Summary
マウス脊髄を撮像するための新規のex vivo調製。このプロトコルは、脊髄全体生細胞の相互作用の二光子イメージングを可能にする。
Introduction
neuroadaptedマウス肝炎ウイルス（MHV）による実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）、および頭蓋内感染を含む脱髄のマウスモデルは、疾患に関連した分子経路と細胞の相互作用を研究するための優れたツールである。彼らはにつながったとFDAの有効性は、主に自己免疫および炎症1の停止をターゲットに、医薬品の治療法を承認しサポートしてきました。内因性の再ミエリン化が失敗したしかし、一度、現在承認されている治療法は効果的に中枢神経系の脱髄病変を修復しないでください。したがって、疾患のこの段階で修復に焦点を当てた治療は、慢性症状および生活の質の向上の軽減のために重要である。最近では、神経前駆細胞（NPCの）は、炎症および脱髄の領域をターゲットとする潜在的な再生治療法として最前線になってきた。いくつかの研究がendogenoを誘導するのNPCの能力を強調している私たちは、再ミエリン化及び再ミエリン2-8に直接参加。 NPCは、直接再ミエリン化に関与しているので、移植後の内因性の細胞とそれらの速度および相互作用を理解することが不可欠である。移植後、NPCはその後吻側および尾側移植部位5,9に比べて、白質損傷の領域に腹移行する。移行の動力学は、環境信号に応答して異なる。非損傷した脊髄に移植されたNPCは、損傷した脊髄6に移植したNPCよりも大きな速度を持っている。遊走期間の後、無傷の脊髄6に損傷した脊髄相対的に高いレートで、NPCは広範囲に増殖移した。最後に、NPCはの大半はオリゴデンドロサイトに分化し、直接再ミエリン化の4,6,9を開始する。
脱髄病変は複雑であり、種々の段階での細胞の多様な集団を含むことができctivation。例えば、活性多発性硬化症（MS）、病変は、活性化T細胞、M1ミクログリア及びM1マクロファージの有意な集団を含んでもよいが、慢性の無音MS病変は、いくつかの炎症性細胞が10-13との反応性星状細胞から主に構成されてもよい。そのためエフェクター細胞の多様性、脱髄のマウスモデルにおける二光子（2P）イメージングは、病変内のローカルな細胞間相互作用を理解するための非常に便利なツールです。 MSと多くの広く使用MS研究モデルでは、病変の大部分が起因する病変の深さおよび脊髄の高い脂質含量に脊髄、生体内の2Pのイメージングにアクセスできない領域の腹側に配置されている。腹側脊髄に沿って病変内のこれらの問題及び試験細胞-細胞相互作用を回避するために、我々は、ex vivoでの2P撮影準備6簡単に開発した。
この研究は示した以前の方法パブリケーションを、フォローアップMHV誘発性脱髄14のJHMV株後のマウスの脊髄に強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）発現のNPCを移植するための手順。ファイブ週齢のマウスはJHMVに感染させ、14日目、感染後に胸部レベル9でのeGFP-のNPCを移植している。ここで紹介するプロトコルは、ex vivoでアガロース準備をし、脊髄を抽出し、強化黄色蛍光タンパク質（EYFP）発現性軸索の画像、移植のeGFP-NPCの相互作用する方法についての詳細な手順を提供しています。神経細胞特異的はThy1プロモーター下のeYFPを発現するマウスは、この手順15で使用した。唯一の軸索のいくつかは、個々の軸索を画像化するためには有用なもの、のeYFPを発現する。ここでは、7日後に移植に除去脊髄を表示。しかし、脊髄移植後の任意の時点で抽出することができる。我々は、損傷軸索でのNPCの相互作用を示しているが、我々のプロトコルは、遺伝子の蛍光マーカーと組み合わせて使用することができるマウス脊髄全体に生じる細胞相互作用の多くを調査するために、他の種類の細胞。
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Protocol
注：倫理声明：動物の取り扱いのためのプロトコルは、カリフォルニア、アーバイン、プロトコル＃2010から2943の大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認された。
脊髄の1の除去
- チャンバーを安楽死で約100％の液体イソフルラン、USPで湿らせた紙タオルを置き、上に乾燥紙タオルを置きます。マウスはイソフルランに触れていないので、乾燥紙タオルの上にチャンバー内にマウスを置き、チャンバーが覆われていることを確認してください。マウスを安楽死されることを保証するために呼吸停止後、少なくとも1分待ってください。
- マウスを安楽死されていることを確認するために、首の脊髄離断を実行します。これは脊髄を損傷する可能性がある頸椎脱臼を実行しないでください。
- 毛髪を湿らせ、70％エタノールでマウススプレー。
- 1（C1約頚椎椎弓から脊柱を露出するために、マウスの背面から髪や皮膚を除去するために、鋭いファインはさみを使用してください））仙骨ラミナ4（S4へ。
- ＃10ブレードを用いてメスを用いて、筋肉および脂肪からそれを分離するために、脊柱の左右に切開を行う。これは、脊髄の除去がより簡単になります。
- オプション：湾曲したルアー骨鉗子は、追加の肉を離れてすくうために使用することができます。
- 鋸歯状グレーフェ鉗子と脊椎骨の上部を押しながら、脊髄に触れないように注意しながら、C1で露出脊柱に湾曲した面を上にしてチタン湾曲Vannasはさみを挿入します。
- すべての道を右にVannasはさみ湾曲したチタンをスライドさせ、一つの小さなカットを作る。小さなクランチ音が聞こえとハサミは脊椎骨を切るように感じられるはずです。コードの左端にあるこのカットを繰り返します。これはハサミでコードを傷つけ危険にさらすようにあまりにも速く行くか、カットの大きすぎ行うことがないように注意してください。
- シングルラミナは、脊椎の側がカットされたら、ピンセットで持ち上げてすることができるはずです。 R保持し、脊髄脊椎骨を引き戻すために続けて、S4まで、各ラミナのために、この手順をEPEAT。
注：それは移植部位に削減されると、移植部位上記の脊椎骨はおそらく外れます。ただ移植部位の下に開始する手順を続行します。 - オプション：移植部位への吻側および尾側20ミリメートル〜移植部位がどこにある見て、測定し、カットする上下の椎骨を築く。
注：より一般的には15ミリメートルよりも遠くに移動しない移植したNPCとして必要されることはありませんのNPCを移植する。必要な脊髄の量は、移植された細胞型の実験および移動特性に依存する。移植部位に等距離で吻側および尾側のカットを作ることは撮像中に、より容易に位置するように移植部位を可能にします。 - ＃11ブレードとメスを用いて慎重に右の神経節をカットし、吻端から始まる脊髄の腹側の左。このW病気より簡単に腹側の椎骨から削除する脊髄を可能にする。
注：迅速に行う（1.7から1.11ステップ）、脊髄が完全に乾くことはありません。しかし、1×PBSで湿ったそれを維持するコードに投与することができる。 - マウスを反転ので、脊髄を下に向けているマウスをホールドアップ。慎重に閉じられた鋸歯状グレーフェ鉗子を使用して脊髄をはがします。脊髄をニッキングすることなく、慎重に脊髄が単一の完全な部分で持ち上げることができるように、残りの神経節をカット。
- 脊髄はRPMI-1640であることを確認しますと2P顕微鏡への輸送のために氷の上に置きます。
イメージングのための脊髄の調製
- アガロースで脊髄を埋め込む
- イメージングの前に氷上で冷却RPMI-1640中で孤立した脊髄を保管してください。
- アガロース（低ゲル化温度）を秤量し、1×PBS、5mlの5％溶液を調製する。 agに溶解させる15秒間の5％アガロース溶液をマイクロ波起きて、37℃に冷却ソリューションを聞かせて。
- 腹側を上に向けてパラフィルムのシート上に配置することによって脊髄を準備します。
- ピペット脊髄の腹側の上の5％アガロース溶液の約5 mlである。アガロースは室温に冷却することにより固化するましょう。完全な凝固は約5分かかります。
- 22ミリメートルの正方形カバースリップに組織接着剤の薄手のコートを適用します。
- パラフィルム上の腹側を配置、埋め込み脊髄を反転。背側は今まで直面するであろう。背側にカバースリップを接着し、接着剤を固化するRMPIアガロース埋め込み脊髄/カバースリップの準備を沈める。過剰にカミソリの刃を用いてアガロースを固化し削除します。
- 顕微鏡ステージ上の脊髄のマウント
- カバースリップの底にワセリンを適用します。これは、灌流中に準備を安定します。
- 脊髄調製物を置く腹側は25X浸漬目標に向かって上向きにして顕微鏡ステージでよく撮影する。特注のイメージングウェルが約20ミリメートル、50ミリメートル、深長く、そして全体で50ミリメートルである。
- 画像、温めた（37℃）で酸素準備をsuperfusingながら、血清を含まないRPMI-1640培地（95：二酸化炭素、カルボゲン：5酸素）。
- 水浴中で37℃に前加温メディアおよびメディアボトルにチューブを挿入することにより、チューブポンプに接続する。
- チャンバーへのチューブの接続部で37℃、加熱装置における媒体温度を保持します。ウェルで3 ml /分を通してSuperfuse媒体はチューブポンプ（ 図1B）に接続されたチューブを使用。
腹側脊髄の3 2Pイメージング
- 顕微鏡のセットアップ
- 900nmのチューニングサファイアレーザー：カメレオンウルトラチタンを使用してはThy1-のeYFP脊髄から画像を取得する。レーザパワーを減衰させる<5％の試料は、最小限の毒性16を確保する。安定した画像形成を確実にするために、組織ドリフト及び細胞の損傷を防止するために、単一のインライン液ヒーターを用いて一定の37℃での酸素灌流RPMI-1640を灌流することによって温度を維持する。
- のeGFPとのeYFP蛍光信号を分離するために、意図的に視認性を高めるために緑色発光を分割する3つのチャネルに2P発光を分離するために直列に520 nmの単一エッジダイクロと560nmの単一エッジダイクロイックビームスプリッタを配置する。
注：これらのチャネルは、青緑色（発光<520 nm）を、（520〜560 nm）の黄緑色、および赤色（発光> 560nmの）と呼ばれる。光電子増倍管は、各チャネルに放出された光を検出する。
- 関心の撮像領域の検索
- 接眼レンズと明視野光源を用いて、基準点を設定するために、脊髄の腹側縁に浸漬対物レンズの焦点を合わせる。
- 必ず周囲の光源がオフとSWであることを確認してくださいレーザシャッタを開くことによって2P励起かゆみ。
- 利用可能な場合は関心のある分野のための組織を検索する際に、より低い解像度の設定、デジタルズームのない高いボリューム、および最終的な画像を取得するときよりも高いスキャンレートを使用しています。関心領域のための組織を検索このシステムの典型的な設定は次のとおりです。解像度：256ピクセル。ボリューム：X = 600ミクロン、Y =600μmで、Z = 0〜300程度である。
- 脊髄の腹側縁の近くのEYFP軸索を観察します。コラーゲン（青）からの第2高調波信号は、脊髄組織のエッジで最も明るくなります。ちょうどコラーゲンからの第2高調波信号に背とのeYFP信号が黄緑色のチャンネルで可視化されたEYFP軸索の位置を確認します。
- 脊髄準備14の長手方向の中央に移植部位の位置を確認します。のeGFP-NPC移植後のマウスの1日の場合は、深部組織へのz平面内のビーム経路を中心に移植部位を見つけます。移植サイトのWiLL動物間で若干異なるが、一般的には腹側の縁から〜200μmの位置しています。 1日目移植後後のマウスにおける腹側と横方向縁部に近い、白質路におけるEGFP-のNPCのクラスターを観察します。
- 最終的な画像を取得する
- 512ピクセルの画像の解像度を取得。ボリューム：X = 270ミクロン、Y = 212ミクロン、及びSlidebook 6ソフトウェアを使用して、Z =100μmである。 2.5ミクロン単位でシーケンシャル焦点面を取得することで、Zスタックをコンパイルします。
- 脊髄内の任意の移行オブジェクトの迅速な定量化を確実にするためにオフセット適切なインターレースとの双方向スキャンを実行します。脊髄内の細胞の速度を決定するのに理想的な取得フレームレートは約1フレーム/秒であることを確認してください。
注：イメージング設定は、取得フレームレート、撮像分解能と撮像ボリュームとして個々のユーザの好みに変更することができる。より大きな画像ボリュームは、一般的にGIVで取得するために時間がかかります解像度EN。 - そのようなビットプレーンIMARIS 7.7などの画像解析ソフトウェアを使用して、分析する作物、滑らか、かつ疑似Slidebook画像ファイル。 SlidebookとIMARISで自動化されたプロセスを使用して、連続した画像化ボリュームをコーミングすることにより、最終的なタイムラプスビデオを制作。
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Representative Results
外植脊髄イメージングプロトコルは、脊髄内の任意の蛍光を可視化するために使用することができるが、我々の代表的な結果は、軸索のeYFPでのeGFP-NPCの相互作用を実証する。まず、 図1Aに埋め込 まれた腹側脊髄の調製を示す。次に、2P顕微鏡のセットアップおよび図1Bにおける主要構成要素を示す。 図2は、腹側脊髄内の単一zスタックにおけるEGFPとのeYFPの蛍光を示しています。連続したZ-スタックの取得は無傷組織内のリアルタイム細胞の動態を解析するために時間経過動画を生成するためにコンパイルすることができます。プロトコールに記載されているように、520nmの単一エッジダイクロと560nmの単一エッジダイクロイックビームスプリッタを使用して、のeGFPとのeYFP信号を分離することができる。個々のチャネルは、イメージングソフトウェアを使用して、緑色と黄色の疑似カラーすることができる。
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図1：脊髄と顕微鏡のセットアップ。 （A）脊髄5％アガロースゲル（左）に包埋し、過剰のアガロース（右）を除去した後、カバースリップ上に搭載。（B）標識された主要なコンポーネントを有する顕微鏡セットアップの像。 1.水浴を37℃に設定してください。 2.予め温めRPMI-1640。 3. C / L変速チューブポンプ。 4.シングルインラインソリューションヒーター。 5.浸漬目的。 6.デジタル温度計。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：例2P画像は腹側脊髄の内部に取得し 、感染していない、未損傷の（A）の腹側とJHMV感染、脱髄（B）脊髄の3次元再構成を。のeGFP標識のNPCとの移植後はThy1-のEYFPマウスから。蛍光標識された軸索は黄色疑似カラーされ、NPCは緑色の疑似カラーされている。画像解像度：512ピクセル。画像ボリューム（A）は、x = 239ミクロン、はy = 259ミクロン、zは=65μmの26のzスタックを使用して構築さ2.5μm離れて（B）は、x = 497ミクロン、のy = 389ミクロン、のz = 127.5ミクロンで用いて構築離隔51のzスタックは、2.5μmの間隔をあけ。
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Discussion
無傷組織のリアルタイム2Pイメージングは脱髄マウスの脊髄に移植後NPC動態との相互作用を調査する必要がある。生体2Pイメージングは、一般的に生きているマウスにおける脊髄の背側の携帯動力学を決定するために使用され、疾患17-19脱髄に背脱髄を研究するために使用されてきた。移植されたNPCは、2P顕微鏡を使用してその場で画像の深すぎる位置する腹側白質への移行しかし、 エクスビボで準備が必要である。この方法論は、損傷を受けたと非損傷した脊髄6に移植したNPCの運動性と再ミエリン動態を決定するために、私たちの研究室で使用されてきた。 エクスビボ準備が腹側6,20からだけでなく縦方向にも横方向に脊髄のスキャンを有効に。これは、tにおける細胞運動（速度及び方向）の違いや相互作用の分析を可能にする移植部位に隣接し、かつ移植部位6からの様々な距離でransplant部位。我々は最初に、脊髄の腹側のeGFP-NPCを移植した画像にこの製剤を考案し、一方、それは、画像を形成するために使用することができる任意の蛍光標識又は腹側、背側からの染色された細胞、または側面脊髄で向きを変えることにより取り付けられた。生体内イメージングに対するこの準備の利点は、腹側イメージングを可能にし、麻酔と生存手術の必要性を欠いている、まだ繰り返し手術19,21ずに複数の画像化セッションを可能に「ガラス窓」の設定を使用して、新しい生体内の準備で必要とされるが含ま。これは、脊髄が除去されるので、生体内画像化と組み合わせた「ガラス窓」アプローチと比較して、この手順の一つの制限は、単一のマウスから複数の時間点を得ることができないことであることに留意すべきで、マウスを安楽死さ。
2Pイメージングは、無傷の組織22,23内の単一細胞のダイナミクスを解決するための理想的に適しています。 2P励起は、最小限の光毒性を持つ深部組織イメージングの長時間を可能に近赤外光子を利用しています。 2P励起はフォアことにより、2つの光子の同時吸収時に起こる。 2P励起のために必要な光子の高濃度は、単一の焦点面に2Pレーザ出力の時空間圧縮することによって達成される。これにより、焦点面の外側の脊髄の領域に光毒性を最小限にする、焦点に蛍光励起を制限する。近赤外光子はまた、脊髄16の腹側から約300μmのイメージングを可能にする、散乱が減少している。
すべての新しい技術と同様に、しかし、外植された脊髄の2Pイメージングは留意しなければならない限界がある。このイメージングプロトコルは、520 nmのダイクロを利用一般的に青色光のために予約蛍光チャネルにeGFPの放射を流用してEGFPおよびのeYFP蛍光の分離が可能ICミラー。脊髄にコラーゲンによって作成された第二高調波発生はまた、青のチャンネルに表示されますが、この準備でかなり明るいのeGFP標識細胞から容易に区別され、黄緑色のチャネルにそれらの発光を特定できるの部分を持っているコラーゲンにはありません。チャネルブレンドおよび特定のダイクロイックを使用して発光スペクトルの異なる部分を分離するこの技術は、多くの場合、近いまたはほぼ重複する発光スペクトルを有する個々の蛍光体の視覚的または自動同定に有用である。光毒性は、この2Pイメージングプロトコルの別の制限です。単一の撮像ボリューム内の細胞は、光毒性に敏感である。そのため、実験者は、光毒性の兆候を強く認識する必要があります。光毒性は、一般的に減少または細胞の欠如の最初の明らかな運動性は、局所組織および/または形態学的変化を光退色させた。いくつかの要因が組織光毒性につながるか、生細胞イメージングには適さない、それをレンダリングに損傷を与えることができます。これは、灌流RPMI-1640のレーザパワーと温度と酸素化を監視することが重要である。これは、過度の伸張または脊髄の圧縮せずにブレードで脊髄を切断することなく、マウスからの脊髄の適切な除去を確実にするためにも不可欠である。適切に処理した場合、外植脊髄準備は10時間後の抽出に減ずることなく腹側脊髄内の強固な細胞運動性によって決定されるように、最大10時間の実行可能なままになります。抽出された組織の様々な一般的に時間の長い長さのために画像化し、実行可能な23〜26と考えられている。したがって、単一の脊髄内の複数の領域における細胞動態の定量化が可能である。最後に、細胞股関節の大半ことに留意すべきであるTは、蛍光（自然に自家蛍光ない限り）この準備によって可視化し、それが標識された細胞は、他の標識されていない、一見目に見えない内因性の細胞と構造要素の複雑な環境と相互に作用していることを認識することが重要であることはありません標識されていない。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care, Inc | N/A | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | sharp |
| scalpel blade #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Luer rongeurs | Fine Science Tools | 16001-15 | |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15615-08 | |
| scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 12-115F | |
| agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414-25G | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 1469SB | |
| 22 mm square cover slip | Fisher Scientific | 12-547 | |
| 25X dipping objective, 1.1 NA | Nikon | CFI Apo LWD 25XW | |
| Single inline solution heater | Warner Instruments | 64-0102 | |
| 520 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF520-Di02-25x36 | Brightline |
| 560 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF560-FDi01-25x36 | Brightline |
| photomultiplier tubes | Hamamatsu | R928 | |
| C/L variable-speed tubing pump | Masterflex | 77122-22 | |
| digital thermometer | Comar Instruments | 3501 | |
| Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser | Coherent | N/A | |
| Slidebook 6 software | 3i | N/A | |
| Imaris 7.7 software | Bitplane | N/A |
References
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