Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

To-foton Imaging for Cellulær Dynamics i Mouse Spinal Cord

doi: 10.3791/52580 Published: February 22, 2015

Summary

En ny ex vivo forberedelse til afbildning af mus rygmarven. Denne protokol giver mulighed for to-foton-billeddannelse af levende cellulære interaktioner i hele rygmarven.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Musemodeller for demyelination, herunder eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) og intrakraniel infektion med neuroadapted mus hepatitis virus (MHV), er fremragende værktøjer til at studere molekylære veje og cellulære interaktioner forbundet med sygdommen. De har ført til og støttet effektiviteten af FDA godkendte farmaceutiske behandlinger, primært rettet mod ophør af autoimmunitet og inflammation 1. Men når endogene remyelinering mislykkedes, de aktuelt godkendte behandlinger ikke effektivt reparere demyeliniserede læsioner i centralnervesystemet. Derfor reparation-fokuserede terapier på dette stadium af sygdommen er afgørende for lindring af kroniske symptomer og forbedring af livskvaliteten. For nylig har neurale precursorceller (NPCs) kommer i forgrunden som en potentiel regenerativ terapeutisk modalitet til at målrette områder af inflammation og demyelinisering. Flere undersøgelser har fremhævet evne NPC'ere at inducere endogenoos remyelinering og deltage direkte i remyelinering 2-8. Fordi NPC'ere er involveret i direkte remyelinering, er det bydende nødvendigt at forstå deres kinetik og interaktioner med endogene celler efter transplantation. Efter transplantation, NPC'ere migrere ventralt til områder af hvid substans skader, så rostrally og kaudalt i forhold til transplantation webstedet 5,9. Kinetikken for migration varierer som reaktion på miljømæssige signaler; NPC transplanteret ind i en ikke-beskadiget rygmarv har større hastigheder end NPC transplanteret ind i en beskadiget rygmarv 6. Efter en vandrende periode, overføres NPC'ere formere meget, med en højere hastighed i en beskadiget rygmarven i forhold til en intakt rygmarv 6. Endelig er de fleste af NPC differentiere til oligodendrocytter og iværksætte direkte remyelinering 4,6,9.

Den demyeliniserede læsion er kompleks og kan indeholde en forskelligartet population af celler på forskellige stadier af enctivation. For eksempel kan en aktiv dissemineret sklerose (MS) læsion omfatter en væsentlig population af aktiverede T-celler, M1 mikroglia og M1 makrofager, men en kronisk tavs MS læsion kan bestå primært af reaktive astrocytter med få inflammatoriske celler 10-13. På grund af mangfoldigheden af ​​effektorceller, to-foton (2P) billeddannelse i musemodeller for demyelinisering er et yderst nyttigt redskab til at hjælpe med at forstå de lokale cellulære interaktioner inden læsionen. I MS og mange ekstensivt udnyttede MS forskningsmodeller, er de fleste af læsioner placeret på den ventrale side af rygmarven, en region utilgængeligt for intravital 2P billeddannelse på grund af læsion dybde og det høje indhold af rygmarven lipid. For at omgå disse problemer og undersøgelse celle-celle-interaktioner inden læsioner langs den ventrale rygmarv har vi udviklet en simpel ex vivo 2P billeddannelse fremstilling 6.

Denne undersøgelse er en opfølgning af en tidligere metoder publikation, som visteproceduren til omplantning forstærket grønt fluorescerende protein (eGFP) som udviser NPC i rygmarven af mus efter JHMV stamme af MHV-induceret demyelinisering 14. Fem uger gamle mus inficeret med JHMV og transplanteret med eGFP-NPC'ere på thorax niveau 9 på dag 14 efter infektion. Protokollen præsenteres her giver detaljerede trin om, hvordan man udtrække rygmarven, foretage en ex vivo agarose forberedelse, og image transplanteret eGFP-NPC interaktioner med forstærket gult fluorescerende protein (EYFP) som udviser axoner. Mus, der udtrykker EYFP under neuronal-specifikke Thy1 promotoren blev anvendt i denne procedure 15. Kun nogle af axoner udtrykker EYFP, hvilket gør den anvendelig til billeddannelse enkelte axoner. Her viser vi rygmarv fjernet 7 dage efter transplantation; Imidlertid kan rygmarv ekstraheres på noget tidspunkt efter transplantation. Vi viser interaktioner af NPC med beskadigede axoner, kan vores protokol anvendes i kombination med genetiske fluorescerende markøreraf andre celletyper til at undersøge en mangfoldighed af cellulære interaktioner, der forekommer hele mus rygmarven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

BEMÆRK: Etik Statement: Protokollen for håndtering af dyr blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) fra University of California, Irvine, protokol # 2010-2943.

1. Fjernelse af rygmarv

  1. Placer papirhåndklæder fugtet med ~ 100% flydende isofluran, USP i euthanizing kammer og placere tørre papirhåndklæder på toppen. Placer musen i kammer oven på tørre papirhåndklæder så musen ikke rører isofluran og sørg kammeret er dækket. Vent mindst et minut efter ophør af åndedræt at sikre, at musen aflivet.
  2. Udfør en spinal overskæring af halsen for at sikre musen aflivet. Du må ikke udføre en cervikal dislokation, da dette kan beskadige rygmarven.
  3. Spray mus med 70% ethanol til at fugte håret.
  4. Bruge skarpe fine saks til at fjerne hår og hud fra ryggen af ​​musen til at udsætte rygsøjlen fra ca. cervikal lamina 1 (C1) Til sakral lamina 4 (S4).
  5. Ved hjælp af en skalpel med en # 10 klinge, gøre indsnit til venstre og højre af rygsøjlen for at adskille den fra muskel og fedt. Dette vil gøre fjernelse af rygmarven meget lettere.
  6. valgfri: en kurvet Luer rongeurs kan bruges til at øse væk ekstra kød.
  7. Hold toppen af ​​spinal ryghvirvler med savtakkede Graefe pincet, indsætte titanium buede Vännäs saks med den buede side opad i den udsatte rygsøjlen på C1, og pas på ikke at røre ved rygmarven.
  8. Skub titanium buede Vännäs saks hele vejen til højre og gøre en lille snit. En lille crunch lyd skal høres og mærkes som saksen klippe ryghvirvler. Gentag denne nedskæring yderst til venstre side af ledningen. Pas på ikke at gå for hurtigt eller lave for stor af et snit, da dette vil risikere at beskadige ledningen med saksen.
  9. Det indre lamina skal kunne løftes med pincet når siderne af ryghvirvler skæres. REPEAT dette trin for hvert lag, indtil S4, fortsætter med at holde og trække sig tilbage rygmarven ryghvirvler.
    BEMÆRK: ryghvirvlerne over transplantation site vil sandsynligvis komme ud, når den er skåret ned til transplantation site. Fortsætte proceduren starter lige under transplantationen site.
  10. valgfri: lægge ryghvirvler ned for at se, hvor transplantationen site er og måle og skære ~ 20 mm rostral og caudale til transplantation site.
    BEMÆRK: Når transplantere NPC'ere flere vil ikke være behov for som de transplanterede NPC'ere generelt ikke migrere længere end 15 mm. Mængden af ​​rygmarv behov vil være afhængig af eksperiment og migration karakteristika celletype transplanteret. Realiseringen rostralt og caudale udskæringer, der lige langt til transplantationen site vil gøre det muligt for transplantation websted for at være placeret lettere under billedbehandling.
  11. Ved hjælp af en skalpel med en # 11 klinge forsigtigt skære ganglier på højre og venstre side af den ventrale side af rygmarven starter ved rostrale ende. Denne wsyg muliggøre rygmarven at blive fjernet fra den ventrale ryghvirvler lettere.
    BEMÆRK: Udført hurtigt (trin 1,7-1,11), vil rygmarven ikke tørre ud. Imidlertid kan 1x PBS administreres til ledningen for at holde den fugtig.
  12. Vend musen og hold musen op, så rygmarven vender nedad. Træk forsigtigt ud rygmarven ved hjælp af lukkede savtakkede Graefe pincet. Uden nicking rygmarven, forsigtigt skære alle resterende ganglier at tillade rygmarven skal løftes på én intakt stykke.
  13. Sørg for, at rygmarven er i RPMI-1640 og placere den på is til transport til 2P mikroskop.

2. Udarbejdelse af Spinal Cord for Imaging

  1. Embedding rygmarv i agarose
    1. Hold isolerede rygmarven i afkølet RPMI-1640 på is før billeddannelse.
    2. Afvej agarose (lav geleringstemperatur) og forberede en 5% opløsning i 5 ml 1X PBS. Mikrobølge 5% agarose opløsningen i 15 sekunder for at opløse agopstod, hvorefter opløsningen afkøles til 37 ° C.
    3. Forbered rygmarven ved at placere den på et ark Parafilm med den ventrale side opad.
    4. Pipetter ca. 5 ml 5% agaroseopløsning i den ventrale side af rygmarven. Lad agarose størkne ved afkøling til stuetemperatur. Fuld størkning tager ca. 5 min.
    5. Påfør et tyndt lag af væv klæbemiddel til et 22 mm kvadratisk dækglas.
    6. Vend den integrerede rygmarven, hvilket placerer den ventrale side på Parafilm. Den dorsale side vil nu vende opad. Overhold dækglasset på dorsalsiden, og nedsænkes agarose indlejret rygmarven / dækglasset forberedelse i RMPI at størkne limen. Fjern overskydende størknede agarose ved hjælp af et barberblad.
  2. Montering af rygmarven på mikroskopbordet
    1. Anvend vaseline til bunden af ​​dækglasset. Dette vil stabilisere præparatet under perfusion.
    2. Placer spinal forberedelse ledningen i enbilleddannelse godt på mikroskopet scenen med den ventrale side opad mod 25X dypning mål. Den specialbyggede imaging godt er cirka 20 mm dyb, 50 mm lang, og 50 mm på tværs.
    3. Billede mens superfusing præparatet med warmed (37 ° C), oxygeneret (95: 5 oxygen: kuldioxid-carbogen) RPMI-1640-medium uden serum.
      1. Pre-varme medier til 37 ° C i vandbad og tilslut det til slangen pumpen ved at sætte slangen i medierne flasken.
      2. Behold medierne temperatur ved 37 ° C en radiator enhed på tilslutning af slangen til kammeret. Superfuse medier gennem godt på 3 ml / min ved hjælp af rør forbundet til slangen pumpen (figur 1B).

3. 2P Imaging af Ventral Spinal Cord

  1. Mikroskop Opsætning
    1. Anskaf billeder fra Thy1-EYFP rygmarv ved hjælp af en kamæleon Ultra Ti: Sapphire laser indstillet til 900 nm. Dæmpe laser magt påprøve til <5% for at sikre minimal fototoksicitet 16. Oprethold temperaturen ved perfusion oxygen-perfunderet RPMI-1640 ved en konstant 37 ° C under anvendelse af en enkelt inline løsning varmelegeme at sikre en stabil billeddannelse, og for at forhindre væv afdrift og celleskader.
    2. For at adskille eGFP og EYFP fluorescerende signal, placere en 520 nm single-kant dichroic og en 560 nm single-kant dikroisk stråledeler i serie til at adskille 2P emission i tre kanaler, med vilje at opdele den grønne emission for at styrke synligheden.
      BEMÆRK: Disse kanal benævnes blågrønne (emission <520 nm), grøn-gul (520-560 nm), og rød (emission> 560 nm). Fotomultiplikatorrør detektere udsendte lys i hver kanal.
  2. Placering af imaging interesseområder
    1. Brug af okularet og en lys felt lyskilde, fokus den dypning mål på den ventrale kant af rygmarven at sætte et referencepunkt.
    2. Sørg omgivende lyskilden er slukket og swkløe til 2P excitation ved at åbne laser lukkeren.
    3. Hvis det er tilgængeligt, når du søger væv for områder af interesse, skal du bruge en lavere opløsning, højere volumen uden digital zoom, og højere scanningshastighed end ved erhvervelse af de endelige billeder. Typiske indstillinger med dette system, når du søger væv for et område af interesse er: Opløsning: 256 pixels; volumen: x = 600 um, y = 600 um, z = 0-300 um.
    4. Overhold EYFP axoner nær den ventrale kant af rygmarven. Anden harmoniske signal fra kollagen (blå) vil være lysstærke ved rygmarv kant. Lokalisere EYFP axoner blot dorsal til den anden harmoniske signal fra kollagen og EYFP signal visualiseret i den grøn-gul kanal.
    5. Find transplantation site i langsgående centrum af rygmarven fremstilling 14. For mus en dag efter eGFP-NPC transplantation lokalisere transplantatet stedet ved at fokusere strålegangen i Z planet dybt ind i vævet. Den transplantation websted will variere lidt mellem dyr, men er generelt placeret ~ 200 um fra den ventrale kant. Overhold klynger af eGFP-NPC'ere i den hvide substans skrifter, tættere på de ventrale og laterale kanter i mus efter dag 1 efter transplantationen.
  3. Erhvervelse endelige billeder
    1. Erhverve billedopløsning på 512 pixel; volumen: x = 270 um, y = 212 um, og z = 100 um hjælp Slidebook 6 software. Udarbejde z-stakke ved at erhverve sekventielle fokusplaner i 2,5 um intervaller.
    2. Udfør en tovejs scanning med ordentlig interlace offset for at sikre hurtig store de eventuelle migrerende genstande i rygmarven. Sørg for, at den ideelle erhvervelse frame rate til at bestemme cellulær hastighed i rygmarven er ca. 1 ramme / sek.
      BEMÆRK: Imaging kan ændres til individuelle brugerindstillinger, såsom erhvervelse frame rate, billedbehandling opløsning og billeddannelse mængder. Større billedbehandling mængder vil normalt tage længere tid at erhverve på et given opløsning.
    3. Analyser, crop, glat, og pseudofarve Slidebook billedfiler med billedanalyse-software såsom Bitplane Imaris 7.7. Fremstil endelige time-lapse videoer ved kæmning hinanden følgende billeddannende mængder ved hjælp af en automatiseret proces i Slidebook og Imaris.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mens det eksplanterede rygmarven imaging protokol kan anvendes til at visualisere nogen fluorescens i rygmarven vores repræsentative resultater viser eGFP-NPC interaktioner med EYFP-axoner. Først viser vi den integrerede ventrale spinal forberedelse snor i figur 1A. Dernæst viser vi 2P mikroskop setup og nøglekomponenter i figur 1B. Figur 2 viser eGFP og EYFP fluorescens i en enkelt z-stak i den ventrale rygmarv. Køb af hinanden følgende z-stakke kan kompileres til at producere tid-lapse videoer til at analysere realtid cellulære dynamik i intakte væv. Ved hjælp af en 520 nm single-kant dichroic og en 560 nm single-kant dikroisk stråledeler, som bemærket i protokollen, kan adskille eGFP og EYFP signal. Individuelle kanaler kan pseudocolored grøn og gul hjælp imaging software.

80 / 52580fig1.jpg "/>
Figur 1: rygmarv og mikroskop setup. (A) en rygmarv indlejret i en 5% agarose gel (til venstre) og monteret på et dækglas efter fjernelse af overskydende agarose (højre). (B) Et billede af mikroskopet opsætning med nøglekomponenter mærket. 1. vandbad indstillet på 37 ° C. 2. forvarmet RPMI-1640. 3. C / L variabel hastighed slange pumpe. 4. Single inline løsning varmelegeme. 5. Dipping mål. 6. Digital termometer. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Eksempel 2P billede opnået på den ventrale rygmarv 3D rekonstruktioner af den ventrale side af en ikke-inficerede, ikke-beskadiget (A) og JHMV-inficerede, demyeliniserede (B) rygmarven.fra en Thy1-EYFP mus efter transplantation med eGFP-mærkede NPC'ere. Fluorescens-mærket axoner er pseudocolored gul og NPC'ere er pseudocolored grøn. Billedopløsning: 512 pixels; Billede volumen: (A) x = 239 um, y = 259 um, z = 65 um konstrueret ved anvendelse af 26 z-stakke anbragt 2,5 um hinanden og (B) x = 497 um, y = 389 um, z = 127,5 um konstrueret ved anvendelse af 51 z-stakke afstand 2,5 um fra hinanden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Real-time 2P billeddannelse af intakt væv er forpligtet til at undersøge NPC kinetik og interaktioner efter transplantation ind i demyeliniserede mus rygmarven. Intravital 2P billeddannelse er almindeligt anvendt til at bestemme cellulære dynamik på den dorsale side af rygmarven i levende mus, og er blevet anvendt til at undersøge dorsal demyelinisering i demyeliniserende sygdom 17-19. Men fordi transplanterede NPC'ere migrere til den ventrale hvide substans, der ligger for dybt til billedet på stedet ved hjælp af 2P mikroskopi, er nødvendigt med en ex vivo forberedelse. Denne metode er blevet anvendt i vores laboratorium for at bestemme motiliteten og remyelinering kinetik NPC'ere transplanteres ind i beskadigede og ikke-beskadigede rygmarv 6. Ex vivo præparater aktivere scanning af rygmarven, ikke kun på langs, men også på tværs fra den ventrale side 6,20 . Dette giver mulighed for analyse af forskelle i cellebevægelse (hastighed og retning) og interaktioner ved Transplant site, der støder op til transplantation site, og ved forskellige afstande fra transplantationen stedet 6. Mens vi oprindeligt udtænkt dette præparat billedet transplanteret eGFP-NPC på den ventrale side af rygmarven, kan det anvendes til at afbilde enhver fluorescensmærket eller farvet celle fra den ventrale, bryst-, eller laterale sider ved at ændre orienteringen rygmarven er monteret. Fordele ved dette præparat i intravital billeddannelse omfatter tillader ventrale side billeddannelse og mangler behovet for bedøvelse og overlevelse kirurgi, der er stadig behov for med de nye intravital præparater ved en glasrude 'Setup at muliggøre flere imaging sessioner uden gentagne operationer 19,21 . Det bør bemærkes, at en begrænsning af denne procedure i forhold til 'glasrude tilgang i kombination med intravital billeddannelse er den manglende evne til at opnå forskellige tidspunkter fra en enkelt mus, da rygmarven er fjernet, og musen aflivet.

2P billeddannelse er velegnet til at løse dynamikken i enkeltceller i intakte væv 22,23. 2P excitation udnytter nær-infrarøde fotoner der giver mulighed for længere perioder dyb væv billeddannelse med minimal fototoksicitet. 2P excitation forekommer ved samtidig absorption af to fotoner ved en fluorofor. Den høje koncentration af fotoner, der er nødvendige for 2P excitation opnås ved spatio-temporale kompression af 2P laser output på et enkelt brændplan. Dette begrænser fluorescerende excitation til omdrejningspunktet, yderligere minimering fototoksicitet i rygmarv regioner ud over brændplanet. Nær-infrarødt fotoner har også reduceret spredning, så billeddannelse op til omtrent 300 um fra den ventrale side af rygmarven 16.

Som med enhver ny teknik, men 2P billeddannelse af det eksplanterede rygmarv har begrænsninger, der skal holdes for øje. Denne billedbehandling protokol anvender en 520 nm dichroic spejl, der giver mulighed for adskillelse af eGFP og EYFP fluorescens ved at omdirigere eGFP emission til fluorescerende kanal typisk forbeholdt blåt lys. Anden-harmonisk generation skabt af kollagen i rygmarven vises også i den blå kanal, men er let skelnes fra eGFP-mærkede celler, som er betydeligt lysere i dette præparat, og som har en del af deres udledning identificeres i grøn-gul kanal som collagen ikke. Denne teknik af kanal blanding og adskillelse af forskellige dele af en emission spektre under anvendelse af specifikke dichroics er ofte nyttigt for visuel eller automatiseret identifikation af individuelle fluoroforer med tæt eller næsten overlappende emissionsspektre. Fototoksicitet er en anden begrænsning af denne 2P billeddannelse protokol. Celler i en enkelt imaging volumen er følsomme over for fototoksicitet; Derfor bør experimentalist være meget opmærksomme på tegn på fototoksicitet. Fototoksicitet er typisk først tydeligt i reduktion eller manglende cellemotilitet, efterfulgt af fotoblegning og / eller morfologiske ændringer i lokale væv. Flere faktorer kan beskadige vævet fører til fototoksicitet eller gør det uegnet til live-cell imaging. Det er afgørende at overvåge lasereffekt og temperatur og iltning af perfunderet RPMI-1640. Det er også nødvendigt at sikre en korrekt fjernelse af rygmarv fra musen uden overdreven strække eller komprimere af rygmarven og uden at skære rygmarv med knivene. Ved korrekt, vil det eksplanterede rygmarven forberedelse forbliver levedygtige i op til ti timer, som bestemt ved robust cellulære motilitet i den ventrale rygmarv uden formindskelse til ti timer efter ekstraktion. En række af ekstraheret væv er almindeligt afbildet i lange længder af tid og fandt levedygtig 23-26. Derfor kvantificering af cellulære dynamik i flere områder inden for en enkelt rygmarv er mulig. Endelig skal det bemærkes, at størstedelen af ​​celler that er ikke fluorescensmærket vil ikke visualiseres ved dette præparat (medmindre naturligvis autofluorescerende), og det er vigtigt at erkende, at mærkede celler interagerer med et komplekst miljø af andre ikke-mærkede, tilsyneladende usynlige endogene celler og strukturelle elementer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane, USP Piramal Critical Care, Inc N/A
Fine scissors Fine Science Tools 14060-09 sharp
scalpel blade #10 Fine Science Tools 10010-00
scalpel handle Fine Science Tools 10003-12
Luer rongeurs Fine Science Tools 16001-15
Graefe forceps Fine Science Tools 11052-10
Vannas scissors Fine Science Tools 15615-08
scalpel blade #11 Fine Science Tools 10011-00
RPMI-1640 Gibco 12-115F
agarose, low gelling temperature Sigma A9414-25G
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12
Vetbond (tissue adhesive) 3M 1469SB
22 mm square cover slip Fisher Scientific 12-547
25X dipping objective, 1.1 NA Nikon CFI Apo LWD 25XW
Single inline solution heater Warner Instruments 64-0102
520 nm single-edge dichroic beam splitter Semrock FF520-Di02-25x36 Brightline
560 nm single-edge dichroic beam splitter Semrock FF560-FDi01-25x36 Brightline
photomultiplier tubes Hamamatsu R928
C/L variable-speed tubing pump Masterflex 77122-22
digital thermometer Comar Instruments 3501
Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser  Coherent N/A
Slidebook 6 software 3i N/A
Imaris 7.7 software Bitplane N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment. Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).
  2. Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G. Regeneration and repair in multiple sclerosis: the role of cell transplantation. Neurosci Lett. 456, (3), 101-106 (2009).
  3. Hatch, M. N., Schaumburg, C. S., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Endogenous remyelination is induced by transplant rejection in a viral model of multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 212, (1-2), 74-81 (2009).
  4. Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 187, (2), 254-265 (2004).
  5. Tirotta, E., Carbajal, K. S., Schaumburg, C. S., Whitman, L., Lane, T. E. Cell replacement therapies to promote remyelination in a viral model of demyelination. J Neuroimmunol. 224, (1-2), 101-107 (2010).
  6. Greenberg, M. L., et al. Two-photon imaging of remyelination of spinal cord axons by engrafted neural precursor cells in a viral model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (22), E2349-E2355 (2014).
  7. Whitman, L. M., Blanc, C. A., Schaumburg, C. S., Rowitch, D. H., Lane, T. E. Olig1 function is required for remyelination potential of transplanted neural progenitor cells in a model of viral-induced demyelination. Exp Neurol. 235, (1), 380-387 (2012).
  8. Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422, (6933), 688-694 (2003).
  9. Weinger, J. G., et al. MHC mismatch results in neural progenitor cell rejection following spinal cord transplantation in a model of viral-induced demyelination. Stem Cells. 30, (11), 2584-2595 (2012).
  10. Vogel, D. Y., et al. Macrophages in inflammatory multiple sclerosis lesions have an intermediate activation status. J Neuroinflammation. 10, 35 (2013).
  11. Coyle, P. K. Ch. 3. Clinical Neuroimmunology: Multiple Sclerosis and Related Disorders. Rizvi, S. A., Coyle, P. K. 3, Springer. 43-70 (2011).
  12. McManus, C., et al. MCP-1, MCP-2 and MCP-3 expression in multiple sclerosis lesions: an immunohistochemical and in situ hybridization study. J Neuroimmunol. 86, (1), 20-29 (1998).
  13. Calderon, T. M., et al. A role for CXCL12 (SDF-1alpha) in the pathogenesis of multiple sclerosis: regulation of CXCL12 expression in astrocytes by soluble myelin basic protein. J Neuroimmunol. 177, (1-2), 27-39 (2006).
  14. Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J Vis Exp. 53, e2834 (2011).
  15. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, (1), 41-51 (2000).
  16. Nguyen, Q. T., Callamaras, N., Hsieh, C., Parker, I. Construction of a two-photon microscope for video-rate Ca(2+) imaging. Cell Calcium. 30, (6), 383-393 (2001).
  17. Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat Med. 17, (4), 495-499 (2011).
  18. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. 82, e50826 (2013).
  19. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9, (3), 297-302 (2012).
  20. Pakan, J. M., McDermott, K. W. A method to investigate radial glia cell behavior using two-photon time-lapse microscopy in an ex vivo model of spinal cord development. Front Neuroanat. 8, 22 (2014).
  21. Fenrich, K. K., et al. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. J Physiol. 590, (Pt 16), 3665-3675 (2012).
  22. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336, 1676-1681 (2012).
  23. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, (6089), 1869-1873 (2002).
  24. Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Curr Protoc Cytom. Chapter 12, (Unit12 26), (2012).
  25. Matheu, M. P., et al. Toll-like receptor 4-activated B cells out-compete Toll-like receptor 9-activated B cells to establish peripheral immunological tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (20), E1258-E1266 (2012).
  26. Matheu, M. P., et al. Three phases of CD8 T cell response in the lung following H1N1 influenza infection and sphingosine 1 phosphate agonist therapy. PLoS One. 8, (3), e58033 (2013).
To-foton Imaging for Cellulær Dynamics i Mouse Spinal Cord
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weinger, J. G., Greenberg, M. L., Matheu, M. P., Parker, I., Walsh, C. M., Lane, T. E., Cahalan, M. D. Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord. J. Vis. Exp. (96), e52580, doi:10.3791/52580 (2015).More

Weinger, J. G., Greenberg, M. L., Matheu, M. P., Parker, I., Walsh, C. M., Lane, T. E., Cahalan, M. D. Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord. J. Vis. Exp. (96), e52580, doi:10.3791/52580 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter