Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

To-foton Imaging av Cellular Dynamics i Mouse Spinal Cord

doi: 10.3791/52580 Published: February 22, 2015

Summary

En ny ex vivo preparat for avbilding av musen ryggmargen. Denne protokollen gir mulighet for to-foton avbildning av levende cellulære interaksjoner i hele ryggmargen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Musemodeller av demyelinisering, herunder eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) og intrakranielle infeksjon med neuroadapted mus hepatitt virus (MHV), er gode verktøy for å studere molekylære stier og cellulære interaksjoner forbundet med sykdom. De har ført til og støttet effektiviteten av FDA godkjente farmasøytiske behandlinger, hovedsakelig rettet mot opphør av autoimmunitet og betennelse en. Men når endogent remyelinisering har sviktet, de allerede godkjente behandlingsformer ikke effektivt reparere demyelinerte lesjoner i sentralnervesystemet. Derfor reparasjon fokusert terapi på dette stadium av sykdommen er avgjørende for lindring av kroniske symptomer og forbedring av livskvalitet. Nylig har nevrale forløperceller (NPC) kommet i forgrunnen som en potensiell regenerativ terapeutisk modalitet å målrette områder med betennelse og demyelinisering. Flere studier har markert evne NPCer å indusere endogenooss remyelinisering og delta direkte i remyelinisering 2-8. Fordi NPCer er involvert i direkte remyelinisering, er det viktig å forstå deres kinetikk og interaksjoner med endogene celler etter transplantasjon. Etter transplantasjon, NPCer migrere ventralt til områder av hvit substans skade, så rostrally og caudally forhold til transplantasjon området 5,9. Kinetikken til migrasjon forskjellig respons på miljømessige signaler; NPCer transplantert inn i en ikke-skadet ryggmargen har større hastigheter enn NPCer transplantert inn en skadet ryggmarg 6. Etter en trekkfugl periode, overføres NPCer sprer mye, på en høyere rente i en skadet ryggmarg i forhold til en intakt ryggmarg 6. Til slutt, de fleste av NPCer differensieres til oligodendrocytter og initiere direkte remyelinisering 4,6,9.

Den demyelinerte lesjon er komplekse og kan inkludere en mangfoldig befolkning av celler på ulike stadier av enctivation. For eksempel kan en aktiv multippel sklerose (MS) lesjon omfatter en betydelig populasjon av aktiverte T-celler, mikroglia M1 og M1 makrofager, men en kronisk stille MS lesjon kan bestå hovedsakelig av reaktive astrocytter med få betennelsesceller 10-13. På grunn av mangfoldet av effektorcellene, to-foton (2P) bildebehandling i musemodeller av demyelinisering er et svært nyttig verktøy for å forstå lokale cellulære interaksjoner i lesjonen. I MS og mange utstrakt bruk MS forskningsmodeller, er de fleste av lesjoner ligger på ventral side av ryggmargen, en region utilgjengelig for intra 2P bildebehandling grunn lesjon dybde og det høye fettinnholdet i ryggmargen. For å omgå disse problemene og studie celle-celle interaksjoner innenfor lesjoner langs ventral ryggmarg vi har utviklet en enkel ex vivo 2P bildebehandling forberedelse 6.

Denne studien følger opp en tidligere metoder publikasjon, som visteprosedyren for å transplantere forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) -expressing NPCer i ryggmargen av mus etter JHMV stamme av MHV-indusert demyelination 14. Fem uker gamle mus er smittet med JHMV og transplantert med EGFP-NPCs på thorax nivå 9 på dag 14 etter smitte. Protokollen presenteres her gir detaljert fremgangsmåte på hvordan du kan hente den ryggmargen, lage en ex vivo agarose forberedelse, og bilde transplantert EGFP-NPC interaksjoner med forbedret gul fluoriserende protein (EYFP) -expressing aksoner. Mus som uttrykker EYFP under neuronal spesifikke Thy1 promoteren ble brukt i denne fremgangsmåten 15. Bare noen av axoner uttrykke EYFP, noe som gjør det nyttig for å avbilde individuelle axoner. Her viser vi ryggmargen fjernes 7 dager etter transplantasjonen; Imidlertid kan ryggmargen ekstraheres på ethvert tidspunkt etter transplantasjonen. Mens vi vise interaksjoner av NPCer med skadet axoner, kan vår protokoll brukes i kombinasjon med genetiske fluorescerende markørerav andre celletyper for å undersøke en rekke cellulære interaksjoner som forekommer i løpet av mus ryggmargen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

MERK: Etikk Uttalelse: Protokollen for dyr håndtering ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of California, Irvine, protokoll # 2010-2943.

1. Fjerning av Spinal Cord

  1. Plassere tørkepapir fuktet med ~ 100% flytende isofluran, USP i euthanizing kammer og plassere tørr tørkepapir på toppen. Plasser musen i kammer på toppen av tørre tørkepapir slik at musen ikke er i kontakt med isofluran og sørge for at kammeret er dekket. Vent minst ett minutt etter opphør av pust for å sikre at musen er avlives.
  2. Utfør en spinal transection av nakken for å sikre musen avlives. Ikke utfør en halshugging, da dette kan skade ryggmargen.
  3. Spray-mus med 70% etanol for å fukte håret.
  4. Bruk skarpe Fin saks for å fjerne hår og hud fra baksiden av musen til å utsette ryggsøylen fra ca cervical lamina 1 (C1) Til sakral lamina 4 (S4).
  5. Ved hjelp av en skalpell med en # 10 blad, gjøre snitt til venstre og høyre for ryggsøylen for å skille den fra muskler og fett. Dette vil gjøre fjerning av ryggmargen mye enklere.
  6. valgfritt: en krummet Luer Rongeurs kan brukes til å øse bort ekstra kjøtt.
  7. Mens du holder toppen av ryggvirvler med taggete Græfe tang, setter titan buet Vännäs saks med den buede siden opp i den eksponerte ryggsøylen ved C1, være forsiktig med å ta på ryggmargen.
  8. Skyv titanium buet Vännäs saks hele veien til høyre og lage ett lite kutt. En liten knase lyden skal bli hørt og følte som saksen kutte ryggvirvlene. Gjenta dette kuttet helt til venstre side av ledningen. Vær forsiktig så du ikke gå for fort eller gjøre for stor for et kutt som dette vil risikere å skade ledningen med saksen.
  9. Den eneste lamina bør være i stand til å bli løftet med pinsett når de sider av ryggsøylen blir kuttet. REPEAT dette trinnet for hver lamina til S4, fortsetter å holde i og trekke tilbake ryggmargen ryggvirvlene.
    MERK: ryggvirvlene over transplantasjon området vil trolig komme ut når det er kuttet ned til transplantasjon nettstedet. Fortsett prosedyren som starter rett under transplantasjon nettstedet.
  10. valgfritt: lå ryggvirvlene ned for å se hvor transplantasjon nettstedet er og måle og kutte ~ 20 mm rostralt og kaudalt for transplantasjon nettstedet.
    MERK: Når transplantere NPCer mer vil ikke være nødvendig som de transplanterte NPCer generelt ikke migrere lenger enn 15 mm. Mengden av ryggmargen er nødvendig vil være avhengig av eksperimentet og migrasjons egenskapene til celletype transplantert. Making rostral og caudal kutt som er like langt til transplantasjon området vil gjøre det mulig for transplantasjon for å være plassert lettere under bildebehandling.
  11. Ved hjelp av en skalpell med en # 11 blad må du kutte ganglia på høyre og venstre side av ventral side av ryggmargen starter på rostral slutten. Dette will gjøre det mulig for ryggmargen til å bli fjernet fra den ventrale virvler lettere.
    MERK: Ferdig raskt (trinn 01.07 til 01.11), vil ryggmargen ikke tørke ut. Imidlertid kan 1x PBS gis til ledningen for å holde det fuktig.
  12. Snu musen og hold musa opp slik at ryggmargen er vendt ned. Nøye skrelle ut ryggmargen ved hjelp av lukkede taggete Græfe tang. Uten å sammenpressing ryggmargen, forsiktig kuttet eventuelle gjenværende ganglia å tillate ryggmargen til å bli løftet ut i et enkelt stykke intakt.
  13. Sørg for at ryggmargen er i RPMI-1640 og plassere den på isen for transport til 2P mikroskop.

2. Utarbeidelse av Spinal Cord for Imaging

  1. Embedding ryggmargen i agarose
    1. Hold den isolerte ryggmargen i kjølt RPMI-1640 på is før bildebehandling.
    2. Vei ut agarose (lav geleringstemperatur), og fremstille en 5% oppløsning i 5 ml 1 x PBS. Mikrobølgeovn i 5% agarose-løsning i 15 sekunder for å oppløse agreiste seg og la løsningen avkjøles til 37 ° C.
    3. Forberede ryggmargen ved å plassere den på et ark med Parafilm med ventral siden opp.
    4. Pipet ca 5 ml 5% agarose løsning over ventral side av ryggmargen. La agarosen stivner ved avkjøling til romtemperatur. Full størkning tar ca 5 min.
    5. Påfør et tynt lag med vev lim til en 22 mm firkantet dekkglass.
    6. Snu den innebygde ryggmargen, plassere den ventrale siden på Parafilm. Dorsal side vil nå vende opp. Følge dekkglass til dorsal side, og senk den agarose innebygd ryggmargen / dekkglass forberedelse i RMPI å stivne limet. Fjern overflødig størknet agarose bruker et barberblad.
  2. Montering på ryggmargen på objektbordet
    1. Påfør vaselin til bunnen av dekkglass. Dette vil stabilisere forberedelser under perfusjon.
    2. Plasser ryggmargen forberedelse i enbildebehandling godt på mikroskopet scenen med den ventrale siden opp mot 25X dipping objektiv. Den spesialbygde bildebehandling vel er ca 20 mm dyp, 50 mm lang, og 50 mm i diameter.
    3. Bilde mens superfusing fremstillingen med varmet (37 ° C) oksygenert (95: 5 oksygen: karbon-dioksyd-karbogen) RPMI-1640 medium uten serum.
      1. Pre-varm media til 37 ° C i vannbad og koble den til slangen pumpen ved å sette inn slangen inn i medie flaske.
      2. Behold medietemperaturen ved 37 ° C en varmekilde-enhet ved tilkobling av slangen til kammeret. Superfuse media gjennom brønn ved 3 ml / min ved hjelp av rør som er koblet til produksjonsrøret pumpe (figur 1B).

3. 2P Imaging av Ventral Spinal Cord

  1. Mikroskop Setup
    1. Hente bilder fra Thy1-EYFP ryggmargen ved hjelp av en Chameleon Ultra Ti: Sapphire laser innstilt til 900 nm. Dempe laser makt påprøven til <5% for å sikre minimal fototoksisitet 16. Oppretthold temperaturen ved perfusert oksygen-perfusert RPMI-1640 ved en konstant 37 ° C ved hjelp av en enkelt inline løsning ovn for å sikre stabil avbildning, og for å hindre avdrift vev og celleskader.
    2. Å skille EGFP og EYFP fluorescerende signal, plassere en 520 nm single-edge dichroic og en 560 nm single-edge dichroic stråledeler i serie for å skille 2P utslipp i tre kanaler, med hensikt å splitte den grønne utslipp for å øke synligheten.
      MERK: Disse kanal omtales som blågrønne (utslipp <520 nm), grønn-gul (520-560 nm), og rød (utslipp> 560 nm). Fotomultiplikatorrør oppdager lyset i hver kanal.
  2. Finne bilde områder av interesse
    1. Ved hjelp av okularet og et lyst felt lyskilde, fokusere dyppe mål på den ventrale kant av ryggmargen for å angi et referansepunkt.
    2. Sørg for at omgivelseslyset kilden er avslått og swklør å 2P eksitasjon ved å åpne laser lukkeren.
    3. Hvis tilgjengelig, når du søker vev for områder av interesse, kan du bruke en lavere oppløsning, høyere volum uten digital zoom, og høyere skannehastighet enn når anskaffe endelige bildene. Typiske innstillinger med dette systemet når du søker vev for en region av interesse er: oppløsning: 256 piksler; volum: x = 600 nm, y = 600 gm, z = 0 til 300 um.
    4. Observere EYFP axoner nær ventral kanten av ryggmargen. Andre harmoniske signal fra kollagen (blå) vil være lysest i ryggmargen vev kanten. Lokalisere EYFP aksoner bare dorsal til den andre harmoniske signal fra kollagen og EYFP signal visualiseres i den gul-grønne kanalen.
    5. Finn transplantasjon området i lengde sentrum av ryggmargen forberedelse 14. For mus 1 dag etter EGFP-NPC transplantasjon, finn transplantasjon nettstedet ved å fokusere strålen banen i z-planet dypt inn i vevet. Transplantasjon nettstedet will variere litt mellom dyr, men er vanligvis plassert ~ 200 mikrometer fra ventral kanten. Observere klynger av EGFP-NPCer i hvit substans traktater, nærmere ventral og sidekanter hos mus etter dag en post-transplantasjon.
  3. Anskaffe endelige bildene
    1. Erverve bildeoppløsning på 512 piksler; volum: x = 270 nm, y = 212 gm, og z = 100 um ved anvendelse av Slidebook 6-programvare. Kompilere z-stabler ved å kjøpe sekvensielle fokalplanene i trinn 2,5 mikrometer.
    2. Utfør en toveis skanning med riktig interlace offset for å sikre rask kvantifisering av eventuelle migrere gjenstander i ryggmargen. Sørg for at den ideelle kjøpet bildefrekvens for å bestemme celle hastighet i ryggmargen er ca 1 ramme / sek.
      MERK: Innstillingene Imaging kan endres til individuelle brukerinnstillinger, for eksempel oppkjøp bildefrekvens, bildeoppløsning og bildevolumer. Større bildevolumer vil vanligvis ta lengre tid å tilegne seg på en GIVno oppløsning.
    3. Analysere, beskjære, glatt, og pseudocolor Slidebook bildefiler med bildeanalyse programvare som bitplanet Imaris 7.7. Produsere endelige time-lapse videoer ved kjemming påfølgende bilde volumer ved hjelp av en automatisert prosess i Slidebook og Imaris.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mens eksplantert ryggmarg bilde protokollen kan brukes til å visualisere noen fluorescens i ryggmargen, våre representative resultatene viser EGFP-NPC interaksjoner med EYFP-aksoner. Først viser vi den innebygde ventral ryggmarg forberedelse i figur 1A. Deretter viser vi 2P mikroskop oppsettet og nøkkelkomponenter i figur 1B. Figur 2 viser EGFP og EYFP fluorescens i en enkelt z-stack i ventral ryggmargen. Oppkjøp av påfølgende z-stabler kan kompileres til å produsere tids-lapse videoer for å analysere sanntids cellulære dynamikk innenfor intakt vev. Ved hjelp av en 520 nm single-edge dichroic og en 560 nm single-edge dichroic stråledeler, som nevnt i protokollen, kan skille EGFP og EYFP signal. Individuelle kanaler kan pseudocolored grønn og gul bruker bildebehandlingsprogrammer.

80 / 52580fig1.jpg "/>
Figur 1: Ryggmargs og mikroskop oppsett. (A) En ryggmarg innleiret i en 5% agarosegel (til venstre) og montert på et dekkglass etter fjerning av overskudd av agarose (høyre). (B) Et bilde av mikroskopet oppsett med nøkkelkomponenter merket. 1. Vann-bad innstilt ved 37 ° C. 2. Pre-varmet RPMI-1640. 3. C / L variabel hastighet tubing Pump. 4. Enkelt inline løsning varmeapparat. 5. Dipping objektiv. 6. Digital termometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Eksempel 2P image kjøpt inne i ventral ryggmarg 3D rekonstruksjoner av den ventrale siden av en frisk, ikke-skadet (A) og JHMV-smittet, demyelinerte (B) ryggmargen.fra en Thy1-EYFP mus etter transplantasjon med EGFP-merket NPCer. Fluoresceinmerkede aksoner er pseudocolored gul og NPCer er pseudocolored grønt. Bildeoppløsning: 512 piksler; bildevolum: (A) x = 239 nm, y = 259 gm, z = 65 um konstruert ved hjelp av 26 z-stabler adskilt 2,5 um fra hverandre, og (B) x = 497 nm, y = 389 gm, z = 127,5 um konstruert ved hjelp 51 z-stabler linjeavstand 2,5 mikrometer fra hverandre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sanntids 2P avbildning av intakt vev er nødvendig for å etterforske NPC kinetikk og interaksjoner etter transplantasjonen inn i demyelinerte mus ryggmargen. Intravital 2P avbildning er vanlig brukt for å bestemme celle dynamikk på ryggsiden av ryggmargen i levende mus, og har blitt brukt til å studere dorsal demyelinisering i demyeliniserende sykdom 17-19. Men fordi transplanterte NPCer migrere til ventral hvit substans, som ligger for dypt til bilde in situ ved hjelp 2P mikroskopi, er en ex vivo forberedelse nødvendig. Denne metodikken har vært anvendt i vårt laboratorium å bestemme motilitet og remyelinering kinetikken for NPC transplantert inn i det skadede og ikke-skadede ryggmargen 6. Ex vivo-preparater muliggjøre skanning av ryggmargen, ikke bare i lengderetningen, men også i tverretningen fra den ventrale side 6,20 . Dette gir mulighet for analyse av forskjeller i celle bevegelse (hastighet og retning) og interaksjoner på transplant området, som grenser til transplantasjon nettstedet, og på forskjellige avstander fra transplantasjon nettstedet seks. Mens vi i utgangspunktet utviklet dette preparatet til bilde transplantert EGFP-NPCer på ventral side av ryggmargen, kan den brukes til bilde noen fluoresceinmerket eller farget celle fra ventral, dorsal, eller laterale sider ved å endre retningen ryggmargen er montert. Fordeler med dette preparatet i løpet intra bildebehandling inkluderer tillater ventral side bildebehandling og mangler behovet for anesthetization og overlevelse kirurgi, som fortsatt er nødvendig med de nye intra forberedelsene ved hjelp av en "glassvindu 'oppsett som gir mulighet for flere bildebehandlings økter uten gjentatte operasjoner 19,21 . Det bør bemerkes at en begrensning av denne fremgangsmåten i forhold til den "glassvindu 'tilnærming i kombinasjon med intravital avbildning er den manglende evne til å oppnå multiple tidspunkter fra en enkelt mus, ettersom ryggmargen er fjernet og musen avlives.

2P bildebehandling er ideell for å løse dynamikken i enkeltceller innenfor intakt vev 22,23. 2P eksitasjon benytter nær-infrarøde fotoner som gir mulighet for lengre perioder med dype vev bildebehandling med minimal fototoksisitet. 2P eksitasjon skjer ved den samtidige opptak av to fotoner med en fluorophore. Den høye konsentrasjonen av fotoner som er nødvendige for 2P eksitering oppnås ved rom-tid-kompresjon av 2P laserutgang på et enkelt fokusplan. Dette begrenser fluorescerende eksitasjon til navet, ytterligere minimere fototoksisitet i ryggmargs regioner utenfor fokusplanet. Nær-infrarøde fotoner har også redusert spredning, slik at bilde opp til ca 300 mikrometer fra ventral side av ryggmargen 16.

Som med alle nye teknikken, men 2P avbildning av eksplantert ryggmargen har begrensninger som må holdes i tankene. Denne bilde protokollen benytter en 520 nm dichroic speil som gjør det mulig separasjon av EGFP og EYFP fluorescens ved å avlede EGFP utslipp til fluorescerende kanalen vanligvis reservert for blått lys. Second-harmonisk generasjon skapt av kollagen i ryggmargen vises også i den blå kanalen, men er lett skilles fra EGFP-merkede celler som er betydelig lysere i dette preparatet, og har en del av sine utslipp identifiserbare i den gul-grønne kanalen som kollagen ikke. Denne teknikken med kanalen blanding og separering av forskjellige deler av et emisjonsspektra ved hjelp av bestemte dichroics er ofte nyttig for visuell eller automatisk identifikasjon av individuelle fluoroforer med tett eller nesten overlapper emisjonsspektrene. Fototoksisitet er en annen begrensning av denne 2P avbildningsprotokollen. Celler i en enkelt avbildning volum er følsomme for fototoksisitet; derfor bør experimentalist være svært oppmerksom på tegn på fototoksisitet. Fototoksisitet er typisk først tydelig i reduksjon eller manglende cellemotilitet, etterfulgt av fotobleking og / eller morfologiske endringer i lokale vev. Flere faktorer kan skade vevet som fører til fototoksisitet eller gjengi det uegnet for live-cell imaging. Det er viktig å overvåke lasereffekten og temperatur og oksygentilførsel av perfusert RPMI-1640. Det er også viktig å sikre forsvarlig fjerning av ryggmargen fra mus uten overdreven strekking eller komprimering av ryggmargen og uten å kutte ryggmargen med knivene. Hvis det håndteres riktig, vil eksplantert ryggmarg forberedelse være levedyktig i opptil ti timer, som bestemmes av robust mobil bevegelighet innenfor ventral ryggmargen uten reduksjon på ti timer etter utvinning. En rekke ekstrahert vev er ofte avbildes i lange lengder av tid og anses levedyktig 23-26. Derfor er kvantifisering av cellulære dynamikk i flere regioner i et enkelt ryggmarg mulig. Til slutt bør det legges merke til at det store flertall av celler that er ikke fluorescensmerkede vil ikke bli visualisert ved dette preparat (med mindre naturligvis autofluorescent), og det er viktig å erkjenne at det merkede celler er i samspill med et komplekst miljø av andre umerkede, tilsynelatende usynlige endogene celler og strukturelle elementer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane, USP Piramal Critical Care, Inc N/A
Fine scissors Fine Science Tools 14060-09 sharp
scalpel blade #10 Fine Science Tools 10010-00
scalpel handle Fine Science Tools 10003-12
Luer rongeurs Fine Science Tools 16001-15
Graefe forceps Fine Science Tools 11052-10
Vannas scissors Fine Science Tools 15615-08
scalpel blade #11 Fine Science Tools 10011-00
RPMI-1640 Gibco 12-115F
agarose, low gelling temperature Sigma A9414-25G
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12
Vetbond (tissue adhesive) 3M 1469SB
22 mm square cover slip Fisher Scientific 12-547
25X dipping objective, 1.1 NA Nikon CFI Apo LWD 25XW
Single inline solution heater Warner Instruments 64-0102
520 nm single-edge dichroic beam splitter Semrock FF520-Di02-25x36 Brightline
560 nm single-edge dichroic beam splitter Semrock FF560-FDi01-25x36 Brightline
photomultiplier tubes Hamamatsu R928
C/L variable-speed tubing pump Masterflex 77122-22
digital thermometer Comar Instruments 3501
Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser  Coherent N/A
Slidebook 6 software 3i N/A
Imaris 7.7 software Bitplane N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment. Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).
  2. Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G. Regeneration and repair in multiple sclerosis: the role of cell transplantation. Neurosci Lett. 456, (3), 101-106 (2009).
  3. Hatch, M. N., Schaumburg, C. S., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Endogenous remyelination is induced by transplant rejection in a viral model of multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 212, (1-2), 74-81 (2009).
  4. Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 187, (2), 254-265 (2004).
  5. Tirotta, E., Carbajal, K. S., Schaumburg, C. S., Whitman, L., Lane, T. E. Cell replacement therapies to promote remyelination in a viral model of demyelination. J Neuroimmunol. 224, (1-2), 101-107 (2010).
  6. Greenberg, M. L., et al. Two-photon imaging of remyelination of spinal cord axons by engrafted neural precursor cells in a viral model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (22), E2349-E2355 (2014).
  7. Whitman, L. M., Blanc, C. A., Schaumburg, C. S., Rowitch, D. H., Lane, T. E. Olig1 function is required for remyelination potential of transplanted neural progenitor cells in a model of viral-induced demyelination. Exp Neurol. 235, (1), 380-387 (2012).
  8. Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422, (6933), 688-694 (2003).
  9. Weinger, J. G., et al. MHC mismatch results in neural progenitor cell rejection following spinal cord transplantation in a model of viral-induced demyelination. Stem Cells. 30, (11), 2584-2595 (2012).
  10. Vogel, D. Y., et al. Macrophages in inflammatory multiple sclerosis lesions have an intermediate activation status. J Neuroinflammation. 10, 35 (2013).
  11. Coyle, P. K. Ch. 3. Clinical Neuroimmunology: Multiple Sclerosis and Related Disorders. Rizvi, S. A., Coyle, P. K. 3, Springer. 43-70 (2011).
  12. McManus, C., et al. MCP-1, MCP-2 and MCP-3 expression in multiple sclerosis lesions: an immunohistochemical and in situ hybridization study. J Neuroimmunol. 86, (1), 20-29 (1998).
  13. Calderon, T. M., et al. A role for CXCL12 (SDF-1alpha) in the pathogenesis of multiple sclerosis: regulation of CXCL12 expression in astrocytes by soluble myelin basic protein. J Neuroimmunol. 177, (1-2), 27-39 (2006).
  14. Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J Vis Exp. 53, e2834 (2011).
  15. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, (1), 41-51 (2000).
  16. Nguyen, Q. T., Callamaras, N., Hsieh, C., Parker, I. Construction of a two-photon microscope for video-rate Ca(2+) imaging. Cell Calcium. 30, (6), 383-393 (2001).
  17. Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat Med. 17, (4), 495-499 (2011).
  18. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. 82, e50826 (2013).
  19. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9, (3), 297-302 (2012).
  20. Pakan, J. M., McDermott, K. W. A method to investigate radial glia cell behavior using two-photon time-lapse microscopy in an ex vivo model of spinal cord development. Front Neuroanat. 8, 22 (2014).
  21. Fenrich, K. K., et al. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. J Physiol. 590, (Pt 16), 3665-3675 (2012).
  22. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336, 1676-1681 (2012).
  23. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, (6089), 1869-1873 (2002).
  24. Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Curr Protoc Cytom. Chapter 12, (Unit12 26), (2012).
  25. Matheu, M. P., et al. Toll-like receptor 4-activated B cells out-compete Toll-like receptor 9-activated B cells to establish peripheral immunological tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (20), E1258-E1266 (2012).
  26. Matheu, M. P., et al. Three phases of CD8 T cell response in the lung following H1N1 influenza infection and sphingosine 1 phosphate agonist therapy. PLoS One. 8, (3), e58033 (2013).
To-foton Imaging av Cellular Dynamics i Mouse Spinal Cord
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weinger, J. G., Greenberg, M. L., Matheu, M. P., Parker, I., Walsh, C. M., Lane, T. E., Cahalan, M. D. Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord. J. Vis. Exp. (96), e52580, doi:10.3791/52580 (2015).More

Weinger, J. G., Greenberg, M. L., Matheu, M. P., Parker, I., Walsh, C. M., Lane, T. E., Cahalan, M. D. Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord. J. Vis. Exp. (96), e52580, doi:10.3791/52580 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter