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Neuroscience

माउस रीढ़ की हड्डी में सेलुलर गतिशीलता के दो photon इमेजिंग

doi: 10.3791/52580 Published: February 22, 2015

Summary

माउस रीढ़ की हड्डी इमेजिंग के लिए एक नया पूर्व vivo तैयारी। इस प्रोटोकॉल रीढ़ की हड्डी के दौरान लाइव सेलुलर बातचीत की दो photon इमेजिंग के लिए अनुमति देता है।

Introduction

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प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित इंसेफैलोमाईलिटिस (EAE) और neuroadapted माउस हेपेटाइटिस वायरस (MHV) के साथ intracranial संक्रमण सहित demyelination के माउस मॉडल, आणविक रास्ते और रोग के साथ जुड़े सेलुलर बातचीत का अध्ययन करने के लिए उत्कृष्ट उपकरण हैं। वे करने के लिए नेतृत्व और एफडीए की प्रभावशीलता को मुख्य रूप से औतोइम्मुिनित सूजन 1 की समाप्ति को लक्षित, दवा के उपचारों को मंजूरी दे दी समर्थन किया है। अंतर्जात remyelination में नाकाम रही है हालांकि, एक बार, वर्तमान में अनुमोदित उपचारों को प्रभावी ढंग से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में demyelinated घावों की मरम्मत नहीं है। इसलिए, रोग के इस स्तर पर मरम्मत केंद्रित उपचारों जीर्ण लक्षण और जीवन की गुणवत्ता के सुधार के उन्मूलन के लिए महत्वपूर्ण हैं। हाल ही में, तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं (NPCs) सूजन और demyelination के क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए एक संभावित पुनर्योजी चिकित्सीय साधन के रूप में सबसे आगे आ गए हैं। कई अध्ययनों से endogeno प्रेरित करने के लिए NPCs की क्षमता पर प्रकाश डाला हैहमें remyelination और remyelination 2-8 में सीधे भाग लेते हैं। NPCs के प्रत्यक्ष remyelination में शामिल कर रहे हैं, क्योंकि यह प्रत्यारोपण निम्नलिखित अंतर्जात कोशिकाओं के साथ उनके कैनेटीक्स और बातचीत को समझने के लिए जरूरी है। प्रत्यारोपण के बाद, NPCs तो rostrally और प्रत्यारोपण साइट 5,9 करने के लिए दुमदारी रिश्तेदार सफेद पदार्थ की क्षति के क्षेत्रों के लिए पेट के बल आ जाते हैं। माइग्रेशन के कैनेटीक्स पर्यावरण संकेतों के जवाब में भिन्न होते हैं; एक गैर क्षतिग्रस्त रीढ़ की हड्डी में प्रत्यारोपित NPCs के एक क्षतिग्रस्त रीढ़ की हड्डी 6 में प्रतिरोपित NPCs के अधिक से अधिक वेग है। एक प्रवासी अवधि के बाद, एक अक्षुण्ण रीढ़ की हड्डी से 6 एक क्षतिग्रस्त रीढ़ की हड्डी के सापेक्ष में एक उच्च दर पर, NPCs के बड़े पैमाने पर पैदा स्थानांतरित कर दिया। अंत में, NPCs के बहुमत oligodendrocytes में अंतर और प्रत्यक्ष remyelination 4,6,9 आरंभ करें।

demyelinated घाव जटिल है और एक के विभिन्न चरणों में कोशिकाओं की एक विविध आबादी शामिल कर सकते हैंctivation। उदाहरण के लिए, एक सक्रिय मल्टिपल स्क्लेरोसिस (एमएस) घाव सक्रिय टी कोशिकाओं, एम 1 microglia और एम 1 मैक्रोफेज, लेकिन एक पुरानी चुप एमएस घाव मुख्य रूप से कुछ भड़काऊ कोशिकाओं 10-13 के साथ प्रतिक्रियाशील astrocytes के शामिल किया जा सकता है की एक महत्वपूर्ण आबादी शामिल हो सकते हैं। क्योंकि प्रेरक कोशिकाओं की विविधता के कारण, demyelination के माउस मॉडल में दो-फोटान (2P) इमेजिंग घाव के भीतर स्थानीय सेलुलर बातचीत को समझने में मदद करने के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है। एमएस और कई बड़े पैमाने पर इस्तेमाल एमएस अनुसंधान मॉडल में, घावों का बहुमत होने के कारण घाव गहराई और रीढ़ की हड्डी के उच्च लिपिड सामग्री के लिए रीढ़ की हड्डी, intravital 2P इमेजिंग के लिए दुर्गम क्षेत्र के उदर पक्ष पर स्थित हैं। उदर रीढ़ की हड्डी के साथ घावों के भीतर इन मुद्दों और अध्ययन सेल सेल बातचीत नाकाम करने के लिए हम पूर्व vivo 2P इमेजिंग तैयारी 6 एक सरल विकसित किया है।

इस अध्ययन से पता चला है, जो पिछले एक विधियों प्रकाशन, ऊपर इस प्रकार हैMHV प्रेरित demyelination 14 की JHMV तनाव निम्नलिखित चूहों की रीढ़ की हड्डी में बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) -expressing NPCs के रोपाई के लिए प्रक्रिया। पांच सप्ताह पुरानी चूहों JHMV से संक्रमित हैं और 14 दिन के बाद संक्रमण पर वक्ष 9 स्तर पर EGFP-NPCs के साथ प्रतिरोपित कर रहे हैं। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक पूर्व vivo agarose तैयारी कर, रीढ़ की हड्डी निकालने, और बढ़ाया पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EYFP) -expressing axons के साथ छवि प्रत्यारोपित EGFP-एनपीसी बातचीत करने के तरीके पर विस्तृत कदम प्रदान करता है। न्यूरोनल-विशिष्ट Thy1 प्रमोटर के तहत EYFP व्यक्त चूहे इस प्रक्रिया में 15 में इस्तेमाल किया गया। केवल axons की कुछ व्यक्तिगत एक्सोन इमेजिंग के लिए यह उपयोगी है, जिससे EYFP व्यक्त करते हैं। यहाँ हम 7 दिनों के बाद प्रत्यारोपण पर हटाया रीढ़ की हड्डी डोरियों दिखाने; हालांकि, रीढ़ की हड्डी डोरियों प्रत्यारोपण के बाद किसी भी समय बिंदु पर निकाला जा सकता है। हम क्षतिग्रस्त axons के साथ NPCs के बातचीत प्रदर्शित करते हैं, हमारे प्रोटोकॉल आनुवंशिक फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता हैअन्य प्रकार की कोशिकाओं का माउस रीढ़ की हड्डी के दौरान होने वाली बातचीत सेलुलर के एक भीड़ जांच करने के लिए।

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Protocol

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नोट: आचार कथन: जानवर से निपटने के लिए प्रोटोकॉल कैलिफोर्निया, इरविन, प्रोटोकॉल # 2010-2943 विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

स्पाइनल कॉर्ड 1. निकालना

  1. चैम्बर euthanizing में ~ 100% तरल isoflurane, खासियत के साथ गीला कागज तौलिये प्लेस और शीर्ष पर सूखी कागज तौलिए जगह है। माउस isoflurane छू नहीं है तो सूखी कागज तौलिये के शीर्ष पर चैम्बर में माउस प्लेस और चैम्बर कवर किया जाता है सुनिश्चित करें। माउस euthanized है कि यह सुनिश्चित करने के लिए सांस लेने की समाप्ति के बाद कम से कम एक मिनट रुको।
  2. माउस euthanized है सुनिश्चित करने के लिए गर्दन की एक रीढ़ की transection प्रदर्शन करते हैं। इस रीढ़ की हड्डी को नुकसान पहुंचा सकता है के रूप में एक गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन नहीं करते।
  3. बाल गीला करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ माउस स्प्रे।
  4. (लगभग ग्रीवा लामिना एक से स्पाइनल कॉलम को बेनकाब करने के लिए सी 1 माउस के पीछे से बाल और त्वचा को हटाने के लिए तेज ठीक कैंची का प्रयोग करें) त्रिक लामिना 4 (एस 4) के लिए।
  5. एक # 10 ब्लेड के साथ एक स्केलपेल का उपयोग करना, मांसपेशियों और वसा से अलग करने के लिए स्पाइनल कॉलम के लिए छोड़ दिया और सही करने के लिए चीरों बनाते हैं। यह रीढ़ की हड्डी को हटाने के बहुत आसान हो जाएगा।
  6. वैकल्पिक: एक घुमावदार Luer Rongeurs अतिरिक्त मांस दूर स्कूप करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  7. दाँतेदार Graefe संदंश के साथ रीढ़ की कशेरुकाओं के शीर्ष धारण करते हुए, रीढ़ की हड्डी को छूने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है, ऊपर सी 1 में उजागर स्पाइनल कॉलम में घुमावदार पक्ष के साथ टाइटेनियम घुमावदार Vannas कैंची डालें।
  8. सभी तरह से सही करने के लिए टाइटेनियम घुमावदार Vannas कैंची स्लाइड और एक छोटे से कट कर सकते हैं। एक छोटी सी की कमी आवाज सुनी और कैंची कशेरुकाओं में कटौती के रूप में महसूस किया जाना चाहिए। गर्भनाल के दूर बाईं तरफ इस कटौती को दोहराएँ। बहुत जल्दी जाने के लिए या इस कैंची से की हड्डी को नुकसान पहुँचाए जोखिम जाएगा के रूप में एक कटौती की बहुत बड़ी बनाने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
  9. एकल पटल कशेरुकाओं के पक्ष में कटौती कर रहे हैं एक बार संदंश के साथ उठाया जा करने में सक्षम होना चाहिए। आरपकड़ और रीढ़ की हड्डी कशेरुकाओं वापस खींचने के लिए जारी S4, जब तक प्रत्येक पटल के लिए यह कदम EPEAT।
    नोट: यह प्रत्यारोपण साइट के लिए नीचे कट जाता है एक बार प्रत्यारोपण साइट से ऊपर कशेरुकाओं संभावना आ जाएगा। बस प्रत्यारोपण साइट से नीचे शुरू करने की प्रक्रिया जारी है।
  10. वैकल्पिक: प्रत्यारोपण साइट है और उपाय और ~ प्रत्यारोपण साइट के लिए 20 मिमी व्याख्यान चबूतरे वाला और दुम कटौती देखने के लिए जहां नीचे कशेरुकाओं रखना।
    नोट: अधिक आम तौर पर 15 मिमी की तुलना में आगे की ओर पलायन नहीं करना प्रतिरोपित NPCs के रूप में की जरूरत नहीं किया जाएगा NPCs के रोपाई है। जरूरत रीढ़ की हड्डी की राशि प्रतिरोपित सेल प्रकार के प्रयोग और प्रवास विशेषताओं पर निर्भर हो जाएगा। प्रत्यारोपण साइट के लिए समान दूरी पर हैं कि व्याख्यान चबूतरे वाला और दुम कटौती करने इमेजिंग के दौरान और अधिक आसानी से स्थित हो प्रत्यारोपण साइट सक्षम हो जाएगा।
  11. एक # 11 ब्लेड के साथ एक स्केलपेल का उपयोग सावधानी से सही पर गैन्ग्लिया में कटौती करने और व्याख्यान चबूतरे वाला अंत में शुरू रीढ़ की हड्डी के उदर पक्ष के छोड़ दिया है। इस wबीमार और अधिक आसानी से उदर कशेरुकाओं से हटा दिया जाना रीढ़ की हड्डी को सक्रिय करें।
    नोट: जल्दी से किया (1.7-1.11 कदम), रीढ़ की हड्डी बाहर सूखी नहीं होगा। हालांकि, 1x पीबीएस नम रखने के लिए यह गर्भनाल को दिलाई जा सकती है।
  12. माउस पलटना और इसलिए रीढ़ की हड्डी के नीचे का सामना करना पड़ रहा है माउस को पकड़। ध्यान से बंद दाँतेदार Graefe संदंश का उपयोग रीढ़ की हड्डी बाहर छील। रीढ़ की हड्डी nicking बिना, ध्यान से रीढ़ की हड्डी में एक भी बरकरार टुकड़ा में बाहर उठाया जा करने के लिए अनुमति देने के लिए किसी भी शेष गैन्ग्लिया काटा।
  13. रीढ़ की हड्डी RPMI-1640 में है सुनिश्चित करें और 2P माइक्रोस्कोप के लिए परिवहन के लिए बर्फ पर जगह है।

इमेजिंग के लिए रीढ़ की हड्डी की 2. तैयारी

  1. Agarose में रीढ़ की हड्डी Embedding
    1. इमेजिंग के लिए पहले बर्फ पर ठंडा RPMI-1640 में पृथक रीढ़ की हड्डी रखें।
    2. Agarose (कम बीच बढ़िया तालमेल तापमान) वजन और 1x पीबीएस के 5 मिलीलीटर में एक 5% समाधान तैयार है। एजी भंग करने के लिए 15 सेकंड के लिए 5% agarose समाधान माइक्रोवेवउठी और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए शांत समाधान करते हैं।
    3. उदर पक्ष का सामना करना पड़ के साथ parafilm का एक पत्रक पर रखकर रीढ़ की हड्डी तैयार करें।
    4. Pipet रीढ़ की हड्डी के उदर पक्ष पर 5% agarose समाधान के लगभग 5 मिलीलीटर। Agarose के कमरे के तापमान को ठंडा करके जमना। पूर्ण दृढ़ीभवन लगभग 5 मिनट लगते हैं।
    5. एक 22 मिमी वर्ग कवर पर्ची के लिए ऊतक चिपकने के एक प्रकाश कोट लागू करें।
    6. Parafilm पर उदर पक्ष रखने, एम्बेडेड रीढ़ की हड्डी पलटना। पृष्ठीय पक्ष अब सामना करना पड़ रहा हो जाएगा। पृष्ठीय पक्ष को कवर पर्ची पालन करना है, और चिपकने वाला जमना को RMPI में agarose एम्बेडेड रीढ़ की हड्डी / कवर पर्ची तैयारी डूब। अतिरिक्त एक रेजर ब्लेड का उपयोग agarose जम निकालें।
  2. खुर्दबीन मंच पर रीढ़ की हड्डी बढ़ते
    1. कवर पर्ची के नीचे करने के लिए पेट्रोलियम जेली लागू करें। यह छिड़काव के दौरान तैयारी स्थिर होगा।
    2. एक में रीढ़ की हड्डी की तैयारी रखें25x सूई उद्देश्य की ओर का सामना करना पड़ उदर पक्ष के साथ खुर्दबीन मंच पर अच्छी तरह से इमेजिंग। कस्टम निर्मित इमेजिंग अच्छी तरह से लगभग 20 मिमी, गहरी 50 मिमी लंबी है, और भर में 50 मिमी है।
    3. छवि oxygenated गर्म के साथ तैयारी (37 डिग्री सेल्सियस), superfusing जबकि सीरम के बिना (95: कार्बन डाइऑक्साइड-carbogen: 5 ऑक्सीजन) RPMI-1640 मध्यम।
      1. पूर्व गर्म पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस के लिए मीडिया और यह मीडिया की बोतल में ट्यूबिंग डालने से ट्यूबिंग पंप से कनेक्ट।
      2. चैम्बर के लिए ट्यूबिंग के संबंध में 37 डिग्री सेल्सियस एक हीटर डिवाइस पर मीडिया के तापमान को बनाये रखें। Superfuse मीडिया अच्छी तरह से कम के माध्यम से 3 मिलीग्राम / ट्यूबिंग पंप (चित्रा 1 बी) से जुड़े ट्यूबिंग का उपयोग कर मिन।

वेंट्रल स्पाइनल कॉर्ड 3. 2P इमेजिंग

  1. माइक्रोस्कोप सेटअप
    1. 900 एनएम को देखते नीलम लेजर: एक गिरगिट अल्ट्रा तिवारी का उपयोग कर Thy1-EYFP रीढ़ की हड्डी डोरियों से छवियों मोल। पर लेजर शक्ति attenuate<5% करने के लिए नमूना न्यूनतम phototoxicity 16 सुनिश्चित करने के लिए। स्थिर इमेजिंग सुनिश्चित करने के लिए है, और ऊतक बहाव और सेलुलर क्षति को रोकने के लिए एक एकल इनलाइन समाधान हीटर का उपयोग कर एक निरंतर 37 डिग्री सेल्सियस पर ऑक्सीजन perfused RPMI-1640 perfusing द्वारा तापमान बनाए।
    2. EGFP और EYFP फ्लोरोसेंट संकेत अलग करने के लिए जानबूझ कर दृश्यता बढ़ाने के लिए हरी उत्सर्जन बंटवारे, तीन चैनलों में 2P उत्सर्जन अलग करने के लिए श्रृंखला में एक 520 एनएम एकल बढ़त dichroic और एक 560 एनएम एकल बढ़त dichroic बीम फाड़नेवाला जगह है।
      नोट: ये चैनल नीले-हरे (उत्सर्जन <520 एनएम), (520-560 एनएम) हरे-पीले और लाल (उत्सर्जन> 560 एनएम) के रूप में करने के लिए भेजा जाता है। Photomultiplier ट्यूब हर चैनल में प्रकाश उत्सर्जित का पता लगाने।
  2. ब्याज का पता लगाने इमेजिंग क्षेत्रों
    1. ऐपिस और एक उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश स्रोत का उपयोग करना, एक संदर्भ बिंदु सेट करने के लिए रीढ़ की हड्डी के उदर किनारे पर सूई उद्देश्य ध्यान केंद्रित।
    2. यकीन परिवेश प्रकाश स्रोत बंद और दप है बनाओलेजर शटर खोलने के द्वारा 2P उत्तेजना को खुजली।
    3. यदि उपलब्ध हो तो हित के क्षेत्रों के लिए ऊतक जब खोज, अंतिम छवियों को प्राप्त करने की तुलना में जब एक कम संकल्प की स्थापना, डिजिटल ज़ूम के बिना उच्च मात्रा और उच्च दर स्कैन का उपयोग करें। ब्याज की एक क्षेत्र के लिए ऊतक जब खोज इस प्रणाली के साथ विशिष्ट सेटिंग्स हैं: संकल्प: 256 पिक्सल; मात्रा: एक्स y = 600 माइक्रोन, = 600 माइक्रोन, जेड = 0-300 माइक्रोन।
    4. रीढ़ की हड्डी के उदर किनारे के पास EYFP एक्सोन को ध्यान से देखें। कोलेजन (नीला) से दूसरा हार्मोनिक संकेत रीढ़ की हड्डी के ऊतकों किनारे पर प्रतिभाशाली हो जाएगा। EYFP एक्सोन सिर्फ कोलेजन से दूसरे हार्मोनिक संकेत करने के लिए पृष्ठीय जानें और EYFP संकेत हरे-पीले चैनल में कल्पना की है।
    5. रीढ़ की हड्डी की तैयारी 14 के अनुदैर्ध्य केंद्र में प्रत्यारोपण साइट का पता लगाएँ। EGFP-एनपीसी प्रत्यारोपण निम्नलिखित चूहों एक दिन के लिए, गहरी ऊतक में Z विमान में किरण पथ ध्यान केंद्रित करके प्रत्यारोपण साइट का पता लगाने। प्रत्यारोपण साइट वाईडालूँगा जानवरों के बीच थोड़ा भिन्न हो लेकिन आम तौर पर उदर किनारे से ~ 200 माइक्रोन स्थित है। 1 दिन बाद प्रत्यारोपण के बाद चूहों में उदर और पार्श्व किनारों के करीब, सफेद बात इलाकों में EGFP-NPCs के समूहों को ध्यान से देखें।
  3. अंतिम छवियों को प्राप्त करने
    1. 512 पिक्सल की छवि संकल्प मोल; मात्रा: एक्स = 270 Y माइक्रोन, = 212 माइक्रोन, और z = 100 माइक्रोन का उपयोग कर Slidebook 6 सॉफ्टवेयर। 2.5 माइक्रोन वेतन वृद्धि में अनुक्रमिक फोकल विमानों प्राप्त करके Z ढेर संकलित करें।
    2. रीढ़ की हड्डी में किसी भी पलायन वस्तुओं की तेजी मात्रा का ठहराव सुनिश्चित करने के लिए ऑफसेट उचित जिल्द के साथ एक द्विदिश स्कैन प्रदर्शन। रीढ़ की हड्डी में लगभग एक फ्रेम / सेक है के भीतर आदर्श अधिग्रहण फ्रेम दर सेलुलर वेग निर्धारित करने के लिए सुनिश्चित करें।
      नोट: इमेजिंग सेटिंग्स इस तरह के अधिग्रहण फ्रेम दर, इमेजिंग संकल्प और इमेजिंग संस्करणों के रूप में अलग-अलग उपयोगकर्ता वरीयताओं, बदला जा सकता है। बड़ा इमेजिंग संस्करणों आम तौर पर एक giv पर प्राप्त करने के लिए लंबे समय तक ले जाएगाएन संकल्प।
    3. ऐसे Bitplane Imaris 7.7 के रूप में छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ फसल, चिकनी, और pseudocolor Slidebook छवि फ़ाइलें, विश्लेषण। Slidebook और Imaris में एक स्वचालित प्रक्रिया का उपयोग कर लगातार इमेजिंग संस्करणों तलाशी द्वारा अंतिम समय चूक वीडियो उत्पादन।

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Representative Results

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Explanted रीढ़ की हड्डी इमेजिंग प्रोटोकॉल रीढ़ की हड्डी के भीतर किसी भी प्रतिदीप्ति कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हमारे प्रतिनिधि परिणाम EYFP-axons के साथ EGFP-एनपीसी बातचीत प्रदर्शित करता है। सबसे पहले, हम चित्रा 1 ए में एम्बेडेड उदर रीढ़ की हड्डी की तैयारी दिखा। अगला, हम चित्रा 1 बी में 2P माइक्रोस्कोप सेटअप और प्रमुख घटकों में दिखाते हैं। दो उदर रीढ़ की हड्डी के भीतर एक एकल z ढेर में EGFP और EYFP प्रतिदीप्ति दर्शाता चित्रा। लगातार जेड के ढेर के अधिग्रहण बरकरार ऊतक के भीतर वास्तविक समय सेलुलर गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए समय चूक वीडियो का निर्माण करने के लिए संकलित किया जा सकता है। एक 520 एनएम एकल बढ़त dichroic और एक 560 एनएम एकल बढ़त dichroic बीम फाड़नेवाला का उपयोग करना, प्रोटोकॉल में नोट के रूप में, EGFP और EYFP संकेत अलग नहीं कर सकता। व्यक्तिगत चैनल हरे और पीले रंग का उपयोग कर इमेजिंग सॉफ्टवेयर pseudocolored जा सकता है।

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चित्रा 1: रीढ़ की हड्डी और माइक्रोस्कोप सेटअप। (ए) (बाएं) एक 5% agarose जेल में एम्बेडेड एक रीढ़ की हड्डी और अतिरिक्त agarose (दाएं) को हटाने के बाद एक coverslip पर मुहिम शुरू की। (बी) में लेबल प्रमुख घटकों के साथ माइक्रोस्कोप सेटअप की एक छवि। 1. पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर निर्धारित किया है। 2. RPMI-1640 पूर्व गर्म। 3. सी / एल चर गति ट्यूबिंग पंप। 4. एकल इनलाइन समाधान हीटर। 5. सूई उद्देश्य। 6. डिजिटल थर्मामीटर। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: उदाहरण 2P छवि उदर रीढ़ की हड्डी के अंदर का अधिग्रहण एक असंक्रमित, गैर क्षतिग्रस्त (ए) के उदर पक्ष और JHMV संक्रमित, demyelinated (बी) रीढ़ की हड्डी के 3 डी पुनर्निर्माण।EGFP लेबल NPCs के साथ एक Thy1-EYFP माउस निम्नलिखित प्रत्यारोपण से। Fluorescently लेबल axons के पीले pseudocolored कर रहे हैं और NPCs हरी pseudocolored कर रहे हैं। छवि संकल्प: 512 पिक्सल; छवि मात्रा: (ए) एक्स = 239 माइक्रोन, वाई 259 माइक्रोन, 65 माइक्रोन 26 जेड के ढेर प्रयोग का निर्माण = Z का उपयोग कर 2.5 अलग माइक्रोन और एक्स = 497 माइक्रोन, वाई = 389 माइक्रोन, जेड = 127.5 मीटर का निर्माण (बी) स्थान दिया = 51 जेड के ढेर 2.5 माइक्रोन के अलावा दूरी।

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Discussion

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रियल-टाइम बरकरार ऊतक के 2P इमेजिंग demyelinated माउस रीढ़ की हड्डी में प्रत्यारोपण निम्नलिखित एनपीसी कैनेटीक्स और बातचीत की जांच करने के लिए आवश्यक है। Intravital 2P इमेजिंग आमतौर पर रहने वाले चूहों में रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय पक्ष पर सेलुलर गतिशीलता निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और रोग 17-19 demyelinating में पृष्ठीय demyelination अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। प्रतिरोपित NPCs के 2P माइक्रोस्कोपी का उपयोग बगल में छवि के लिए भी गहरी निहित है जो उदर सफेद पदार्थ, की ओर पलायन की वजह से हालांकि, एक पूर्व vivo तैयारी जरूरी है। इस पद्धति क्षतिग्रस्त और गैर क्षतिग्रस्त रीढ़ की हड्डी 6 में प्रतिरोपित NPCs के गतिशीलता और remyelination कैनेटीक्स निर्धारित करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया गया है। पूर्व vivo तैयारी न केवल अनुलंबीय रीढ़ की हड्डी डोरियों की स्कैनिंग के लिए सक्षम है लेकिन यह भी transversely उदर पक्ष 6,20 से । यह टी में सेल आंदोलन में मतभेद (गति और दिशा) और बातचीत के विश्लेषण के लिए अनुमति देता हैप्रत्यारोपण साइट के लिए आसन्न, और प्रत्यारोपण साइट छह से विभिन्न दूरी पर ransplant साइट। हम शुरू में रीढ़ की हड्डी के उदर पक्ष पर EGFP-NPCs के प्रतिरोपित छवि के लिए इस तैयारी तैयार कर लिया है, जबकि यह छवि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है किसी भी fluorescently लेबल या उदर, पृष्ठीय से रंगे सेल, या पार्श्व पक्षों रीढ़ की हड्डी है अभिविन्यास बदलकर मुहिम शुरू की। Intravital इमेजिंग पर इस तैयारी का लाभ उदर पक्ष इमेजिंग की इजाजत दी है और अभी भी दोहराया सर्जरी 19,21 बिना एकाधिक इमेजिंग सत्र के लिए अनुमति देते हैं कि एक 'कांच की खिड़की' स्थापना का उपयोग कर नए intravital तैयारी के साथ की जरूरत है जो anesthetization और अस्तित्व सर्जरी के लिए की जरूरत है, कमी शामिल । यह रीढ़ की हड्डी निकाल दिया जाता है के बाद से intravital इमेजिंग के साथ संयोजन में 'कांच की खिड़की' दृष्टिकोण की तुलना में इस प्रक्रिया की एक सीमा है, एक माउस से कई बार अंक हासिल करने में असमर्थता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए और माउस euthanized है।

2P इमेजिंग आदर्श बरकरार ऊतकों 22,23 के भीतर एकल कक्षों की गतिशीलता को हल करने के लिए अनुकूल है। 2P उत्तेजना न्यूनतम phototoxicity साथ गहरी ऊतक इमेजिंग की विस्तारित अवधि के लिए अनुमति देते हैं कि लगभग अवरक्त फोटॉनों का इस्तेमाल करता। 2P उत्तेजना एक फ्लोरोफोरे द्वारा दो फोटॉनों के एक साथ अवशोषण पर होता है। 2P उत्तेजना के लिए आवश्यक फोटॉनों के उच्च एकाग्रता एक भी फोकल हवाई जहाज़ पर 2P लेजर उत्पादन की spatio- लौकिक संपीड़न द्वारा हासिल की है। यह आगे फोकल हवाई जहाज़ के बाहर रीढ़ की हड्डी क्षेत्रों में phototoxicity को न्यूनतम करने, केन्द्र बिन्दु को फ्लोरोसेंट उत्तेजना प्रतिबंधित करता है। लगभग अवरक्त फोटॉनों भी लगभग 300 माइक्रोन रीढ़ की हड्डी 16 के उदर की ओर से अप करने के लिए इमेजिंग, सक्रिय करने के बिखरने को कम कर दिया।

किसी भी नई तकनीक के साथ के रूप में, हालांकि, explanted रीढ़ की हड्डी के 2P इमेजिंग ध्यान में रखा जाना चाहिए कि सीमाएं हैं। इस इमेजिंग प्रोटोकॉल एक 520 एनएम dichro का इस्तेमालआम तौर पर नीले रंग की रोशनी के लिए आरक्षित फ्लोरोसेंट चैनल में EGFP उत्सर्जन हटाने से EGFP और EYFP प्रतिदीप्ति की जुदाई में सक्षम बनाता है कि आईसी दर्पण। रीढ़ की हड्डी में कोलेजन के द्वारा बनाई गई दूसरा हार्मोनिक पीढ़ी भी नीले चैनल में दिखाई देता है, लेकिन हरे-पीले चैनल के रूप में पहचाने जाने योग्य इस तैयारी में काफी चमक रहे हैं, और उनके उत्सर्जन का एक हिस्सा है जो EGFP लेबल कोशिकाओं से आसानी से विख्यात है कोलेजन नहीं करता है। चैनल सम्मिश्रण और विशिष्ट dichroics का उपयोग कर एक उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के विभिन्न भागों की जुदाई की इस तकनीक को अक्सर बंद करने या लगभग अतिव्यापी उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ व्यक्तिगत fluorophores के दृश्य या स्वचालित पहचान के लिए उपयोगी है। Phototoxicity इस 2P इमेजिंग प्रोटोकॉल की एक और सीमा है। एक एकल इमेजिंग मात्रा के भीतर कोशिकाओं phototoxicity के प्रति संवेदनशील हैं; इसलिए, experimentalist phototoxicity के संकेत के गौर से अवगत होना चाहिए। Phototoxicity आम तौर पर कमी या सेल के अभाव में पहले से स्पष्ट हैगतिशीलता, स्थानीय ऊतकों में और / या morphological परिवर्तन photobleaching द्वारा पीछा किया। कई कारकों के ऊतकों phototoxicity के लिए अग्रणी या रहते सेल इमेजिंग के लिए अनुपयुक्त यह प्रतिपादन नुकसान पहुंचा सकता है। यह perfused RPMI-1640 की लेजर शक्ति और तापमान और oxygenation पर नजर रखने के लिए महत्वपूर्ण है। यह अत्यधिक खींच या रीढ़ की हड्डी के compressing के बिना और ब्लेड के साथ रीढ़ की हड्डी काटने के बिना माउस से रीढ़ की हड्डी के उचित हटाने सुनिश्चित करने के लिए भी जरूरी है। अगर ठीक से संभाला दस घंटे के बाद निकासी में कोई कमी के साथ उदर रीढ़ की हड्डी के भीतर मजबूत सेलुलर गतिशीलता द्वारा निर्धारित रूप में, explanted रीढ़ की हड्डी की तैयारी, दस घंटे के लिए व्यवहार्य रहेगा। निकाले ऊतक की एक किस्म आमतौर पर समय की लंबी लंबाई के लिए imaged और 23-26 व्यवहार्य माना जाता है। इसलिए, एक भी रीढ़ की हड्डी के भीतर कई क्षेत्रों में सेलुलर गतिशीलता की मात्रा का ठहराव संभव है। अंत में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कोशिकाओं था की विशाल बहुमतटी fluorescently (स्वाभाविक रूप से autofluorescent जब तक) इस तैयारी से कल्पना नहीं की जाएगी लेबल नहीं हैं, और यह है कि लेबल कोशिकाओं अन्य लेबल हटाया गया, मालूम होता है अदृश्य अंतर्जात कोशिकाओं और संरचनात्मक तत्वों का एक जटिल पर्यावरण के साथ बातचीत कर रहे हैं स्वीकार करने के लिए महत्वपूर्ण है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane, USP Piramal Critical Care, Inc N/A
Fine scissors Fine Science Tools 14060-09 sharp
scalpel blade #10 Fine Science Tools 10010-00
scalpel handle Fine Science Tools 10003-12
Luer rongeurs Fine Science Tools 16001-15
Graefe forceps Fine Science Tools 11052-10
Vannas scissors Fine Science Tools 15615-08
scalpel blade #11 Fine Science Tools 10011-00
RPMI-1640 Gibco 12-115F
agarose, low gelling temperature Sigma A9414-25G
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12
Vetbond (tissue adhesive) 3M 1469SB
22 mm square cover slip Fisher Scientific 12-547
25X dipping objective, 1.1 NA Nikon CFI Apo LWD 25XW
Single inline solution heater Warner Instruments 64-0102
520 nm single-edge dichroic beam splitter Semrock FF520-Di02-25x36 Brightline
560 nm single-edge dichroic beam splitter Semrock FF560-FDi01-25x36 Brightline
photomultiplier tubes Hamamatsu R928
C/L variable-speed tubing pump Masterflex 77122-22
digital thermometer Comar Instruments 3501
Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser  Coherent N/A
Slidebook 6 software 3i N/A
Imaris 7.7 software Bitplane N/A

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References

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माउस रीढ़ की हड्डी में सेलुलर गतिशीलता के दो photon इमेजिंग
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Weinger, J. G., Greenberg, M. L., Matheu, M. P., Parker, I., Walsh, C. M., Lane, T. E., Cahalan, M. D. Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord. J. Vis. Exp. (96), e52580, doi:10.3791/52580 (2015).More

Weinger, J. G., Greenberg, M. L., Matheu, M. P., Parker, I., Walsh, C. M., Lane, T. E., Cahalan, M. D. Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord. J. Vis. Exp. (96), e52580, doi:10.3791/52580 (2015).

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