Introduction
사상균은 발달 과정의 연구를위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 그들은 싼 재배, 자손 유전 적 접근성의 높은 번호와 같은 몇 가지 실험적인 혜택을 제공합니다. 마지막 포인트는 다양한 세포 메커니즘에 대한 이제까지의지지 않은 유전자의 중요성을 조사 허용 형질 전환 체의 건설을위한 특별한 관련이있다. 사상 균류는 잉여 및 / 또는 장애 세포 구성 요소의 제거를 위해 미토콘드리아 무결성과 자식 작용을 유지하고 유지하기위한 몇 가지 요소와 비정상적인 단백질, 미토콘드리아 역학의 분해 단백질 분해 효소 활동 등 셀룰러 품질 관리 경로의 메커니즘의 해명을위한 수단이되었습니다 기아 1,2,3 번에서 세포 생존 능력.
사상 균류 2 자식 작용의 연구에 사용할 수있는 여러 가지 실험 기법이있다 : 공포의 (ⅰ) 조사 전프로테아제는 투과 전자 현미경 (4)에 의해 억제 될 때 F 이들은 치밀 포식 체를 포함하는, (II)의 형광 염료 monodansyl의 카다를 이용하여 형광 현미경 5,6- 산성화 autophagosomal 구조 (III) 검출을 통해 GFP-Atg8 병소 모니터링함으로써 autophagosomes 가시화 7.
여기에, 자식 작용의 연구에 페니 chrysogenum 성장의 새로운 방법을 제시한다. 주요 요소는 단순히 아가 살균 수돗물에 용해 된 1 %로 구성 '기아 패드'이다. 추가 화합물 (예, 스트레스는, 스 캐빈 저는, 자식 작용 변조기)만큼 그들은 자동 형광 표시되지 않는 패드에 첨가 될 수있다. 패드는 얕은 중앙 캐비티를 포함 현미경 슬라이드에 있습니다. 포자 현탁액 또는 작은 균사체 파편 중 하나 접종에이 패드. 관심의 변형이 sporulat하지 않았을 경우에는, 후자는 것이 좋습니다효율적 전자 (예를 들어, Δ의 atg1 균주 8). 슬라이드는 샘플의 탈수를 방지하기 위해 (이들 용이 빈 피펫 팁 박스를 사용하여 구성 될 수있다)하고, 실온에서 배양 습윤 챔버에 위치된다. P. chrysogenum 이러한 조건 하에서 몇일 성장할 수있다. 자식 작용은 곰팡이 자식 작용에 대한 긍정적 인 마커 액포 확대하여 현미경으로 관찰 할 수있다. 이 기여, P.에서 chrysogenum 변형 (위스콘신 54-1255)는 자사의 C 말단 'SKL'순서 9 퍼 옥시 솜를 대상으로 녹색 형광 단백질을 형성하는 데 사용됩니다. 그러므로 페 록시의 열화를 모니터링하는 것이 가능하다. 이는 적절한 위치 파악 신호를 이용하여도 셀 (예를 들면, 미토콘드리아)의 다른 구획에 라벨 그들의 열화를 분석 가능하다. P. 데이터 있지만 chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL)는 확실히 가능하고, 여기에 제시다른 진균에 대해서도 '기아 패드'방법을 사용하려면 (예를 들어, 뉴로 crassa의, Sordaria의 macrospora, 아스 페르 길 루스 종 등).
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Protocol
P. 1. 준비 chrysogenum 기아 실험에 대한
- P. 경우 관심 chrysogenum 변형이 쌀 ( '녹색 쌀')에 보관되어, 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 균사체를 포자 덮여 2-3 쌀 곡물을 배치합니다. 500 μL의 YGG (10g / L의 KCl, 20g / ℓ의 포도당 10g / L 효모 질소베이스, 5g / ℓ K 2 HPO 4, 20g / ℓ 효모 추출물)로 채 웁니다.
- 포자 효율적 벼에서 분리 할 수 있도록 30 초 동안 와동 튜브.
- 실온에서 1 날 (예를 들어, 20 내지 25 °의 C)에 대해 튜브를 부화.
- 멸균 수돗물이 포자 현탁액의 1/50 희석을 준비, 잘 섞는다.
- P. 경우 관심 chrysogenum 균주 한천 플레이트 (예 YGG 한천 플레이트)에 보관하고, 400 μL 무균 수돗물 약 100 mg을 GL을 함유하는 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 균사체의 작은 조각을 전송할멸균 된 이쑤시개 또는 피펫 팁을 사용하여 엉덩이 구슬.
- 소용돌이는 2 분 동안 튜브되도록 균사체 단편화된다. 즉시 튜브의 내용을 사용합니다.
P.의 재배 2. 준비 단계 기아 패드에 chrysogenum
- 가열 접시에 전환하고 약 60 ° C로 설정합니다.
- 전자 레인지 용액을 요리 수돗물 100 ㎖의 아가 2g을 녹인. 이 솔루션은 가열 후 완전히 명확주의하십시오. 그렇지 않은 경우, 아가 로스가 완전히 용해 될 때까지, 다시 조리. 아가로 오스 솔루션은 사용하기 전에 약 60 ° C로 냉각 보자.
- 400 μL 멸균 탭 각 (추가 화합물이 첨가되지) 물이나와 (샘플의 수에 따라 2-4)를 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 채우기 400-X μL (단계 2.5 화합물 용액 ㎕의 x를 추가)하고이를 배치 적어도 1 분 동안 가열 플레이트 상으로되도록 와트어 내부에 따뜻한 가져옵니다.
- 적어도 1 분 동안 가열 접시에 중앙 캐비티를 포함하는 현미경 슬라이드를 놓습니다.
- 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브와 소용돌이 짧게에서 솔루션에 아가로 오스 400 μL 2 %를 추가합니다. 원하는 경우이 단계 후에, 추가 화합물 (즉, 1 μM 라파 마이신)를 추가합니다. 이 작업을 수행 할 경우, 소용돌이 각각의 추가 물질은 튜브에 피펫되어 잠시 후. 조기 고화를 방지하기 위해, 가열 테이블에 다시 넣어 튜브.
주 : microcentrifuge 관의 총 부피는 800 ㎕를해야한다.
기아 패드를 포함하는 현미경 슬라이드 3. 준비
- (정지 가열판에 위치) 현미경 슬라이드의 공동 내로 아가 용액 140 μL 피펫. 가능하면 거품을 피하기 위해보십시오.
- 즉시 아가로 오스 솔루션 상에 커버 슬립을 배치합니다.
참고 :이 평평한 표면에 발생합니다. - 마이크로 넣어약 4 분의 실험실 벤치 위에 범위 슬라이드 아가로 오스 패드를 응고시킬 것입니다.
- 조심스럽게 엄지 또는 검지의 도움으로 그것을 떨어져 밀어 아가로 오스 패드에서 커버 슬립을 제거 (오염을 방지하기 위해 장갑을 착용!).
- 탈수를 방지하기 위해 젖은 챔버로 패드 현미경 슬라이드를 놓습니다. 권장 사항 : 여전히 피펫 팁을 유지하기위한 삽입을 가진 빈 팁 상자를 사용합니다. 바닥이 적용되도록 상자에 멸균 물을 추가합니다. 삽입에 현미경 슬라이드를 놓고 상자를 닫습니다.
4. P.와 기아 패드를 접종 chrysogenum 및 배양
- 1/50 포자 (문화 쌀 재배 된 경우) 희석 또는 기아 패드의 중심에 (문화 agar 접시에 성장 된 경우) 균사체 단편을 포함하는 원액의 5 μL의 피펫 5 μL.
- 이 역할 (습식 챔버를 닫고 비닐 봉지에 포장기아 패드의 탈수에 대한 추가 보호). 너무 많은 그렇지 않으면 접종 방울을 방해하기 때문에 상자를 이동하지 않도록주의하십시오.
- 샘플을 분석하기 전에 적어도 20 시간 동안 실온에서 포장 상자를 보관하십시오.
샘플 5. 현미경 분석
- 배양 20 시간 후 샘플을 현미경 분석을위한 준비; 드라이 티슈에 현미경 슬라이드를 넣어 (바닥에 물기가 경향).
- 기아 패드 위에 물을 소량 (약 50 μL)를 피펫. 패드에 커버 슬립을 넣고 여분의 물을 짜 낸다. 티슈로 여분의 물을 제거합니다.
- 형광 현미경의 관찰 테이블에 현미경 슬라이드를 넣습니다. 균사체 성장의 개요를 얻으려면, 20 배 목표를 사용합니다. 균사에서 GFP의 지역화 연구를위한 사용 63X 또는 100X 목표. 샘플에 대한 분석을하지 않는 샘플의 점진적인 탈수를 방지하기 위해,15 분 이상 습식 챔버에 다시 놓기 전에.
- (40 시간과 성장의 60 시간 후, 예를 들면) 일정한 간격으로 5.3를 반복합니다.
참고 : 샘플은 습식 챔버에 다시 넣을 수 있습니다. 그것은 균사체 생장에 영향을주지 않는 커버 슬립을 제거 할 필요가 없다.
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Representative Results
P.에 퍼 옥시 저하 위에 설명 된 프로토콜의 유틸리티를 설명하기 위해 chrysogenum 변형 Ws54-1255 (GFP-SKL)을 분석 하였다. 이 변형에서 GFP-SKL은 일반적으로 퍼 옥시 솜 (9)로 가져옵니다. 시료를 형광 현미경을 통해 분석 될 때 여러 구형의 모양을 초래한다. 자식 작용이 발생하는 경우, 액포는 확대. GFP-SKL은 자식 작용 (pexophagy)에 의해 공포에 통합된다. 인해 GFP는 액포 프로테아제 분해에 대한 저항성이 있다는 사실 이들 소기관 열 라벨. 따라서 액포이 변형, 공포의 확대 및 GFP-SKL의 현지화 자식 작용 (pexophagy)를 관찰하기위한 두 개의 매개 변수가 편리 형광 현미경으로 모니터링됩니다.
배양 20 시간에서, GFP가 액포 (도 1)에서 관찰되지 않는다. 또한, 공포의 확대가 이루어지고 있지 않습니다. 그러나, 성장 GFP 표지 된 액포 40 시간을 연속적활성 (그림 1)이 될 자식 작용 (pexophagy)을 나타내는, 균사의 일부에 표시됩니다. 성장의 60 시간을 연속적으로 GFP 표지 된 액포의 양은 더 증가하고있다. 음성 대조군 P.의 Δ의 atg1 돌연변이로 chrysogenum은 (Δ의 atg1 (GFP-SKL)) (그림 2)를 사용 하였다. 어느 쪽도 확대도 GFP 표지 공포는이 균주에서 관찰 할 수 없습니다. 양성 대조군으로, 자식 작용 자극 약물 라파 마이신 (그림 3)를 사용한다. 성장의 40 시간 후 GFP 표지 공포가 표시됩니다. 60 시간에서, 균사가 완전히 거대한 GFP 함유 액포 (그림 3)으로 가득 차 있습니다. 이 발견은, 예상대로 대규모 자식 작용 여기에 발생하는 것을 나타냅니다. 종합적으로, 이러한 결과는 실험 장치의 유효성을 보여줍니다.
그림 2 :. 기아 패드에 재배하는 동안 Δ의 atg1에서 GFP-SKL (GFP-SKL)의 현지화 지정된 시간에, 기아 패드에 성장 문화는 형광 현미경을 사용하여 분석 하였다. 대표적인 이미지는 각 시점에 대해 도시된다. 시야 영역을 대응하는 각각의 형광 아래와 같다채널 이미지. 스케일 바 : 10 μm의. 
그림 3 :. 자식 작용의 유도를 위해 라파 마이신으로 치료 Ws54-1255 (GFP-SKL)에서 GFP-SKL의 현지화 1 μM 라파 마이신 보충 기아 패드에서 재배 지정된 시간 배양에서 형광 현미경을 사용하여 분석 하였다. 대표적인 이미지는 각 시점에 대해 도시된다. 대응하는 시야 영역은 형광 각 채널 영상 이하에 나타낸다. 화이트 "V"GFP-SKL는 퍼 옥시 저하를 나타내는 공포에 지역화. 스케일 바 : 10 μm의.
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Discussion
여기에 제시된 방법은 P.에서 자식 작용의 편리하고 재현성 연구를 할 수 있습니다 chrysogenum. 예를 들면, 곰팡이는이 아닌지의 자식 작용 반응을 조절할 수있는 여부를 다양한 화합물의 효능의 스크리닝에 사용될 수있다. 라파 마이신과 결과는 TOR 신호 전달의 억제는 P.에서 자식 작용의 뚜렷한 유도에 이르게 입증 chrysogenum 다른 생물 (11)에 대한 입증 된.
그것은 더 정교한 현미경 (예, 공 초점 레이저 주사 현미경) 분석에 대한 고갈 균사 성장 패드를 사용하는 것이 가능하다. 이 샘플은 목적 (반전 현미경) 위의 목적 아래에 배치되어 있는지 여부를 중요하지 않습니다. 특정 구획을 대상으로 다양한 형광 단백질은 자식 작용하는 동안 다른 세포 소기관의 운명 (예를 들어, 미토콘드리아 모니터링하는 데 사용할 수있는 -> mitophagy를, 세포질 Reticulum -> ER-phagy 등).. 요약하면, 여기에 기재된 기술은, 현미경 (12) 진균을 연구하기위한 방법의 스펙트럼을 확장한다.
이 프로토콜은 일반적으로 간단하고 사용하기 쉽습니다. 그러나, 기아 패드 유물 및 세포 사망을 초래할 것이로 건조하는 결코 것이 매우 중요합니다. 따라서 강력하게 (ⅰ) 여전히 액체 아가 용액을 함유 현미경 슬라이드를 가열판으로부터 즉시 제거된다 (단계 3.3), (II) 평평한 표면을 제조하기위한 커버 슬립이 후 기아 패드로부터 제거되는 것을 제안 분석하지 않을 경우 5 분 (3.3 및 3.4 단계)의 최대가, (ⅲ) 현미경 슬라이드는 항상 젖은 실에 보관되어 있는지 (3.5 단계 5.4) 및 (IV) 현미경 분석이 15 분 이상 소요되지 않도록한다 (단계 5.3). 또 다른 중요한 측면은 기아 패드에 피펫 포자 또는 균사 조각의 시작 양이 너무 높지해야한다는 또는너무 낮습니다. 이것은 쉽게 살균 수돗물을 사용하여 콘텐츠의 희석에 의해 제어 될 수있다. 1.1.3에 설명 1/50 희석 P. 잘 작동 포자 현탁액 chrysogenum. 그것은 우리의 곰팡이와 함께 사용하기위한 권장 희석하지만 일부 조정이 필요할 수 있습니다.
방법의 한계는 이상에서 15 분 동안 저속 촬상 실험 바람직하지 않기 때문이다. 이 습식 챔버로부터 제거되면이 기아 패드의 점진적인 탈수 때문이다. 긴 관찰 시간이 필요한 경우는이 패드의 중앙 영역에서 약간의 탈수를 방지하지 않더라도 기아 패드의 프린지 멸균 수돗물을 소량 첨가 할 수있다. 또 다른 방법은 제한이 엄격 정량적 없다는 것이다. 단세포 생물에서는 세포 당 이벤트를 득점 할 수있다 (예를 들어, 공포에 GFP를 포함하는 세포의 양). 한편, P. chrysogenum 사상균은 characte 그대로다세포 구조에 의해 정리 된. 세포 세포질 소기관의 전달을 허용하는 중앙 구멍을 포함 격막에 의해 분할된다. 따라서 샘플은 '정량적 반'분석 할 수 있습니다 (예를 들어, 공포에 지역화 된 GFP 포함 균사의 수). 의미를 달성하기 위해 그 (결정적 시점과하지만 더 테스트 조건 당 적어도 80 바람직 함) 분석 균사의 수가 충분히 높은 것이 매우 중요하다.
자식 작용을 연구하기위한 기아 패드의 이용을 용이하게 다른 사상균에 사용하기 위해 적응 될 수있다. 그러므로 여기에 제시된 프로토콜은 P. 한정되지 않는다 chrysogenum. 또한, 즉 효모 단세포 곰팡이와 그것을 적용 할 수 있어야한다. 고등 생물 (예를 들어, 선충)에 프로토콜의 전송은 아마보다 전문적인 적응이 필요합니다. 그것은이 작품에서 설명하는 방법도 발견 여부를 확인하기 위해 흥미로운 일이 될 것이다다른 분야에서의 사용.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope slides with central cavity | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | H884.1 | These can be used multiple times after cleaning. |
| Glass beads | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | A553.1 | Diameter: 0.25 - 0.50 mm |
References
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