Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Analyse av Autophagy i Published: February 1, 2015 doi: 10.3791/52577

Introduction

Trådformede sopper er gode modellsystem for å studere utviklingsprosesser. De tilbyr flere eksperimentelle fordeler som billig dyrking, høyt antall avkom og genetisk tilgjengelighet. Det siste punktet er av særlig relevans for bygging av transformanter som tillater undersøker betydningen av så-langt uncharacterized gener for ulike cellulære mekanismer. Filamentøse fungi har vært medvirkende til belysning av flere elementer og mekanismer for cellulære kvalitetskontroll trasé som protease-aktivitet for nedbrytning av avvikende proteiner, mitokondrie dynamikk for å opprettholde integriteten og mitokondrielle autophagy for fjerning av overskudd og / eller dårlig fungerende cellekomponenter, og for å opprettholde celle levedyktighet i tider med sult 1,2,3.

Det er flere eksperimentelle teknikker tilgjengelig for studiet av autofagi i trådformede sopp 2: (i) undersøkelse av vakuoler jegf de inneholder tette autophagic organer når proteaser er hemmet ved transmisjonselektronmikroskopi 4, (ii) visualisering av autophagosomes ved å overvåke GFP-Atg8 foci via fluorescensmikroskopi 5,6 og (iii) påvisning av forsurede autophagosomal strukturer ved hjelp av fluorescerende fargestoff monodansyl cadaverine 7.

Her blir en ny fremgangsmåte til å vokse Penicillium chrysogenum for Autophagy studier presentert. Hovedelementet er "sult pad" som bare består av 1% agarose oppløst i sterilisert vann fra springen. Ytterligere forbindelser (for eksempel stressfaktorer, åtseldyr, autofagi modulatorer) kan legges til puten, så lenge de ikke viser auto-fluorescens. Puten ligger i objektglass som inneholder en grunne sentrale hulrom. Denne puten i inokulert enten med en spore suspensjon eller med små mycel fragmenter. Sistnevnte er tilrådelig hvis belastningen av interesse unnlater å sporulate effektivt (f.eks Δ atg1 stammer 8). Skinnene er plassert i våte kamre (disse kan lett konstrueres ved å bruke tomme pipettes bokser) for å hindre uttørking av prøve og inkubert ved værelsestemperatur. P. chrysogenum er i stand til å vokse i noen dager under disse betingelser. Autofagi kan observeres mikroskopisk ved vacuolar utvidelse som er en positiv markør for sopp autofagi. I dette bidraget, en P. chrysogenum stamme (Wisconsin 54-1255) brukes som danner grønt fluorescerende protein som er målrettet mot peroxisomes av sin C-terminal "SKL 'sekvens 9. Derfor er det mulig å overvåke nedbrytningen av peroxisomes. Det er mulig å merke også andre i cellen (f.eks mitokondrier) ved hjelp av hensiktsmessige lokaliseringssignaler, og for å analysere deres nedbrytning. Selv om data fra P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) er presentert her, det er absolutt muligå bruke "sult pad" metoden også for andre trådformede sopper (f.eks Neurospora crassa, Sordaria macrospora, Aspergillus arter, etc.).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av P. chrysogenum for Sult Eksperimenter

  1. Hvis P. chrysogenum stamme av interesse holdes på ris ("grønn ris '), plasserer 2-3 riskorn dekket med sporedannende mycel i en 1,5 ml mikro tube. Fylle det med 500 ul YGG (10 g / l KCl, 20 g / l glukose, 10 g / l gjærnitrogenbase, 5 g / l K 2 HPO 4, 20 g / l gjærekstrakt).
    1. Vortex røret i 30 sekunder slik at sporer kan løsne fra ris effektivt.
    2. Inkuber røret i 1 dag ved romtemperatur (for eksempel mellom 20 og 25 ° C).
    3. Forberede en 1/50 fortynning av dette sporesuspensjon i sterilt vann fra springen, bland godt.
  2. Hvis P. chrysogenum stamme av interesse holdes på en agar plate (f.eks YGG agar plate), overføre små biter av mycel i en 1,5 ml mikro rør som inneholder 400 mL sterilt vann fra springen og ca 100 mg glass perler ved hjelp av en steril tannpirker eller pipette.
    1. Vortex røret i 2 minutter, slik at mycelet blir fragmentert. Bruke innholdet i røret umiddelbart.

2. forberedende skritt for Dyrking av P. chrysogenum på Sult Pads

  1. Slå på en varmeplate og sett den til ca 60 ° C.
  2. Oppløs 2 g agarose i 100 ml springvann ved å koke oppløsningen i en mikrobølgeovn. Pass på at denne løsningen er helt klart etter oppvarming. Hvis det ikke er det, koker det igjen før agarosen er oppløst helt. La agarose løsningen avkjøles til ca. 60 ° C før bruk.
  3. Fyll 1,5 ml mikrosentrifugerør (2-4, avhengig av antall sampler) med 400 ul sterilt vann fra springen hver (ingen ytterligere forbindelser tilsettes) eller 400-x pl (tilsetning av x ul av forbindelse løsning i trinn 2.5) og plassere disse på varmeplaten i minst 1 minutt, slik at water inne blir varmt.
  4. Legg objektglass som inneholder et sentralt hulrom på varmeplaten i minst 1 min.
  5. Tilsett 400 ul 2% agarose til løsningen i 1,5 ml mikrosentrifugerør og vortex kort. Etter dette trinnet hvis ønskelig, legge til flere forbindelser (dvs. 1fiM rapamycin). Hvis dette er gjort, vortex kort etter hver ekstra stoff pipetteres til røret. Sette tilbake rørene på varmebord for å hindre for tidlig størkning.
    MERK: Det totale volumet i mikrosentrifugerør bør være 800 mikroliter.

3. Utarbeidelse av Microscope Slides Inneholder Sult Pads

  1. Pipetter 140 ul av agarose oppløsning inn i hulrommet i objektglass (som fremdeles befinner seg på varmeplate). Prøv å unngå å gjøre bobler hvis mulig.
  2. Umiddelbart plassere en dekkglass på agarose løsning.
    MERK: Dette vil resultere i et flatt underlag.
  3. Sette microomfang lysbilde på laboratoriebenken for ca 4 min å tillate agarose pad å stivne.
  4. Fjern forsiktig dekkglass fra agarosen puten ved å skyve den av ved hjelp av en tommel eller pekefinger (hansker for å unngå forurensning!).
  5. Legg objektglass med puten i en våt kammer for å hindre uttørking. Anbefaling: Bruk en tom boksen tips som fortsatt har innsatsen for å holde pipettespissene. Legg sterilt vann til boksen slik at bunnen er dekket. Plasser objektglass på innsatsen og lukke boksen.

4. inokulerer sult Pads med P. chrysogenum og Inkubasjon

  1. Pipetter 5 ul av femtideler spore fortynning (om kulturene ble dyrket på ris), eller 5 ul av ufortynnet løsning inneholdende mycel-fragmenter (hvis kulturene ble dyrket på en agar-plate) på midten av sult puten.
  2. Lukk våt kammer og pakk den i en plastpose (dette fungerer somekstra beskyttelse mot uttørking av sult pads). Vær forsiktig med å flytte boksen for mye fordi ellers inokulerings dråper vil bli forstyrret.
  3. Oppbevar innpakket boks ved værelsestemperatur i minst 20 timer før analysering av prøvene.

5. Mikroskopisk analyse av prøvene

  1. Etter 20 timer med inkubering ble prøvene er klart for mikroskopisk analyse; sette objektglass på tørr silkepapir (nederst har en tendens til å bli våt).
  2. Pipetter en liten mengde vann (ca. 50 pl) på sult puten. Sett en dekkglass på puten og klem ut overflødig vann. Fjerne overskytende vann med et silkepapir.
  3. Sett objektglass på observasjonsbord av fluorescens mikroskop. For å få en oversikt over mycel vekst, bruk en 20X objektiv. Bruk 63x eller 100X målsettinger for å studere nærmere lokalisering av GFP i hyfer. For å hindre gradvis uttørking av prøven ikke analysere prøvene etterlenger enn 15 minutter før du setter dem tilbake i det våte kammeret.
  4. Gjenta 5.3 med regelmessige mellomrom (f.eks, etter 40 timers og 60 timers vekst).
    MERK: Prøven kan settes tilbake inn i den våte kammeret. Det er ikke nødvendig å fjerne dekkglass som det ikke påvirker mycelium vekst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å demonstrere nytten av protokollen beskrevet ovenfor peroksisom nedbrytning i P. chrysogenum belastning Ws54-1255 (GFP-SKL) ble analysert. I denne belastningen GFP-SKL er vanligvis importert til peroxisomes 9. Dette resulterer i fremkomsten av flere sfæriske formene når prøven blir analysert via fluorescens mikroskopi. Hvis autofagi skjer, vakuoler forstørre. GFP-SKL blir innlemmet i vakuoler ved autofagi (pexophagy). På grunn av det faktum at GFP er motstandsdyktig mot nedbrytning ved vakuole proteaser etiketter det disse organeller 10. Derfor de to parametrene for å observere autofagi (pexophagy) i denne stammen, vakuole utvidelse og lokalisering av GFP-SKL til vakuoler, er beleilig overvåket av fluorescens mikroskopi.

Ved 20 timers inkubasjon er GFP aldri observert i vakuoler (figur 1). Dessuten er vakuole utvidelse ikke finner sted. Men ved 40 hr av vekst GFP-merket vakuolerbli synlig i noen av hyfer, som indikerer autofagi (pexophagy) til å bli aktive (figur 1). Ved 60 timers vekst mengden av GFP-merket vakuoler har økt ytterligere. Som en negativ kontroll en Δ atg1 mutant av P. chrysogenum ble benyttet (Δ atg1 (GFP-SKL)) (figur 2). Verken forstørrede eller GFP-merket vakuoler kan observeres i denne stammen. Som en positiv kontroll, er autofagi-stimulerende medikament rapamycin benyttes (figur 3). Etter 40 timers vekst GFP-merket vakuoler blir synlige. Ved 60 timer, er hyfene helt fylt med stor GFP-holdige vakuoler (figur 3). Dette funn tyder på at, som forventet, tar massive autophagy sted her. Sammen er disse resultatene viser gyldigheten av den eksperimentelle oppsett.

Figur 1

Figur 2
Figur 2:. Lokalisering av GFP-SKL i Δ atg1 (GFP-SKL) under dyrking på sult pads På de angitte tider, kulturer dyrket på sult pads ble analysert ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Representative bilder som er vist for hvert tidspunkt. Tilsvarende lyse feltområdene er vist under hver fluorescenskanal bilde. Skala barer: 10 mikrometer.

Figur 3
Fig. 3: Lokalisering av GFP-SKL i Ws54-1255 (GFP-SKL) behandlet med rapamycin for induksjon av autofagi På de angitte tidspunkter kulturer dyrket på sulteputer supplert med 1 pM rapamycin ble analysert ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Representative bilder som er vist for hvert tidspunkt. Tilsvarende lyse feltområdene er vist under hver fluorescens kanal bilde. Hvit "v": GFP-SKL lokalisert til vakuoler indikerer peroxisome degradering. Skala barer: 10 mikrometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden som presenteres her tillater praktisk og reproduserbar studie av autofagi i P. chrysogenum. For eksempel kan den brukes til screening av effekten av forskjellige forbindelser enten de er i stand til å modulere autophagy responsen av denne sopp eller ikke. Resultatene med rapamycin viser at inhibering av TOR-signalering fører til en markert induksjon av autofagi i P. chrysogenum som har også blitt demonstrert for andre organismer 11.

Det er mulig å bruke mycel dyrket på sult pads for analyse i mer avanserte mikroskoper (f.eks konfokale laser skanning mikroskoper). Det spiller ingen rolle om prøven er satt under målet på over målet (invertert mikroskop). Forskjellige fluorescerende proteiner knyttet til spesielle kamre kan anvendes til å overvåke skjebnen til forskjellige organ under autophagy (f.eks mitokondrier -> mitophagy; endoplasmatiske reticulum -> ER-phagy, etc).. Oppsummert, den teknikk som beskrives her, strekker spekteret for metoder for mikroskopisk studere 12 sopp.

Protokollen er generelt grei og enkel å bruke. Det er imidlertid svært viktig at sult pads aldri desiccate da dette vil resultere i gjenstander og celledød. Derfor er det sterkt anbefalt at (i) de objektglass som inneholder den fremdeles flytende agarose løsning blir fjernet umiddelbart fra varmeplaten (trinn 3.3), (ii) at dekkglass for å lage en flat overflate fjernes fra puten sult etter maksimalt 5 min (trinn 3.3 og 3.4), (iii) at den objektglass blir alltid holdt i den våte kammeret når den ikke er analysert (trinn 3.5 og 5.4) og (iv) at mikroskopisk analyse ikke ta mer enn 15 minutter (trinn 5.3). Et annet viktig aspekt er at utgangs mengde sporer eller mycel-fragmenter pipettert på sult puten bør ikke være for høy ellerfor lavt. Dette kan enkelt kontrolleres ved utvanning av aksjen ved å bruke sterilt vann fra springen. Den 1/50 fortynning beskrevet i 1.1.3 fungerer godt for P. chrysogenum sporesuspensjoner. Det er den anbefalte fortynning for bruk med våre sopp, men kan kreve noen justeringer.

En begrensning av metoden er at det ikke er tilrådelig for time-lapse bildebehandling eksperimenter for mer enn 15 min. Dette er på grunn av den gradvise uttørking av sult puten når den er fjernet fra den våte kammeret. Hvis det trenges lengre observasjonstid er det mulig å legge små mengder sterilt vann fra springen til utkanten av sult pad selv om dette ikke er til hinder for noen uttørking i sentrale områder av puten. En annen begrensning er at fremgangsmåten ikke er helt kvantitativt. I encellede organismer er det mulig å plassere ballen hendelser per celle (for eksempel mengden av celler inneholdende GFP i vakuolen). I motsetning til dette, P. chrysogenum som en trådformede sopp er charactehovedservice-- av en flercellet arkitektur. Celler blir dividert med septae som inneholder en sentral pore som tillater passasje av cytoplasma og organeller. Derfor prøver kan bare analyseres "semi kvantitativt '(f.eks antall hyfer inneholder GFP lokalisert til vakuoler). For å oppnå betydning er det meget viktig at antall hyfer analyseres er høy nok (minst 80 per tidspunkt og tilstand testet, men mer er definitivt å foretrekke).

Utnyttelsen av sult pads for å studere autofagi kan enkelt tilpasses for bruk i andre trådformede sopper. Derfor er den protokoll som presenteres her er ikke bare begrenset til P. chrysogenum. Det bør også være mulig å tilpasse den for med encellet sopp, dvs. gjær. Overføring av protokollen til høyere organismer (f.eks nematoder) krever nok mer spesialiserte tilpasninger. Det vil være interessant å se om metoden som er beskrevet i dette arbeidet finner ogsådens anvendelse på andre områder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope slides with central cavity Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany H884.1 These can be used multiple times after cleaning.
Glass beads Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany A553.1 Diameter: 0.25 - 0.50 mm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fischer, F., Hamann, A., Osiewacz, H. D. Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways. Trends Biochem. Sci. 37 (7), 284-292 (2012).
  2. Pollack, J. K., Harris, S. D., Marten, M. R. Autophagy in filamentous fungi. Fungal Genet. Biol. 46 (1), 1-8 (2009).
  3. Scheckhuber, C. Q., Osiewacz, H. D. Podospora anserina: a model organism to study mechanisms of healthy ageing. Mol. Genet. Genomics. 280 (5), 365-374 (2008).
  4. Pinan-Lucarré, B., Iraqui, I., Clavé, C. Podospora anserina target of rapamycin. Curr. Genet. 50 (1), 23-31 (2006).
  5. Kikuma, T., Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K. Functional analysis of the ATG8 homologue Aoatg8 and role of autophagy in differentiation and germination in Aspergillus oryzae. Eukaryot. Cell. 5 (8), 1328-1336 (2006).
  6. Pinan-Lucarré, B., Balguerie, A., Clavé, C. Accelerated cell death in Podospora autophagy mutants. Eukaryot. Cell. 4 (11), 1765-1774 (2005).
  7. Veneault-Fourrey, C., Barooah, M., Egan, M., Wakley, G., Talbot, N. J. Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus. Science. 312 (5773), 580-583 (2006).
  8. Bartoszewska, M., Kiel, J. A., Bovenberg, R. A., Veenhuis, M., van der Klei, I. Autophagy deficiency promotes beta-lactam production in Penicillium chrysogenum. Appl. Environ. Microbiol. 77 (4), 1413-1422 (2011).
  9. Meijer, W. H., et al. Peroxisomes are required for efficient penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum. Appl. Environ. Microbiol. 76 (17), 5702-5709 (2010).
  10. Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A., Tsien, R. Y. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends Biochem. Sci. 20 (11), 448-455 (1995).
  11. Jung, C. H., Ro, S. H., Cao, J., Otto, N. M., Kim, D. H. mTOR regulation of autophagy. FEBS Lett. 584 (7), 1287-1295 (2010).
  12. Hickey, P. C., Read, N. D. Imaging living cells of Aspergillus in vitro. Med. Mycol. 47, Suppl 1. S110-S119 (2009).

Tags

Mikrobiologi sult fornedrelse autofagi mikroskopi mikroskop sklie hulrom sopp,
Analyse av Autophagy i<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Ved hjelp av Sult Pads i kombinasjon med Fluorescensmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scheckhuber, C. Q. Analysis ofMore

Scheckhuber, C. Q. Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (96), e52577, doi:10.3791/52577 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter