Introduction
糸状菌は、発達過程の研究のための優れたモデル系である。彼らは安い栽培、子孫と遺伝のアクセシビリティの高い番号のようないくつかの実験的な利点を提供します。最後の点は、様々な細胞メカニズムのそれまで未同定の遺伝子の重要性を調査できるように、形質転換体の構築のために特に重要である。糸状菌は、剰余金の除去および/または機能不全の細胞成分のための維持のためにミトコンドリアの完全性およびオートファジーを維持するため、異常なタンパク質の分解のためのプロテアーゼ活性のような細胞の品質管理経路のいくつかの要素とメカニズムの解明のためにミトコンドリアのダイナミクス尽力されてきた飢餓1,2,3の時代に、細胞生存率。
糸状菌2におけるオートファジーの研究のために利用可能ないくつかの実験技術があります：液胞の（I）の調査私がプロテアーゼは、透過型電子顕微鏡4によって阻害されたときfはそれらが密なオートファジー体を含むこと、（ii）蛍光色素モノダンシルカダベリを使用して、蛍光顕微鏡5,6酸性化オートファゴソーム構造の（iii）の検出によりGFP-Atg8病巣を監視することによりオートファゴソームの可視化7。
ここで、オートファジー研究のために、ペニシリウム·クリソゲヌムを成長させる新規な方法が提示される。主な要素は、単にアガロース滅菌水道水に溶解した1％からなる「飢餓パッド」である。追加の化合物（ 例えば、ストレス因子、スカベンジャー、オートファジー変調器）は、それらが自己蛍光を表示しないように、パッドに追加することができます。パッドは浅い中央の空洞が含まれている顕微鏡スライドに位置しています。このパッドに胞子懸濁液または小さな菌糸断片のいずれかで接種した。興味のある歪がsporulatに失敗した場合、後者が推奨される効率的に電子（ 例えば、ΔのATG1株 8）。スライドは、試料の乾燥を防ぐために（これらは容易に空のピペットチップボックスを使用して構成することができる）湿潤チャンバー内に配置し、室温でインキュベートする。P.クリソゲヌムは、これらの条件下で、数日間成長させることができる。オートファジーは、真菌、オートファジーのための肯定的なマーカーである液胞の拡大によって顕微鏡的に観察することができる。この貢献、Pにクリソゲナム菌株 （ウィスコンシン州54から1255）は、そのC末端'SKL'配列9によってペルオキシソームに標的化された緑色蛍光タンパク質を形成するために使用される。従って、ペルオキシソームの劣化を監視することが可能である。適切な局在化シグナルを使用してそれらの分解を分析することにより、細胞（ 例えば、ミトコンドリア）の他の区画を標識することが可能である。 Pからデータもののクリソゲヌム Ws54-1255（GFP-SKLが）それは確かに可能であり、ここで提示されている他の糸状菌（ 例えば、アカパンカビ、Sordaria macrospora、アスペルギルス種、 など ）にも「飢餓パッド'メソッドを使用します。
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Protocol
P.の調製飢餓実験用クリソゲヌム
- P.の場合関心のクリソゲヌム株は米（「緑米'）に保管され、1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに菌糸体を胞子形成に覆わ2-3米粒を配置。 500μlのYGG（10g / lのKClを、20g / lのグルコース、10g / lの酵母窒素塩基、5グラム/リットルのK 2 HPO 4、20g / lの酵母エキス）で塗りつぶす。
- 胞子が効率的にお米から切り離すことができるように、30秒間チューブをボルテックス。
- 室温で1日（ 例えば 、20〜25℃）のためにチューブをインキュベートする。
- 無菌水道水におけるこの胞子懸濁液の1/50希釈液を調製、よく混ぜる。
- P.の場合関心のクリソゲナム菌株は、400μlの滅菌水道水及び約100mgのglのを含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブに菌糸体の小片を移送、寒天プレート（ 例えば 、YGG寒天プレート）上に保持されている無菌の歯のピックまたはピペットチップを使用して、お尻のビーズ。
- 2分間ボルテックスチューブを菌糸体が断片化になるように。すぐにチューブの内容を使用してください。
Pの栽培2.準備手順飢餓パッド上クリソゲヌム
- 加熱プレートのスイッチを入れ、約60℃に設定します。
- 電子レンジで調理することにより、溶液を100ミリリットルの水道水にアガロースを2gを溶解する。このソリューションは、加熱後には完全には明らかであることに注意してください。そうでない場合、アガロースが完全に溶解するまで、再びそれを調理。アガロース溶液は、使用前に、約60℃まで冷却してみましょう。
- 各無菌水道水400μlの（サンプル数に応じて、2-4、）を1.5 mlマイクロチューブを埋める（追加の化合物を添加しない）、または400-XμL（ステップ2.5における化合物溶液のμLxの追加）、それを配置少なくとも1分間、加熱板上になるようワットER内部の暖かい取得します。
- 少なくとも1分間加熱プレート上に中央の空洞が含まれている顕微鏡スライドを配置します。
- 簡潔に1.5ミリリットルのマイクロチューブとボルテックスで溶液にアガロース400μlの2％を追加します。必要に応じて、このステップの後、追加の化合物（ すなわち、1μMのラパマイシン）を追加します。これが行われた場合、追加の各物質の後に簡単に渦がチューブにピペットで。時期尚早の凝固を防ぐために、加熱用テーブルの上に戻ってチューブを入れてください。
注：マイクロ遠心チューブ内の総容積は800μLでなければなりません。
飢餓パッドを含む顕微鏡用スライドガラスの調製
- （依然として加熱板上に配置されている）顕微鏡スライドのキャビティ内にアガロース溶液をピペットで140μlの。可能な場合は、気泡を避けるようにしてください。
- すぐにアガロース溶液上にカバースリップを配置。
注：これは平らな表面になります。 - マイクロを入れてアガロースパッドが凝固することを可能にするために約4分間の実験台の上にスコープスライド。
- 慎重に（汚染を避けるために手袋を着用！）親指または人差し指の助けを借りてそれをスライドさせて、アガロースパッドからカバースリップを削除します。
- 乾燥を防ぐために、湿ったチャンバー内にパッドを備えた顕微鏡スライドを置きます。推奨：まだピペットチップを保持するためのインサートを持って空の先端ボックスを使用します。底部が覆われるようにボックスに滅菌水を追加します。インサート上に顕微鏡スライドを配置し、ボックスを閉じます。
4. Pと飢餓パッドに接種クリソゲヌムおよびインキュベーション
- ピペット1/50胞子希釈液5μl（培養物は、ご飯の上に成長させた場合）、または菌糸断片を含む原液の5μL（培養物を寒天プレート上で成長させた場合）飢餓パッドの中心へ。
- これは、お楽しみいただけます（湿ったチャンバーを閉じ、ビニール袋に包む飢餓パッドの乾燥に対する追加の保護）。あまりにも多くの他の方法で接種滴が乱されるためボックスを移動しないように注意してください。
- サンプルを分析する前に、少なくとも20時間室温で包まれた箱に保管してください。
サンプルの5。顕微鏡分析
- インキュベーションの20時間後、試料を顕微鏡分析のために準備ができている。乾燥したティッシュペーパー上で顕微鏡スライドを配置（下湿潤なる傾向がある）。
- 飢餓パッド上に少量の水（約50μl）をピペット。パッド上にカバーガラスを入れ、余剰水を絞り出す。ティッシュペーパーで余剰水を除去。
- 蛍光顕微鏡の観察台に顕微鏡スライドを置く。菌糸体の成長の概要を取得するには、20X目標を使用しています。菌糸にGFPの局在を研究するための63Xまたは100Xの目的を使用してください。のために試料を分析しないサンプルの段階的な乾燥を防ぐためにより長い15分のウェット室に戻って、それらを入れる前。
- （40時間と成長の60時間後に、 例えば ）一定の間隔で5.3を繰り返します。
注：サンプルは、湿ったチャンバー内に戻すことができます。それは、菌糸体の成長に影響を与えないようにカバースリップを除去する必要がない。
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Representative Results
Pにペルオキシソームの劣化の上に詳細なプロトコルの有用性を実証するために、 クリソゲナム菌株 Ws54-1255（GFP-SKL）を分析した。この株ではGFP-SKLは通常、ペルオキシソーム9にインポートされます。サンプルは、蛍光顕微鏡によって分析されている場合に、複数の球状の外観をもたらす。オートファジーが発生した場合は、空胞を拡大。 GFP-SKLは、オートファジー（pexophagy）によって液胞に取り込まれる。によるGFPは液胞プロテアーゼによる分解に対して耐性であるという事実は、これらの細胞小器官10を標識する。したがって液胞にこの株、液胞の拡大とGFP-SKLの局在におけるオートファジー（pexophagy）を観察するための2つのパラメータは、便利に蛍光顕微鏡で監視されている。
インキュベーションの20時間で、GFPは液胞（ 図1）で観察されることはありません。また、液胞の拡大が行われていません。しかし、成長GFP標識液胞の40時間で（ 図1）アクティブになるオートファジー（pexophagy）を示す、菌糸の一部で見えるようになる。成長の60時間後にGFP標識された液胞の量がさらに増加している。 Pの負の制御ΔのATG1の変異体としてクリソゲヌムは（ΔATG1（GFP-SKL））（ 図2）を利用した。拡大することも、GFP標識液胞がこの株で観察することもできません。陽性対照として、オートファジー刺激薬のラパマイシン（ 図3）が使用される。成長の40時間後GFP標識液胞が見えるようになり。 60時間後に、菌糸は完全に巨大なGFP含有液胞（ 図3）で満たされている。この知見は、予想通り、大規模なオートファジーは、ここで起こることを示している。まとめると、これらの結果は、実験設定の妥当性を実証する。
図2：飢餓パッド上の培養中のΔのATG1（GFP-SKL）におけるGFP-SKLの局在は 、示された時点で、飢餓パッド上に成長した培養物を、蛍光顕微鏡を用いて分析した。代表的な画像を、各時点に対して示されている。対応する明視野領域は、各蛍光の下に示されているチャンネル画像。スケールバー：10μmである。 
図3：オートファジーを誘導するためのラパマイシンで処理Ws54-1255におけるGFP-SKLの局在（GFP-SKL）は 、示された時間において1μMラパマイシンを補充飢餓パッド上に成長させた培養物を、蛍光顕微鏡を用いて分析した。代表的な画像を、各時点に対して示されている。対応する明視野領域は、各蛍光チャネル画像の下に表示されます。白 "v"の：GFP-SKLペルオキシソーム劣化を示す液胞に局在。スケールバー：10μmである。
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Discussion
ここで紹介する方法はPにオートファジーの便利で再現可能な研究を可能にするクリソゲヌム 。例えば、それらはこの菌かのオートファジー応答を調節することができるかどうかを、種々の化合物の有効性をスクリーニングするために使用することができる。ラパマイシンを用いた結果は、TORシグナル伝達の阻害は、Pにおけるオートファジーの顕著な誘導を導くことを証明しているクリソゲヌムまた他の生物11のために実証されている。
これは、より洗練された顕微鏡（ 例えば 、共焦点レーザー走査顕微鏡）での分析のため飢餓パッド上に成長した菌糸体を使用することが可能である。これは、サンプルが目的（倒立顕微鏡）の上の目的の下に置かれているかどうかは問題ではありません。さまざまな特定のコンパートメントをターゲットに蛍光タンパク質はオートファジーの間に異なるオルガネラの運命を監視するために使用することができる（ 例えば、ミトコンドリア- > mitophagy、小Reticulum - > ER-phagy、 など ）。。要約すると、ここに記載されている技術は、微視的に菌類12を研究するための方法のスペクトルを拡張します。
プロトコルは、一般的には簡単で使いやすいです。しかし、飢餓パッドアーチファクト及び細胞死をもたらす。このように乾燥させることがないことが非常に重要である。したがって、それは強くは、（i）まだ液体アガロース溶液を含む顕微鏡スライドを加熱板からすぐに削除される（ステップ3.3）、（ii）は平坦な表面を作るためのカバースリップ後飢餓パッドから除去されることが示唆されている分析されなかったときに5分（3.3および3.4ステップ）の最大値は、（iii）の顕微鏡スライドは常に湿ったチャンバ内で維持される（3.5ステップ5.4）および（iv）顕微鏡分析は、15分以上を取らないこと（ステップ5.3）。もう一つの重要な側面は、飢餓パッド上にピペットで胞子または菌糸断片の出発量が高すぎたりしないでなければならないことである低すぎる。これは、簡単に滅菌水道水を使用して株式を希釈することによって制御することができる。 1.1.3で説明した1/50希釈はP.に適しています胞子懸濁液クリソゲナム 。それは私たちの菌類で使用するための推奨される希釈であるが、いくつかの調整が必要になる場合があります。
この方法の限界は、それ以上、15分間タイムラプスイメージング実験のために得策ではないということである。それはウエットチャンバから除去されると、これは、飢餓パッドの緩やかな乾燥によるものである。より長い観測時間が必要な場合、これは、パッドの中央領域におけるいくつかの乾燥を防止しないが、飢餓パッドの縁に滅菌水道水を少量添加することも可能である。別の制限は、この方法は、厳密に定量的ではないということである。単細胞生物では、細胞（ 例えば 、液胞にGFPを含む細胞の量）あたりのイベントを獲得することが可能である。対照的に、P.糸状菌としてクリソゲヌムは characteです多細胞アーキテクチャによって、有。細胞は、細胞質および細胞小器官の通過を可能にする中央の孔を含む隔膜により分割される。したがって、試料は、「半定量的」（液胞に局在化GFPを含む菌糸例えば 、数）を分析することができる。有意性を達成するためには、分析菌糸の数が十分に高いことが非常に重要である（時点および条件あたり少なくとも80のテストが、より明確に好適である）。
自食作用を研究するための飢餓パッドの利用が簡単に他の糸状菌における使用に適合させることができる。したがって、ここに提示されたプロトコルは、Pに限定されるものではないクリソゲヌム 。それはまた、単細胞の真菌、 例えば酵母とのためにそれを適合させることが可能であるべきである。高等生物（ 例えば 、線虫）のプロトコルの転送は、おそらく、より専門適応を必要とします。それは、この作品に記載されている方法でも見つけたかどうかを見るのは興味深いだろう他の分野での使用。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope slides with central cavity | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | H884.1 | These can be used multiple times after cleaning. |
| Glass beads | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | A553.1 | Diameter: 0.25 - 0.50 mm |
References
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