Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הדמיה שני פוטונים של Dynamics הסלולרי בחוט השדרה העכבר

Published: February 22, 2015 doi: 10.3791/52580
Automatic Translation
1, 2, 4, 3, 1, 5, 2
1Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine, 2Physiology and Biophysics, University of California, Irvine, 3Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine, 4University of California San Francisco Diabetes Center, University of California, San Francisco, 5Pathology, University of Utah

Summary

הכנה חדשה vivo לשעבר הדמיה חוט השדרה העכבר. פרוטוקול זה מאפשר לשני פוטונים הדמיה של אינטראקציות הסלולר בשידור חי בכל רחבי חוט השדרה.

Introduction

מודלים עכבר של demyelination, כוללים Encephalomyelitis הניסיוני אוטואימוניות (EAE) וזיהום תוך-גולגולתי עם וירוס צהבת עכבר neuroadapted (MHV), הם כלים מצוינים ללמוד מסלולים מולקולריים ואינטראקציות הסלולר הקשורים במחלה. הם הובילו ולתמכו ביעילות של ה- FDA אישרה טיפולי תרופות, בעיקר מיקוד הפסקת אוטואימוניות ודלקת 1. עם זאת, ברגע שחידוש יצירת המיאלין אנדוגני נכשל, הטיפולים שאושרו כרגע לא ביעילות לתקן נגעי demyelinated במערכת העצבים המרכזית. לכן, טיפולים ממוקדי תיקון בשלב זה של מחלה הם קריטיים להקלת סימפטומים כרוניים ושיפור איכות החיים. לאחרונה, תאים עצביים מבשר (NPCs) הגיעו לחזית ככלים טיפוליים משובי פוטנציאל להתמקד באזורים של דלקת ופגיעה במיאלין. מספר מחקרים הדגישו את היכולת של NPCs כדי לגרום endogenoשלנו חידוש יצירת המיאלין ולהשתתף באופן ישיר בחידוש יצירת המיאלין 2-8. בגלל NPCs מעורב בחידוש יצירת המיאלין ישיר, זה הכרחי כדי להבין קינטיקה ויחסי הגומלין שלהם עם תאי אנדוגני לאחר השתלה. לאחר השתלה, NPCs להעביר ventrally לאזורי נזק בחומר לבן, אז rostrally וcaudally ביחס לאתר ההשתלה 5,9. קינטיקה של הגירה שונה בתגובה לרמזים סביבתיים; יש NPCs הושתלו בעמוד השדרה פגוע שאינן מהירויות גדולות יותר מNPCs הושתלו בעמוד השדרה ניזוק 6. לאחר תקופה נודדת, הועבר NPCs להתרבות בהרחבה, בשיעור גבוה יותר בהשוואת חוט השדרה פגועה לחוט השדרה שלם 6. לבסוף, רוב NPCs להתמיין oligodendrocytes וליזום 4,6,9 חידוש יצירת המיאלין ישיר.

נגע demyelinated הוא מורכב ויכול לכלול אוכלוסייה מגוונת של תאים בשלבים שונים שלctivation. לדוגמא, נגע פעיל בטרשת הנפוצה (MS) עשוי לכלול אוכלוסייה משמעותית של תאים מופעלים T, מיקרוגליה M1 ומקרופאגים M1, אבל נגע MS שקט כרוני יכול להיות מורכב בעיקר של האסטרוציטים תגובה עם כמה תאים דלקתיים 10-13. בגלל המגוון של תאי מפעיל, הדמיה שני פוטונים (2P) במודלים של עכברים של demyelination היא כלי מאוד שימושי שיעזור להבין אינטראקציות הסלולר מקומיות בנגע. בטרשת נפוצה ומודלי מחקר MS שימוש נרחב רבים, רוב הנגעים נמצאים בצד הגחון של חוט השדרה, באזור שאינו נגיש להדמית 2P intravital בשל עומק נגע ותוכן שומנים הגבוה של חוט השדרה. כדי לעקוף בעיות אלה ואינטראקציות תא-תא מחקר בנגעים לאורך חוט השדרה הגחון פיתחנו לשעבר הכנת ההדמיה vivo 2P 6 פשוט.

מחקר זה עוקב אחר פרסום שיטות קודם, אשר הראההליך השתלת חלבון משופר ירוק ניאון (eGFP) NPCs -expressing לחוט השדרה של עכברים הבאים מתח JHMV של demyelination המושרה MHV 14. עכברים בן חמישה בשבוע שנגועים בJHMV ומושתל עם eGFP-NPCs ברמת בית החזה 9 ביום 14 לאחר פגיעה. הפרוטוקול המובא כאן מספק את צעדים מפורטים כיצד לחלץ את חוט השדרה, לעשות הכנת vivo לשעבר agarose, ואינטראקציות eGFP-NPC תמונה מושתלת עם חלבון משופר צהוב ניאון (EYFP) האקסונים -expressing. עכברים להביע EYFP תחת אמרגן Thy1 העצבי ספציפית שמשו בהליך זה 15. רק חלק מהאקסונים להביע EYFP, מה שהופך אותו לשימושי הדמיה אקסונים בודדים. כאן אנו מראים מיתרי השדרה הוסרו בשעה 7 ימים לאחר השתלה; עם זאת, ניתן לחלץ מיתרי השדרה בכל נקודת זמן לאחר השתלה. אמנם אנו מציגים אינטראקציות של NPCs עם אקסונים פגועים, הפרוטוקול שלנו יכול לשמש בשילוב עם סמני ניאון גנטייםשל סוגי תאים אחרים כדי לחקור מספר רב של אינטראקציות הסלולר מתרחשות ברחבי חוט השדרה העכבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הצהרת אתיקה:: הערה הפרוטוקול לטיפול בבעלי חיים אושרה על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) מאוניברסיטת קליפורניה, אירווין, פרוטוקול # 2010-2943.

1. ההסרה של חוט השדרה

  1. מניחים מגבות נייר רטובה עם ~ 100% isoflurane הנוזלי, USP בהרדמת חסד תא ולמקם את מגבות נייר יבשות על גבי. מניחים את העכבר בתא על גבי מגבות נייר יבשות כל כך העכבר לא נוגע בisoflurane ולוודא קאמרי מכוסה. חכה לפחות דקה אחת לאחר הפסקת הנשימה על מנת להבטיח כי העכבר הוא מורדמים.
  2. לבצע חיתוך רוחב השדרה של הצוואר כדי להבטיח את העכבר הוא מורדמים. אל תבצע נקע בצוואר הרחם כמו זה יכול לגרום נזק לחוט השדרה.
  3. תרסיס העכבר עם אתנול 70% להרטיב את השיער.
  4. השתמש במספרי פיין חדים כדי להסיר את השיער והעור מהחלק האחורי של העכבר כדי לחשוף את עמוד השדרה מכ צוואר רחם lamina 1 (C1) לlamina עצם העצה 4 (S4).
  5. באמצעות אזמל עם # 10 להב, לעשות חתכים בצד השמאל וימין של עמוד השדרה כדי להפריד אותו משריר והשומן. זה יגרום להסרת של חוט השדרה הרבה יותר קלה.
  6. אופציונאלי: rongeurs Luer מעוקל יכול לשמש כדי לגרוף את בשר נוסף.
  7. בעוד מחזיק את החלק העליון של חוליות עמוד השדרה עם מלקחיים גרפו משוננים, הכנס מספריים Vannas טיטניום עקומים, עם הצד המעוגל למעלה לתוך עמוד השדרה נחשף בC1, נזהר שלא לגעת בחוט השדרה.
  8. להחליק מספריים Vannas מעוקלים טיטניום כל הדרך לנכונה ולעשות חתך קטן אחד. קול מחנק קטן צריך להישמע והרגיש כמו המספריים לחתוך את החוליות. חזור על זה לחתוך בצד השמאלי של הכבל. היזהר שלא ללכת מהר מדי או להפוך גדול מדי של קיצוץ כמו זה יהיה לסכן את נזק לכבל עם המספריים.
  9. Lamina אחד אמור להיות מסוגל להיות הרים עם המלקחיים פעם ציד החוליות נחתכים. REPEAT שלב זה עבור כל lamina עד S4, ממשיך להחזיק ולמשוך בחזרה את חוליות עמוד השדרה.
    הערה: החוליות מעל אתר ההשתלה צפויה לבוא מפעם אחת שהוא כרת לאתר ההשתלה. המשך ההליך מתחיל ממש מתחת לאתר ההשתלה.
  10. אופציונאלי: להניח את החוליות למטה כדי לראות היכן אתר ההשתלה הוא ומידה ולחתוך ~ 20 מ"מ מקורי ואת הזנב לאתר ההשתלה.
    הערה: כאשר השתלת NPCs יותר לא יהיה צורך כNPCs המושתל בדרך כלל אינו נודד רחוק יותר מ- 15 מ"מ. הסכום של חוט השדרה הדרוש יהיה תלוי במאפייני ניסוי והגירה של סוג התא המושתל. ביצוע חתכים מקורי ואת הזנב, כי הם במרחק שווה לאתר ההשתלה יאפשר אתר ההשתלה להיות ממוקמים בקלות רבה יותר במהלך הדמיה.
  11. באמצעות אזמל עם להב # 11 לחתוך בזהירות את הגרעינים מימין ומשמאל לצד הגחון של חוט השדרה מתחיל בסוף מקורי. w זהחולה לאפשר את חוט השדרה להסרה מחוליות הגחון בקלות רבה יותר.
    הערה: בוצע במהירות (שלבים 1.7-1.11), חוט השדרה לא תתייבש. עם זאת, 1x PBS יכול להינתן לחוט כדי לשמור אותו לח.
  12. הפוך את העכבר והחזק את העכבר עד כה חוט השדרה פונה כלפי מטה. לקלף בזהירות את חוט השדרה באמצעות מלקחיים גרפו משוננים סגורים. בלי שסחב את חוט השדרה, לחתוך בזהירות כל הגרעינים שנותרו כדי לאפשר את חוט השדרה ליוסר בחתיכה אחת שלמה.
  13. ודא שחוט השדרה הוא בRPMI-1640 ולמקם אותו על קרח להובלה למיקרוסקופ 2P.

2. הכנת חוט השדרה הדמיה

  1. הטבעת חוט השדרה בagarose
    1. שמור את חוט השדרה המבודד בRPMI-1640 מקוררים על קרח לפני ההדמיה.
    2. לשקול את agarose (טמפרטורת gelling נמוכה) ולהכין פתרון 5% ב 5 מיליליטר של 1x PBS. מיקרוגל פתרון agarose 5% למשך 15 שניות כדי לפזר את agהתעורר ולתת הפתרון מגניב עד 37 ° C.
    3. הכן את חוט השדרה על ידי הצבתו על גיליון Parafilm עם הצד הגחוני פונה כלפי מעלה.
    4. Pipet כ 5 מיליליטר של 5% פתרון agarose על צד הגחון של חוט השדרה. בואו agarose לבסס על ידי קירור לטמפרטורת חדר. מיצוק מלא לוקח כ 5 דקות.
    5. החל בשכבה דקה של דבק רקמות ל-22 מ"מ להחליק את מכסה מרובע.
    6. הפוך את חוט השדרה המשובץ, הצבת צד הגחון על Parafilm. צד הגב עכשיו יהיה כלפי מעלה. לדבוק להחליק את המכסה בצד הגב, ולהטביע את הכנת agarose מוטבעת חוט / כיסוי השדרה להחליק בRMPI כדי לחזק את הדבק. להסיר עודפי הקרושה agarose באמצעות סכין גילוח.
  2. התקנת חוט השדרה על הבמה מיקרוסקופ
    1. החל וזלין לתחתית להחליק את המכסה. זה יתייצב ההכנה במהלך זלוף.
    2. מניחים את הכנת חוט השדרה בהדמיה גם על הבמה מיקרוסקופ עם הצד הגחוני פונה כלפי מעלה לכיוון מטרת טבילת 25x. גם ההדמיה שהותקן הוא כ 20 מ"מ עמוק, ארוך 50 מ"מ, 50 מ"מ ורוחב.
    3. תמונה תוך superfusing ההכנה עם התחמם (37 ° C), מחומצן (95: 5 חמצן: דו תחמוצת-פחמן carbogen) בינונית RPMI-1640 ללא סרום.
      1. תקשורת טרום חמה עד 37 מעלות צלזיוס באמבט המים ולחבר אותו למשאבת צינורות על ידי החדרת הצינור לתוך בקבוק התקשורת.
      2. שומר על טמפרטורת התקשורת על 37 מעלות צלזיוס מכשיר חימום בחיבור של הצינור לתא. תקשורת Superfuse דרך גם בשעה 3 מיליליטר / דקה באמצעות צינורות מחוברים למשאבת צינורות (איור 1).

3. 2P הדמיה של חוט השדרה הגחון

  1. התקנת מיקרוסקופ
    1. לרכוש תמונות מחוט שדרת Thy1-EYFP באמצעות Ti Ultra Chameleon: ספיר לייזר מכוון 900 ננומטר. להחליש כוח הלייזר בדגימה ל< 5% כדי להבטיח phototoxicity המינימלי 16. לשמור על טמפרטורה על ידי מרוסס-perfused חמצן RPMI-1640 בC 37 מעלות קבועות באמצעות תנור פתרון מוטבע אחת כדי להבטיח הדמיה יציבה, וכדי למנוע סחף רקמה ונזק לתאים.
    2. כדי להפריד אות ניאון eGFP וEYFP, למקם dichroic 520 ננומטר חד-קצה ומפצל קרן dichroic 560 ננומטר חד-קצה בסדרה להפריד 2P פליטה לשלושה ערוצים, בכוונה פיצול הפליטה הירוקה כדי לשפר את ראות.
      הערה: ערוץ אלה המכונה כחולים-ירוק (פליטה <520 ננומטר), ירוק-צהוב (520-560 ננומטר), ואדום (פליטה> 560 ננומטר). צינורות מכפיל לזהות נפלטו אור בכל ערוץ.
  2. אזורי הדמיה איתור של עניין
    1. שימוש בעינית ומקור אור בשדה בהיר, להתמקד במטרה הטבילה בקצה הגחון של חוט השדרה כדי לקבוע נקודת התייחסות.
    2. הפוך מקור אור הסביבה בטוחה כבוי וSWגירוד ל2P עירור על ידי פתיחת תריס הלייזר.
    3. אם זמין, בעת חיפוש רקמה לתחומי עניין, להשתמש בהגדרת רזולוציה נמוכה יותר, נפח גבוה יותר ללא זום דיגיטלי, וקצב סריקה גבוה יותר מאשר בעת רכישת תמונות סופיות. הגדרות טיפוסיות עם מערכת זו בעת חיפוש רקמה לאזור של עניין הן: רזולוציה: 256 פיקסלים; נפח: x = 600 מיקרומטר, y = 600 מיקרומטר, z = 0-300 מיקרומטר.
    4. שים לב לאקסונים EYFP ליד קצה הגחון של חוט השדרה. אות הרמונית שנייה מקולגן (כחול) תהיה בהיר בקצה רקמת חוט השדרה. אתר את האקסונים EYFP רק הגבו לאות ההרמונית השנייה מקולגן ואות EYFP היא דמיינה בערוץ הירוק-צהוב.
    5. אתר את אתר ההשתלה במרכז האורך של הכנת חוט השדרה 14. לעכברי יום 1 לאחר השתלת eGFP-NPC, לאתר את אתר ההשתלה, תוך התמקדות נתיב הקרן במישור z העמוקה לתוך הרקמה. Wi אתר ההשתלהll להשתנות מעט בין בעלי החיים, אבל בדרך כלל ממוקם ~ 200 מיקרומטר מקצה הגחון. שים לב לאשכולות של eGFP-NPCs בשטחי חומר הלבנים, קרוב יותר לקצות הגחון ורוחב בעכברים לאחר יום 1 לאחר השתלה.
  3. רכישת תמונות סופיות
    1. לרכוש רזולוציית תמונה של 512 פיקסלים; נפח: x = 270 מיקרומטר, y = 212 מיקרומטר, וz = 100 מיקרומטר Slidebook תוכנה באמצעות 6. לקמפל Z- ערימות על ידי רכישת מטוסי מוקד רציפים במרווחים של 2.5 מיקרומטר.
    2. לבצע סריקה דו-כיווני עם שרג הראוי לקזז כדי להבטיח כימות מהיר של כל חפצים נודדים בחוט השדרה. ודא שמסגרת שיעור הרכישה האידיאלית כדי לקבוע מהירות הסלולר בתוך חוט השדרה הוא כ 1 מסגרת / sec.
      ניתן לשנות את הגדרות הדמיה להעדפות של משתמשים שונים, כגון קצב רכישת מסגרת, רזולוציה הדמיה וכרכי הדמיה: הערה. כרכי הדמיה גדולים יהיו בדרך כלל לוקחים זמן רב יותר כדי לרכוש בGIVהרזולוציה en.
    3. לנתח, יבול, קבצי תמונת Slidebook חלק, וpseudocolor עם תוכנת ניתוח תמונה כגון Bitplane Imaris 7.7. להפיק קטעי וידאו הזמן לשגות סופי על ידי סירוק כרכי הדמיה ברציפות באמצעות תהליך אוטומטי בSlidebook וImaris.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעוד פרוטוקול ההדמיה חוט השדרה explanted יכול לשמש כדי לחזות כל הקרינה בתוך חוט השדרה, תוצאות הנציג שלנו להפגין אינטראקציות eGFP-NPC עם EYFP-האקסונים. ראשית, אנו מציגים את ההכנה המוטבעת הגחון בחוט השדרה באיור 1 א. בשלב הבא, אנו מציגים את תוכנית ההתקנה של 2P מיקרוסקופ ורכיבי מפתח באיור 1. איור 2 מדגים הקרינה eGFP וEYFP בz-ערימה אחת בתוך חוט השדרה הגחון. רכישת Z- ערימות רצופות ניתן להדר בהפקת סרטי זמן לשגות לנתח דינמיקה סלולרית בזמן אמת בתוך הרקמה שלמה. באמצעות dichroic 520 ננומטר חד-קצה ומפצל קרן dichroic חד-קצה 560 ננומטר, כאמור בפרוטוקול, יכול להפריד בין אות eGFP וEYFP. ניתן pseudocolored ערוצים בודדים תוכנת הדמיה באמצעות ירוקה וצהובה.

80 / 52580fig1.jpg "/>
איור 1: חוט השדרה והתקנת מיקרוסקופ. (א) חוט השדרה המשובץ ב5% agarose ג'ל (משמאל) ורכוב על coverslip לאחר פינוי agarose העודף (מימין). (ב) תמונה של התקנת מיקרוסקופ עם רכיבי מפתח שכותרת. אמבט מים 1. להגדיר על 37 מעלות צלזיוס. 2. טרום חיממו RPMI-1640. 3. C / משאבת צינורות משתנים במהירות L. 4. דוד פתרון מוטבע יחיד. מטרה לטבול 5.. 6. מדחום דיגיטלי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: תמונת דוגמא 2P רכש בתוך חוט השדרה הגחון 3D שחזורים של הצד הגחוני של נגוע, שאינם פגום () וחוט נגוע JHMV, demyelinated (B) בעמוד השדרה.מההשתלה הבאה עכבר Thy1-EYFP עם NPCs שכותרת eGFP. האקסונים fluorescently שכותרתו הם pseudocolored צהובים וNPCs הם pseudocolored ירוק. רזולוציית תמונה: 512 פיקסלים; תמונת נפח: (א) x = 239 מיקרומטר, y = 259 מיקרומטר, z = 65 מיקרומטר נבנו באמצעות 26 Z- ערימות במרווחים של 2.5 מיקרומטר וחוץ (B) x = 497 מיקרומטר, y = 389 מיקרומטר, z = 127.5 מיקרומטר נבנה באמצעות 51 Z- ערימות במרווחים של 2.5 מיקרומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בזמן אמת 2P הדמיה של רקמות שלמות נדרשת לחקור קינטיקה NPC ואינטראקציות לאחר השתלה לתוך חוט השדרה עכבר demyelinated. ההדמיה Intravital 2P משמשת בדרך כלל כדי לקבוע דינמיקה סלולרית בצד הגבי של חוט השדרה בעכברים חיים, ונעשתה בו שימוש כדי ללמוד demyelination הגב בdemyelinating המחלה 17-19. עם זאת, מכיוון שNPCs המושתל להגר לחומר לבן הגחון, שנמצא עמוק מדי לתמונה באתר באמצעות 2P מיקרוסקופיה, הכנת vivo לשעבר היא הכרחית. מתודולוגיה זו נעשתה שימוש במעבדה שלנו כדי לקבוע את קינטיקה תנועתיות וחידוש יצירת המיאלין של NPCs הושתלו בעמוד השדרה נפגע ולא נגרם נזק 6. Ex vivo הכנות תאפשר סריקה של חוט שדרה לא רק longitudinally אלא גם באופן רוחבי מהצד הגחון 6,20 . זה מאפשר ניתוח של הבדלים בתנועת תא (מהירות וכיוון) ואינטראקציות בtאתר ransplant, סמוך לאתר ההשתלה, ובמרחקים שונים מאתר ההשתלה 6. הואיל ואנו בתחילה תוכננו בתכשיר זה לתמונה המושתלת eGFP-NPCs בצד הגחון של חוט השדרה, ניתן להשתמש בו לכל תמונה שכותרתו או תא צבוע מהגחון, הגב, או צדדים לרוחב על ידי שינוי כיוון חוט השדרה הוא fluorescently רכוב. יתרונות של הכנה זו על פני ההדמיה intravital כוללים המאפשר הדמיה צד הגחון וחסר הצורך בהרדמה וניתוח הישרדות, שעדיין יש צורך בהכנות intravital החדשות באמצעות התקנה 'חלון זכוכית' המאפשרות לפגישות הדמיה מרובות ללא ניתוחים חוזרים ונשנים 19,21 . יש לציין כי מגבלה אחת של הליך זה בהשוואה לגישתו של חלון זכוכית 'בשילוב עם ההדמיה intravital היא חוסר היכולת להשיג נקודות זמן מרובות מעכבר אחת, מאז חוט השדרה הוסר והעכבר הוא מורדמים.

ההדמיה 2P היא אידיאלית לפתרון הדינמיקה של תאים בודדים בתוך רקמות שלמות 22,23. עירור 2P מנצל פוטונים קרובים אינפרא אדום המאפשרים לתקופות ממושכות של הדמיה רקמות עמוקה עם phototoxicity המינימלי. עירור 2P מתרחש על הקליטה בו זמנית של שני פוטונים על ידי fluorophore. הריכוז הגבוה של פוטונים דרושים ל2P עירור מושגת על ידי דחיסת מרחב ובזמן של פלט לייזר 2P במישור מוקד אחד. זה מגביל עירור ניאון למוקד, מזעור נוסף phototoxicity באזורי חוט השדרה מחוץ למישור המוקד. פוטונים האינפרה-אדום קרוב גם צמצמו פיזור, המאפשרים עד כ 300 מיקרומטר מהצד הגחון של חוט השדרה 16 הדמיה.

כמו עם כל טכניקה חדשה, לעומת זאת, יש 2P הדמיה של עמוד השדרה explanted מגבלות שחייבות להיות כל הזמן בראש. פרוטוקול הדמיה זו משתמש בdichro 520 ננומטרמראה ic המאפשר הפרדת הקרינה eGFP וEYFP על ידי הטיית פליטת eGFP לערוץ הניאון שמורות בדרך כלל לאור כחול. דור שני-הרמוני שנוצר על ידי קולגן בחוט השדרה מופיע גם בערוץ הכחול, אבל יש להבדיל בקלות מהתאים שכותרתו-eGFP שהם בהירים באופן משמעותי בהכנה זו, ויש להם חלק מפליטה לזיהוי בערוץ ירוק-הצהוב כ קולגן לא. טכניקה זו של מיזוג ערוץ והפרדה של חלקים שונים של ספקטרום פליטה באמצעות dichroics הספציפי היא לעתים קרובות שימושית לזיהוי חזותי או אוטומטי של fluorophores בודדת עם ספקטרום פליטה קרוב או כמעט חופף. Phototoxicity הוא מגבלה נוספת של פרוטוקול ההדמיה 2P זה. תאים בתוך אחת הדמיה נפח רגישים לphototoxicity; לכן, בניסויים צריכים להיות מודעים היטב לסימנים של phototoxicity. Phototoxicity הוא בדרך כלל לידי ביטוי הראשון בהפחתה או חוסר התאתנועתיות, ואחרי photobleaching ו / או שינויים מורפולוגיים ברקמות מקומיות. מספר גורמים יכולים לגרום נזק לרקמות מובילים לphototoxicity או טיוח זה אינו מתאים לLive- תא הדמיה. זה קריטי כדי לפקח על כוח הלייזר וטמפרטורה והחמצון של RPMI-1640 perfused. זה גם הכרחי על מנת להבטיח הסרה נכונה של חוט השדרה מהעכבר ללא מוגזם מתיחה או דחיסה של חוט השדרה ובלי לחתוך את חוט השדרה עם הלהבים. אם ינוהל כהלכה, הכנת חוט השדרה explanted תישאר קיימא עבור עד עשר שעות, כפי שנקבעו על ידי תנועתיות סלולרית חזקה בתוך חוט השדרה הגחון ללא הפחתה בעשר שעות שלאחר חילוץ. מגוון רחב של רקמות שחולצו הוא הדמיה בדרך כלל לפרקי זמן ארוכים ונחשב בר-קיימא 23-26. לכן, כימות של דינמיקה סלולרית באזורים מרובים בחוט השדרה יחיד אפשרית. לבסוף, יש לציין כי רובם המכריע של tha תאיםt לא fluorescently שכותרתו לא דמיין ידי ההכנה הזה (אלא אם כן autofluorescent באופן טבעי), וזה חשוב להכיר בכך שתאי שכותרתו נמצאים באינטראקציה עם סביבה מורכבת של תאים אחרים ללא תווית, לכאורה בלתי נראים אנדוגני ואלמנטים מבניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane, USP Piramal Critical Care, Inc N/A
Fine scissors Fine Science Tools 14060-09 sharp
scalpel blade #10 Fine Science Tools 10010-00
scalpel handle Fine Science Tools 10003-12
Luer rongeurs Fine Science Tools 16001-15
Graefe forceps Fine Science Tools 11052-10
Vannas scissors Fine Science Tools 15615-08
scalpel blade #11 Fine Science Tools 10011-00
RPMI-1640 Gibco 12-115F
agarose, low gelling temperature Sigma A9414-25G
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12
Vetbond (tissue adhesive) 3M 1469SB
22 mm square cover slip Fisher Scientific 12-547
25X dipping objective, 1.1 NA Nikon CFI Apo LWD 25XW
Single inline solution heater Warner Instruments 64-0102
520 nm single-edge dichroic beam splitter Semrock FF520-Di02-25x36 Brightline
560 nm single-edge dichroic beam splitter Semrock FF560-FDi01-25x36 Brightline
photomultiplier tubes Hamamatsu R928
C/L variable-speed tubing pump Masterflex 77122-22
digital thermometer Comar Instruments 3501
Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser  Coherent N/A
Slidebook 6 software 3i N/A
Imaris 7.7 software Bitplane N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment. Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).
  2. Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G. Regeneration and repair in multiple sclerosis: the role of cell transplantation. Neurosci Lett. 456 (3), 101-106 (2009).
  3. Hatch, M. N., Schaumburg, C. S., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Endogenous remyelination is induced by transplant rejection in a viral model of multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 212 (1-2), 74-81 (2009).
  4. Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 187 (2), 254-265 (2004).
  5. Tirotta, E., Carbajal, K. S., Schaumburg, C. S., Whitman, L., Lane, T. E. Cell replacement therapies to promote remyelination in a viral model of demyelination. J Neuroimmunol. 224 (1-2), 101-107 (2010).
  6. Greenberg, M. L., et al. Two-photon imaging of remyelination of spinal cord axons by engrafted neural precursor cells in a viral model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (22), E2349-E2355 (2014).
  7. Whitman, L. M., Blanc, C. A., Schaumburg, C. S., Rowitch, D. H., Lane, T. E. Olig1 function is required for remyelination potential of transplanted neural progenitor cells in a model of viral-induced demyelination. Exp Neurol. 235 (1), 380-387 (2012).
  8. Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).
  9. Weinger, J. G., et al. MHC mismatch results in neural progenitor cell rejection following spinal cord transplantation in a model of viral-induced demyelination. Stem Cells. 30 (11), 2584-2595 (2012).
  10. Vogel, D. Y., et al. Macrophages in inflammatory multiple sclerosis lesions have an intermediate activation status. J Neuroinflammation. 10, 35 (2013).
  11. Coyle, P. K. Ch. 3. Clinical Neuroimmunology: Multiple Sclerosis and Related Disorders. Rizvi, S. A., Coyle, P. K. 3, Springer. 43-70 (2011).
  12. McManus, C., et al. MCP-1, MCP-2 and MCP-3 expression in multiple sclerosis lesions: an immunohistochemical and in situ hybridization study. J Neuroimmunol. 86 (1), 20-29 (1998).
  13. Calderon, T. M., et al. A role for CXCL12 (SDF-1alpha) in the pathogenesis of multiple sclerosis: regulation of CXCL12 expression in astrocytes by soluble myelin basic protein. J Neuroimmunol. 177 (1-2), 27-39 (2006).
  14. Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J Vis Exp. 53, e2834 (2011).
  15. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  16. Nguyen, Q. T., Callamaras, N., Hsieh, C., Parker, I. Construction of a two-photon microscope for video-rate Ca(2+) imaging. Cell Calcium. 30 (6), 383-393 (2001).
  17. Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).
  18. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. 82, e50826 (2013).
  19. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
  20. Pakan, J. M., McDermott, K. W. A method to investigate radial glia cell behavior using two-photon time-lapse microscopy in an ex vivo model of spinal cord development. Front Neuroanat. 8, 22 (2014).
  21. Fenrich, K. K., et al. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. J Physiol. 590 (Pt 16), 3665-3675 (2012).
  22. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336, 1676-1681 (2012).
  23. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (6089), 1869-1873 (2002).
  24. Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Curr Protoc Cytom. Chapter 12 (Unit12 26), (2012).
  25. Matheu, M. P., et al. Toll-like receptor 4-activated B cells out-compete Toll-like receptor 9-activated B cells to establish peripheral immunological tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), E1258-E1266 (2012).
  26. Matheu, M. P., et al. Three phases of CD8 T cell response in the lung following H1N1 influenza infection and sphingosine 1 phosphate agonist therapy. PLoS One. 8 (3), e58033 (2013).

Tags

Neuroscience, חוט השדרה שני פוטונים במיקרוסקופ גיליון 96 לשעבר vivo השתלה דינמיקה סלולרית אקסונים תאים עצביים מבשר חידוש יצירת המיאלין neuroinflammation
הדמיה שני פוטונים של Dynamics הסלולרי בחוט השדרה העכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weinger, J. G., Greenberg, M. L.,… More

Weinger, J. G., Greenberg, M. L., Matheu, M. P., Parker, I., Walsh, C. M., Lane, T. E., Cahalan, M. D. Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord. J. Vis. Exp. (96), e52580, doi:10.3791/52580 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter