Introduction
Los hongos filamentosos son excelentes sistemas modelo para el estudio de los procesos de desarrollo. Ofrecen varias ventajas experimentales como el cultivo barato, un alto número de progenie y accesibilidad genética. El último punto es de particular relevancia para la construcción de los transformantes que permiten investigar la importancia de los genes tan lejos no caracterizados por diversos mecanismos celulares. Los hongos filamentosos han sido instrumentales para el esclarecimiento de varios elementos y mecanismos de control de calidad de las vías celulares como actividad de la proteasa de la degradación de proteínas aberrantes, dinámica mitocondrial para mantener la integridad mitocondrial y la autofagia para la eliminación de los excedentes y / o componentes de células disfuncionales y para mantener la viabilidad celular en tiempos de 1,2,3 inanición.
Hay varias técnicas experimentales disponibles para el estudio de la autofagia en hongos filamentosos 2: (i) la investigación de vacuolas if que contienen cuerpos densos autofágicos cuando proteasas son inhibidas por microscopía electrónica de transmisión 4, (ii) la visualización de autofagosomas de seguimiento de focos-GFP Atg8 a través de microscopía de fluorescencia de 5,6 y (iii) la detección de estructuras autophagosomal acidificados mediante el uso de la monodansyl cadaverina colorante fluorescente 7.
Aquí, se presenta un nuevo método de cultivo de Penicillium chrysogenum para los estudios de la autofagia. El elemento principal es el "cojín de hambre", que consiste simplemente en agarosa al 1% disuelto en el agua del grifo esterilizada. Los compuestos adicionales (por ejemplo, factores de estrés, carroñeros, moduladores de la autofagia) se pueden añadir a la almohadilla, siempre y cuando no se muestran auto-fluorescencia. La almohadilla se encuentra en portaobjetos de microscopio que contienen una cavidad central de poca profundidad. Esta almohadilla en inoculadas con una suspensión de esporas o con pequeños fragmentos de micelio. Este último es aconsejable si la cepa de interés no sporulate eficiente (por ejemplo, cepas ATG1 Δ 8). Los portaobjetos se colocan en cámaras húmedas (estos pueden ser fácilmente construidos mediante el uso de cajas de puntas de pipeta vacías) para evitar la desecación de la muestra y se incubaron a temperatura ambiente. P. chrysogenum es capaz de crecer durante unos días en estas condiciones. La autofagia puede observar microscópicamente por la ampliación vacuolar que es un marcador positivo para la autofagia hongos. En esta contribución, una P. chrysogenum cepa (Wisconsin 54-1255) se utiliza que forma la proteína verde fluorescente que se dirige a los peroxisomas por su secuencia C-terminal 'SKL' 9. Por lo tanto, es posible monitorizar la degradación de los peroxisomas. Es factible etiqueta también otros compartimentos de la célula (por ejemplo, mitocondrias) mediante el uso de señales de localización apropiadas y analizar su degradación. Aunque los datos de P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) se presenta aquí, sin duda es posibleutilizar el método de 'almohadilla de hambre "también para otros hongos filamentosos (por ejemplo, Neurospora crassa, macrospora Sordaria, especies de Aspergillus, etc.).
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Protocol
1. Preparación de P. chrysogenum para los experimentos de hambre
- Si el P. chrysogenum cepa de interés se mantiene en el arroz ('arroz verde'), coloque 2-3 granos de arroz cubiertas con esporulación micelio en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Rellenar con 500 l YGG (10 g / l KCl, 20 g / l de glucosa, 10 g / l de base nitrogenada de levadura, 5 g / l K 2 HPO 4, 20 g / l de extracto de levadura).
- Vortex el tubo durante 30 segundos de modo que las esporas pueden desprenderse del arroz de manera eficiente.
- Incubar el tubo durante 1 día a temperatura ambiente (por ejemplo, entre 20 y 25 ° C).
- Preparar una dilución 1/50 de esta suspensión de esporas en el agua del grifo estéril, mezclar bien.
- Si el P. chrysogenum cepa de interés se mantiene en una placa de agar (por ejemplo, la placa de agar YGG), transferir pequeños trozos de micelio en un tubo de 1.5 ml contiene 400 l de agua corriente estéril y aproximadamente 100 mg glperlas culo utilizando un palillo estéril o punta de la pipeta.
- Vortex el tubo durante 2 min para que el micelio se fragmenta. Utilice el contenido del tubo inmediatamente.
2. Pasos preparatorios para el cultivo de P. chrysogenum en Pads de hambre
- Encienda una placa calefactora y ponerlo a aproximadamente 60 ° C.
- Disolver 2 g de agarosa en 100 ml de agua del grifo por la cocción de la solución en un horno de microondas. Tenga cuidado de que esta solución es del todo claro después del calentamiento. Si no lo es, cocinar de nuevo hasta que la agarosa se disuelve completamente. Deje que la solución de agarosa se enfríe a aproximadamente 60 ° C antes de su uso.
- Llenar 1,5 ml tubos de microcentrífuga (2-4, dependiendo del número de muestras) con 400 l de agua corriente estéril cada uno (no hay compuestos adicionales añadidos) o 400-x l (adición de x l de solución de compuesto en el paso 2.5) y colocarlos sobre la placa de calentamiento durante al menos 1 min de manera que el water el interior se calienta.
- Colocar los portaobjetos de microscopio que contienen una cavidad central en la placa de calentamiento durante al menos 1 min.
- Añadir 400 l 2% de agarosa a la solución en los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y vortex brevemente. Después de este paso, si se desea, añadir compuestos adicionales (es decir, de rapamicina 1 mM). Si esto se hace, vórtice brevemente después de cada sustancia adicional se pipetea al tubo. Ponga los tubos de nuevo sobre la mesa la calefacción para evitar la solidificación prematura.
NOTA: El volumen total en el tubo de microcentrífuga debe ser de 800 l.
3. Preparación de preparaciones microscópicas contiene electrodos de inanición
- Pipeta 140 l de la solución de agarosa en la cavidad del portaobjetos de microscopio (que aún se encuentran en la placa de calentamiento). Trate de evitar hacer burbujas si es posible.
- Inmediatamente coloque una hoja de cubierta en la solución de agarosa.
NOTA: Esto resultará en una superficie plana. - Ponga el microdiapositiva alcance sobre la mesa de laboratorio durante unos 4 minutos para permitir que la almohadilla de agarosa se solidifique.
- Retire con cuidado el cubreobjetos de la almohadilla de agarosa deslizándolo con la ayuda de un pulgar o el dedo índice (usar guantes para evitar la contaminación!).
- Colocar el portaobjetos con la almohadilla en una cámara húmeda para evitar la desecación. Recomendación: Utilice una caja de propina vacío que todavía tiene el inserto para la celebración de las puntas de pipeta. Añadir agua estéril a la caja de modo que el fondo está cubierto. Colocar los portaobjetos de microscopio en el inserto y cerrar el cuadro.
4. Inocular los Pads de hambre con P. chrysogenum e Incubación
- Pipeta 5 l de la dilución 1/50 de esporas (si los cultivos se hicieron crecer en el arroz) o 5 l de la solución no diluida que contiene fragmentos de micelio (si los cultivos se cultivaron en una placa de agar) en el centro de la almohadilla inanición.
- Cerrar la cámara húmeda y envolverlo en una bolsa de plástico (esto sirve comoprotección adicional contra la desecación de las pastillas de hambre). Tenga cuidado de no mover el cuadro demasiado, porque de lo contrario se verá afectado las gotas de inoculación.
- Almacenar la caja envuelta a temperatura ambiente durante al menos 20 h antes de analizar las muestras.
5. Análisis microscópico de las muestras
- Después de 20 h de incubación, las muestras están listas para el análisis microscópico; puso el portaobjetos en un pañuelo de papel seco (el fondo tiende a convertirse en húmedo).
- Pipetear un pequeño volumen de agua (aproximadamente 50 l) en la almohadilla de inanición. Ponga un cubreobjetos sobre la almohadilla y exprima el exceso de agua. Eliminar el agua sobrante con un pañuelo de papel.
- Coloque el portaobjetos de microscopio sobre la mesa de observación del microscopio de fluorescencia. Para tener una visión general de crecimiento del micelio, utilice un objetivo 20X. Uso 63X o 100X objetivos para el estudio de la localización de las buenas prácticas agrarias en las hifas. Con el fin de evitar la desecación gradual de la muestra no analizar las muestras demás de 15 minutos antes de volver a ponerlos en la cámara húmeda.
- Repita 5,3 a intervalos regulares (por ejemplo, después de 40 horas y 60 horas de crecimiento).
NOTA: La muestra se puede poner de nuevo en la cámara húmeda. No es necesario retirar el cubreobjetos, ya que no afecta el crecimiento del micelio.
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Representative Results
Para demostrar la utilidad del protocolo detallado anteriormente degradación de peroxisomas en el P. Se analizó chrysogenum cepa Ws54-1255 (GFP-SKL). En esta cepa GFP-SKL generalmente se importa en los peroxisomas 9. Esto da lugar a la aparición de múltiples formas esféricas cuando se analiza la muestra a través de microscopía de fluorescencia. Si se produce la autofagia, las vacuolas se agrandan. GFP-SKL se incorpora en vacuolas por autofagia (pexophagy). Debido al hecho de que la GFP es resistente a la degradación por proteasas de vacuolas que etiqueta estos orgánulos 10. Por lo tanto los dos parámetros para la observación de la autofagia (pexophagy) en esta cepa, la ampliación vacuola y localización de GFP-SKL a vacuolas, se controlan convenientemente por microscopía de fluorescencia.
En 20 horas de incubación, GFP nunca se observa en las vacuolas (Figura 1). Además, la ampliación vacuola no está teniendo lugar. Sin embargo, a 40 horas de crecimiento vacuolas GFP-etiquetadoshacerse visibles en algunas de las hifas, lo que indica la autofagia (pexophagy) para convertirse en activa (Figura 1). A 60 horas de crecimiento de la cantidad de vacuolas GFP-etiquetados ha aumentado aún más. Como control negativo un atg1 mutante Δ de P. chrysogenum se utilizó (atg1 Δ (GFP-SKL)) (Figura 2). Ni vacuolas agrandados ni GFP-etiquetados se pueden observar en esta cepa. Como control positivo, el fármaco rapamicina autofagia estimulante se utiliza (Figura 3). Después de 40 h de crecimiento vacuolas GFP-etiquetados se hacen visibles. En 60 horas, las hifas están completamente llenos de enormes vacuolas que contienen GFP (Figura 3). Este hallazgo indica que, como se esperaba, la autofagia masiva tiene lugar aquí. En conjunto, estos resultados demuestran la validez de la configuración experimental.
Figura 2:. La localización de GFP-SKL en Δ atg1 (GFP-SKL) durante el cultivo en las almohadillas de hambre en los tiempos indicados, las culturas crecido en los cojines de hambre se analizaron mediante microscopía de fluorescencia. Se muestran imágenes representativas para cada punto de tiempo. Correspondiente zonas de campo claro se muestran debajo de cada fluorescenciaimagen del canal. Las barras de escala: 10 m. 
Figura 3:. La localización de GFP-SKL en Ws54-1255 (GFP-SKL) tratados con rapamicina para la inducción de la autofagia En las culturas tiempos indicados cultivadas en almohadillas de hambre suplementado con 1 mM rapamicina se analizaron mediante microscopía de fluorescencia. Se muestran imágenes representativas para cada punto de tiempo. Correspondientes áreas de campo claro se muestran cada imagen canal de fluorescencia a continuación. Blanca "v": GFP-SKL localiza en vacuolas que indican la degradación de peroxisomas. Las barras de escala: 10 m.
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Discussion
El método aquí presentado permite el estudio conveniente y reproducible de la autofagia en P. chrysogenum. Por ejemplo, puede ser utilizado para el cribado de la eficacia de diversos compuestos si son capaces de modular la respuesta autofagia de este hongo o no. Los resultados con rapamicina demuestran que la inhibición de la señalización de TOR conduce a una inducción pronunciada de la autofagia en P. chrysogenum que también ha sido demostrado para otros organismos 11.
Es posible usar micelios cultivados en almohadillas de hambre para el análisis en los microscopios más sofisticados (por ejemplo, microscopios de barrido confocal láser). No importa si se pone la muestra por debajo del objetivo de encima del objetivo (microscopio invertido). Diversas proteínas fluorescentes dirigidos a determinados compartimentos se pueden utilizar para controlar el destino de diferentes orgánulos durante la autofagia (por ejemplo, las mitocondrias -> mitofagia; r endoplásmicoeticulum -> ER-Fagia, etc).. En resumen, la técnica descrita aquí se extiende el espectro de métodos para estudiar microscópicamente hongos 12.
El protocolo es generalmente sencillo y fácil de usar. Sin embargo, es muy importante que las almohadillas de hambre nunca se secan ya que esto dará lugar a artefactos y la muerte celular. Por lo tanto se sugiere fuertemente que (i) los portaobjetos de microscopio que contienen la solución de agarosa todavía líquido se retiran inmediatamente de la placa de calentamiento (paso 3.3), (ii) que la hoja de la cubierta para la fabricación de una superficie plana se elimina de la almohadilla de hambre después de una máximo de 5 min (pasos 3.3 y 3.4), (iii) que el portaobjetos de microscopio se mantiene siempre en la cámara húmeda cuando no analizado (pasos 3.5 y 5.4) y (iv) que el análisis microscópico no toma más de 15 min (paso 5.3). Otro aspecto importante es que el importe de partida de esporas o fragmentos de micelio pipeta sobre la almohadilla de hambre no debería ser demasiado alta odemasiado baja. Esto puede ser fácilmente controlado por dilución de la población mediante el uso de agua del grifo estéril. La dilución 1/50 se describe en 1.1.3 funciona bien para P. chrysogenum suspensiones de esporas. Es la dilución recomendada para el uso con nuestros hongos pero podría requerir algunos ajustes.
Una limitación de este método es que no es recomendable para los experimentos de imagen de lapso de tiempo de más de 15 min. Esto es debido a la desecación gradual de la almohadilla de la inanición una vez que se retira de la cámara húmeda. Si se necesitan tiempos de observación más largos, es posible añadir pequeñas cantidades de agua del grifo estéril a la periferia de la almohadilla de hambre aunque esto no impide que algunos desecación en las regiones centrales de la almohadilla. Otra limitación es que el método no es estrictamente cuantitativo. En los organismos unicelulares es posible marcar eventos por célula (por ejemplo, cantidad de células que contienen GFP en la vacuola). En contraste, P. chrysogenum como un hongo filamentoso es caractetorizado por una arquitectura multicelular. Las células se dividen por septos que contienen un poro central que permite el paso de citoplasma y orgánulos. Por lo tanto, las muestras pueden ser analizadas sólo 'semi cuantitativa "(por ejemplo, número de hifas que contiene GFP localizada a vacuolas). Para alcanzar la significación es muy importante que el número de hifas analizado es lo suficientemente alta (por lo menos 80 por punto y condición probada pero más tiempo está definitivamente preferible).
La utilización de almohadillas de hambre para el estudio de la autofagia se puede adaptar fácilmente para su uso en otros hongos filamentosos. Por lo tanto el protocolo presentado aquí no se limita sólo a P. chrysogenum. También debe ser posible adaptar para con los hongos unicelulares, es decir, levaduras. Transferencia del protocolo para los organismos superiores (por ejemplo, nematodos) probablemente requiere adaptaciones más especializados. Será interesante ver si el método descrito en este trabajo también encuentrasu uso en otros campos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope slides with central cavity | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | H884.1 | These can be used multiple times after cleaning. |
| Glass beads | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | A553.1 | Diameter: 0.25 - 0.50 mm |
References
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