mol. Genet. Genomics. 280 (5), 365-374 (2008).
- Pinan-Lucarré, B., Iraqui, I., Clavé, C. Podospora anserina target of rapamycin. Curr. Genet. 50 (1), 23-31 (2006).
- Kikuma, T., Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K. Functional analysis of the ATG8 homologue Aoatg8 and role of autophagy in differentiation and germination in Aspergillus oryzae. Eukaryot. Cell. 5 (8), 1328-1336 (2006).
- Pinan-Lucarré, B., Balguerie, A., Clavé, C. Accelerated cell death in Podospora autophagy mutants. Eukaryot. Cell. 4 (11), 1765-1774 (2005).
- Veneault-Fourrey, C., Barooah, M., Egan, M., Wakley, G., Talbot, N. J. Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus. Science. 312 (5773), 580-583 (2006).
- Bartoszewska, M., Kiel, J. A., Bovenberg, R. A., Veenhuis, M., van der Klei, I. Autophagy deficiency promotes beta-lactam production in Penicillium chrysogenum. Appl. Environ. Microbiol. 77 (4), 1413-1422 (2011).
- Meijer, W. H., et al. Peroxisomes are required for efficient penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum. Appl. Environ. Microbiol. 76 (17), 5702-5709 (2010).
- Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A., Tsien, R. Y. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends Biochem. Sci. 20 (11), 448-455 (1995).
- Jung, C. H., Ro, S. H., Cao, J., Otto, N. M., Kim, D. H. mTOR regulation of autophagy. FEBS Lett. 584 (7), 1287-1295 (2010).
- Hickey, P. C., Read, N. D. Imaging living cells of Aspergillus in vitro. Med. Mycol. 47, Suppl 1. S110-S119 (2009).
